Isolamento da microglia do córtex de um cérebro de camundongo adulto

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Dissociação Mecânica do Tecido

NOTA: Mantenha as células e os reagentes frios o tempo todo, exceto durante as etapas de coloração. Esta etapa deve levar ~ 30 min.

1. Pique cada tecido cerebral com uma lâmina de barbear em <1 mm³ pedaços finos.
2. Use 1 mL de pipeta (com as pontas cortadas) para transferir pedaços de tecido para os homogeneizadores Dounce pré-resfriados, cada um contendo 2 mL de meio A com inibidor de DNase e RNase.
3. Homogeneizar o tecido girando lentamente o pistão para dentro e para fora do homogeneizador Dounce por 6 a 10 movimentos completos até que nenhum pedaço visível esteja presente.
   nota: Douncing mata neurônios e a maioria das outras células gliais, mas deixa as células microgliais bastante intactas. Tanto a duplicação insuficiente quanto a duplicação excessiva podem levar a um baixo rendimento de células.
4. Transfira os tecidos dissociados para tubos de 50 mL através de filtros de 70 μm.
5. Enxágue cada homogeneizador Dounce e pistão com um total de 6 mL de meio frio A e filtre a solução de enxágue através do mesmo filtro no tubo correspondente.
6. Transferir as suspensões monocelulares (cerca de 8 ml cada) para tubos cónicos de 15 ml e centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C com travão = 5.

2. Remoção de mielina

NOTA: Esta etapa deve levar ~60 min.

1. Prepare 1 coluna de depleção grande (LD) (para o córtex) e 3 colunas de seleção grande (LS) (para as outras 3 regiões) em um separador magnético (Tabela de Materiais). Enxágue cada coluna com 3 mL de tampão MCS.
2. Uma vez terminada a centrifugação, pipetar e rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Para os tecidos do córtex e do cerebelo, ressuspenda as células em 850 μL de tampão MCS com 1,8 μL de inibidor de RNase. Para tecidos do hipocampo e estriado, ressuspenda as células em 400 μL de tampão MCS com 0,9 μL de inibidor de RNase.
   nota: As colunas (LD vs. LS) e o volume usado para ressuspensão são otimizados com base na quantidade de mielina presente no tecido. Se outras regiões do cérebro forem testadas, essas condições podem precisar ser ajustadas dependendo do tamanho do tecido e da quantidade de mielina que pode existir. A eficácia da remoção da mielina pode ser estimada na etapa 2.9.
3. Adicione 100 μL de grânulos de remoção de mielina em células do córtex e do cerebelo e adicione 50 μL de grânulos de remoção de mielina em células do hipocampo e do estriado.
4. Misture delicadamente as células com grânulos e incube os tubos no gelo por 10 min.
5. Traga o volume do tubo com células corticais para 2 mL com tampão MCS e todos os outros para 1 mL (ou seja, adicione 1 mL para células corticais; 500 μL para células do hipocampo e estriado; não há necessidade de adicionar tampão às células cerebelares).
6. Quando as colunas estiverem vazias de tampão de enxágue, coloque um tubo de 15 mL abaixo de cada coluna. Carregue as células corticais (2 mL) na coluna LD e todas as outras (1 mL cada) nas colunas LS. Use imediatamente 1 mL de tampão MCS para lavar os tubos originais e carregue a solução nas colunas correspondentes.
7. Lave a coluna LD uma vez com 1 mL de tampão MCS e lave cada coluna LS duas vezes com 1 mL de tampão MCS a cada lavagem. Continue a coletar a solução de fluxo durante a lavagem.