Dot Blot de 5-metilcitosina para determinar a extensão da metilação do DNA

1. Coleta de tecido da cartilagem articular humana e cultura de condrócitos

1. Preparação de materiais
   1. Prepare o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. Prepare 1 mg / mL de colagenase II, tripsina-EDTA a 0,25%, solução salina tamponada com fosfato (PBS) e um filtro de células (40 μm de náilon).
2. Coleção de tecido de cartilagem articular humana
   1. Isole a cartilagem articular das articulações do joelho de pacientes doadores após trauma. Obtenha o consentimento informado de todos os participantes.
   2. Corte a cartilagem em pedaços de 1-2 mm³ usando um bisturi estéril e digerir os condrócitos da cartilagem picada com 1 mg / mL de colagenase II em DMEM a 37 ° C por 12-16 h.
   3. Filtrar a suspensão celular resultante através de um filtro de células (40 μm) e lavar duas vezes com PBS.
   4. Conte as células com um hemocitômetro e semeie a uma densidade de 20.000-30.000 células/^cm2 em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina.
   5. Cultura em incubadora a 37 °C.
3. Expansão de condrócitos monocamada
   1. Colha células subconfluentes usando 0,25% de tripsina-EDTA e recoloque a placa a uma densidade de 6.600 células/cm². Troque o meio duas vezes por semana.
   2. Cultive condrócitos em monocamadas por até seis passagens e avalie nas passagens 1, 2, 3, 4 e 5.

2. Extração de DNA genômico (gDNA)

1. Colete as células e ressuspenda em tampão de lise de 500 μL (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 μg / mL RNase A) por 10 milhões de células. Ressuspender as células por pipetagem e inversão rápida e, em seguida, incubar durante 1 h a 37 °C.
2. Adicionar a proteinase K a uma concentração de 160 μg/ml de lisado celular e inverter vigorosamente a mistura. Incubar 6 h a 55 °C.
3. Adicionar um volume de Tris pH 7,9 fenol:clorofórmio:álcool isoamílico saturado (25:24:1) à amostra. Vortex ou agite bem a amostra com a mão por aproximadamente 20 s.
4. Centrifugue a amostra em temperatura ambiente por 5 min a 13.000 × g. Remover a fase aquosa superior e transferir a camada para um tubo novo.
5. Extrair com igual volume de clorofórmio para eliminar o fenol e transferir a fase aquosa superior para um tubo fresco.
6. Precipite o DNA adicionando 0,1 volume de amostra de acetato de sódio 3 M pH 8,0 e 2 volumes de etanol 100%.
7. Armazene o tubo a -20 °C durante a noite para precipitar o gDNA.
8. Centrifugue a amostra a 4 °C por 10 min a 16.000 x g para granular gDNA.
9. Lave a amostra três vezes com etanol a 70% e centrifugue a 4 °C por 2 min a 13.000 x g.
10. Remova o sobrenadante com cuidado e seque ao ar. Ressuspenda o DNA em 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA.

3. Perfil de metilação do DNA

1. Use um kit de metilação de DNA para realizar a reação de conversão de bissulfito usando um total de 500 ng do DNA genômico, de acordo com o protocolo do fabricante. Eluir em 10 μL de tampão de eluição (50 ng/μL).
2. Realize o perfil de metilação do DNA usando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante.

4. Análise de Dot Blot

1. Desnaturar o DNA isolado (1 mg por amostra) em NaOH 0,1 M por 10 min a 95 ° C. Neutralizar o DNA com 1 M NH₄OAc em gelo e, em seguida, diluir duas vezes. Localize 2 μL do DNA genômico diluído em série em uma membrana N ⁺.
2. Seque a membrana a 80 °C durante 30 min.
3. Bloqueie os locais de ligação de anticorpos não específicos embebendo a membrana N⁺ em 5% de BSA em TBS-T por 1 h. Use uma placa de Petri de 10 cm como câmara de reação à temperatura ambiente.
4. Após lavar 5 min três vezes em TBST, incubar a membrana com um anticorpo monoclonal anti-5-metilcitosina (5-mC) de camundongo (1:1.000) em TBS-T a 4 °C durante a noite.
5. Lave a membrana por 5 min três vezes em TBS-T e, em seguida, incube com um anticorpo secundário, imunoglobulina-G (IgG) de ovelha conjugada com HRP (1:5.000) em TBS-T por 1 h em temperatura ambiente.
6. Lave a membrana por 5 min três vezes em TBS-T.
7. Adicione o substrato enzimático à membrana e incube por 5-10 min. Visualize o sinal secundário do anticorpo usando um kit de quimioluminescência de acordo com as instruções do fabricante.