Ensaio de ramificação de glicogênio para medir o grau de ramificação de glicogênio

1. Avaliação qualitativa da ramificação do glicogênio

1. Prepare a solução saturada de cloreto de cálcio adicionando 74,5 g de cloreto de cálcio anidro a ~ 40 mL de água e mexendo. Adicione um pouco mais de água e continue mexendo. Faça o volume até 100 mL com água e continue mexendo até que o CaCl₂ esteja totalmente dissolvido.
2. Prepare um estoque de trabalho de reagente de cor de iodo / CaCl₂ misturando 50 μL de solução de estoque de KI / iodo com 13 mL de solução saturada de CaCl₂ em um tubo de 15 mL. Misturar bem e conservar a 4 °C, ao abrigo da luz. A solução é estável por pelo menos 1 semana nessas condições.
3. Determinação da ramificação
   1. Em um tubo de 1,5 mL, combine 650 μL de estoque de reagente de cor iodo/CaCl₂ com 100 μL de água e misture bem. Transferir a solução para uma cubeta descartável de metacrilato.
      nota: A solução na cubeta deve ser clara e de cor amarelo pálido.
   2. Colocar no espectrofotómetro e, funcionando em modo de varrimento do comprimento de onda, recolher um espectro de fundo de 330 nm a 800 nm.
   3. Em um tubo de 1,5 mL, combine 650 μL de iodo de trabalho / CaCl₂ reagente de cor com 50 μg de glicogênio de ostra. Traga o volume final para 750 μL com água e misture bem. Transferir a solução para uma cubeta descartável de metacrilato.
      nota: A solução na cubeta deve ser límpida e de cor laranja/marrom profunda.
4. Colocar no espectrofotómetro e recolher um espectro de absorção de 330 nm a 800 nm.
5. Repita as etapas 1.3.3 a 1.4 com 50 μg de amilopectina e 30 μg de amilose.
   nota: A amostra de amilopectina deve ser amarela/verde e a amostra de amilose deve ser verde/azul. Ambas as amostras devem ser claras. Os complexos coloridos formados são estáveis, sem alteração no espectro de absorção, por pelo menos 1 h à temperatura ambiente.
6. Para obter uma indicação da estrutura ramificada de uma amostra de glicogênio não caracterizada, combine 25 μg a 50 μg de glicogênio com 650 μL de iodo de trabalho / reagente de cor CaCl₂. Proceda como acima, elevando o volume para 750 μL com água, misturando bem e transferindo para uma cubeta de metacrilato.
   nota: A amostra de glicogênio deve produzir uma cor amarela / laranja a laranja / marrom, dependendo do grau de ramificação (comprimento das cadeias externas) do glicogênio presente. Novamente, a amostra deve ser clara.
7. Colete o espectro de absorção.