Gerando explante de gânglio da raiz dorsal e cultura de células dissociadas

1. Cultura de explante de DRG de camundongo adulto

1. Coloque o DRG coletado em uma placa de Petri de 35 mm contendo 3 mL de meio sem soro gelado (SFM).
2. Transfira cada DRG individual em uma placa de Petri de vidro seco e, sob um microscópio cirúrgico, limpe e corte o excesso de fibras e tecido conjuntivo ainda preso ao DRG usando uma lâmina. O DRG é facilmente identificável como uma estrutura transparente e protuberante ao longo do nervo/raiz espinhal branca. Os vasos sanguíneos geralmente são encontrados ao redor do DRG.
3. Coloque o DRG limpo em uma nova placa de Petri contendo meio SFM gelado.
4. Dilua a mistura de proteínas gelatinosas (consulte a Tabela de Materiais) em SFM gelado (1:1).
5. Coloque o DRG ex vivo em placas de 12 poços pré-revestidas com 10/20 μL de mistura de proteínas gelatinosas e coloque-as dentro da incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por 30-60 min.
6. Adicione suavemente 1,5-2 mL de SFM ao sistema de cultura para cobrir todo o explante e manter os explantes em condições de cultura (37 °C e 5% de CO2).
   nota: Esta é uma etapa crítica porque o DRG é ancorado aos pratos de vidro apenas pela mistura de proteínas gelatinosas polimerizadas. O tempo de polimerização e as habilidades de pipetagem são essenciais para evitar a flutuação.
7. Altere o meio de cultivo do DRG a cada 72 horas e deixe o DRG crescer pelo tempo que for necessário.

2. Isolando neurônios de célula única do DRG

1. Coloque todo o DRG coletado em um tubo estéril de 1,5 mL com 1,2 mL de meio F12 contendo 1,25 mg / mL de colagenase IV e incube-o a 37 ° C e 5% de CO2 por 45 min. Repita esta etapa por mais 45 min após a primeira incubação.
2. Trate os explantes com 2 mL de meio F12 contendo tripsina (0,025%) por 30 min imediatamente após o tratamento com colagenase IV a 37 ° C e 5% de CO2.
3. Incubar com 2 mL de meio F12 contendo soro fetal bovino (FBS; 33%) a 37 °C e 5% de CO2 por 15 min.
4. Lave os explantes três vezes com 2 mL de meio F12 e proceda a dissociá-los mecanicamente com uma pipeta de vidro até que o meio fique turvo.
   nota: Este procedimento envolve a coleta de DRG limpo/aparado do animal, conforme explicado na seção anterior. Ao realizar a dissociação mecânica de explantes, seja gentil e não use força excessiva, pois isso pode levar ao derramamento e perda de material de trabalho.
5. Filtrar a cultura de células dissociadas através de um filtro de 0,22 μm para remover quaisquer impurezas e excesso de tecido conjuntivo. Centrifugue o lisado de células filtradas a (2.500 x g) por 2 min.
6. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 500 μL de meio neurobasal contendo suplemento para cultura neuronal (1x), mistura de antibióticos (1x), L-glutamato (0,5 mM) e fator de crescimento nervoso (5 μg / mL) (ver Tabela de Materiais).
7. Colocar as células dissociadas em lâminas de cobertura revestidas com laminina (50 μg/ml; ver Tabela de Materiais) com uma densidade celular preferida. Determine a densidade celular usando um contador de células.
   nota: Plaqueamos as células em 25.000 células / lâmina de cobertura. Esta técnica permite a dissociação de neurônios e células satélites gliais. O componente glial co-cultivado com os neurônios pseudounipolares desempenha um papel crítico na sobrevivência neuronal.