Registro in vitro de oscilações no hipocampo de camundongos

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.                                                                                      

1. Preparação Aguda do Hipocampo In Vitro

NOTA: Isolar a preparação do hipocampo intacto envolve três etapas principais: (1) Preparação de soluções e equipamentos, (2) Dissecção do hipocampo e (3) Configuração do sistema de taxa de perfusão rápida necessário para a geração de oscilações intrínsecas. Neste protocolo, a realização oportuna de procedimentos – desde a dissecção até o registro – é particularmente importante porque o hipocampo isolado constitui uma preparação tão densa, mas delicada, que a manutenção da conectividade funcional da estrutura in vitro requer muito cuidado. Preparar tudo com antecedência garante que um nível adequado de perfusão esteja disponível o mais cedo possível para minimizar os danos celulares e manter a função fisiológica.

1. Solução artificial de líquido cefalorraquidiano (aCSF) à base de sacarose
   1. Prepare 1X solução de sacarose estoque para ser usada para dissecção e incubação pós-dissecação. Combine todos os componentes listados na Tabela 1, exceto CaCl₂, em 1 L de água deionizada e armazene a 4 ° C por até 2 semanas.
2. Solução padrão de aCSF
   1. Prepare o aCSF padrão para perfusão de alta taxa de fluxo do hipocampo isolado durante os registros eletrofisiológicos. Para fazer o estoque concentrado (5X) aCSF, dissolva todos os componentes listados na Tabela 2, exceto CaCl₂, em 2 L de água deionizada e armazene a 4 ° C.
3. Prepare o equipamento
   1. Antes de iniciar a dissecção, configure a área da bancada com uma bandeja plástica cheia de gelo (30 x 20 x 5 cm), linhas de tubos conectadas a carboidratos e três placas de Petri de vidro (10 x 2 cm) (ver Figura 1).
   2. Adicione 300 mL de solução de sacarose (estoque 1X) a um béquer de 500 mL, borbulhe com carbogênio (95% O₂, 5% CO₂) e adicione Ca₂+ [1,2 mM].
   3. Transfira 60 mL desta solução de sacarose para uma placa de Petri de vidro e deixe em temperatura ambiente. Coloque o restante em um freezer a 4 °C por 10 - 15 min.
   4. Borbulhe a solução de sacarose gelada com carbogênio durante toda a dissecação.
   5. Encher uma segunda placa de Petri (câmara de retenção fria) com solução de sacarose (4 °C) e mantê-la no gelo.
   6. Adicione 30 mL de solução de sacarose gelada a um béquer de 50 mL.

2. Dissecção de todo o hipocampo

NOTA: O método de dissecação do hipocampo isolado é essencialmente idêntico ao desenvolvido e descrito originalmente, mas com detalhes adicionais e alterações em relação à taxa de perfusão e técnicas de registro.

1. Dissecção cerebral
   1. Anestesiar o camundongo sob uma hotte com uma pequena toalha de papel embebida em 1 mL de isoflurano (100%) que é adicionado à gaiola.
   2. Decapite o camundongo anestesiado e mergulhe rapidamente a cabeça em solução de sacarose gelada (béquer de 50 mL, ~ 5 s). Transfira para uma toalha de papel.
   3. Use um bisturi para fazer uma incisão medial na pele (caudal a rostral) e empurre a pele nas laterais para expor o crânio.
   4. Corte o crânio com uma pequena tesoura e use uma espátula para extrair rapidamente o cérebro e soltá-lo na placa de Petri contendo solução de sacarose gelada. Aguarde 1-2 minutos para o cérebro esfriar.
   5. Enquanto o cérebro está se recuperando, adicione 2 a 3 mL de solução de sacarose em uma placa de Petri (dissecação) coberta com papel de lente no gelo.
2. Isolando o hipocampo
   1. Coloque o cérebro na placa de dissecação na posição vertical.
   2. Remova o cerebelo e o córtex frontal com uma lâmina de barbear. Corte o cérebro ao meio ao longo do plano sagital médio e retorne os dois hemisférios isolados para a câmara de retenção. Aguarde mais 1 a 2 minutos para recuperação.
   3. Coloque um único cérebro hemisseccionado na posição vertical na placa de dissecação.
   4. Gire o prato até que as estruturas sagitais medianas fiquem voltadas para o observador e o contorno incorporado do complexo septal seja visível como uma fina camada de tecido em forma de pêra anterior ao tálamo.
   5. Mantenha o cérebro hemisseccionado firme com a microespátula e coloque a extremidade menor da espátula revestida com politetrafluoretileno (PTFE) imediatamente atrás (caudal) da área septal.
   6. Insira a espátula revestida abaixo do septo e mova a ponta para baixo até atingir o prato de dissecação. Corte as fibras que conectam a área septal caudalmente. Repita a mesma operação ao longo da borda anterior do septo e corte as fibras que se conectam à parte frontal do cérebro.
   7. Com a espátula segurando levemente a parte interna do córtex logo acima do hipocampo na posição vertical, use a microespátula para puxar cuidadosamente para baixo os núcleos talâmicos, hipotalâmicos e restantes do tronco cerebral. Em seguida, use a espátula para cortar e remover o tecido puxado.
   8. Vire o hemisfério isolado de lado e identifique o contorno do hipocampo.
   9. Insira a espátula revestida no ventrículo lateral abaixo da extremidade rostral do hipocampo dorsal.
   10. Segure a espátula alinhada horizontalmente com o plano sagital médio do cérebro hemisseccionado e deslize-a pelo contorno suave das paredes ventriculares até que a ponta surja caudalmente.
   11. Segure a espátula sob o hipocampo e pressione-a levemente nas fibras de conexão ao longo da camada interna, onde o hipocampo se une ao córtex sobrejacente. Aplique a microespátula no lado externo desta camada e deslize contra a espátula revestida para cortar as fibras de conexão.
   12. Para completar a extração, gire a placa de dissecção e insira a espátula revestida sob o hipocampo ventral. Segure levemente o interior da prega cortical com a espátula e corte as conexões entorrinais usando um movimento de corte contra a microespátula.
       nota: Todo o complexo septo-hipocampal pode ser removido colocando a espátula revestida sob todo o hipocampo e retirando o tecido cerebral restante por baixo.
   13. Quando o isolamento estiver completo, mantenha o hipocampo apoiado no prato e adicione uma gota de solução de sacarose gelada para mantê-lo fresco. Corte cuidadosamente qualquer córtex e fibras restantes e separe o hipocampo do septo aplicando suavemente uma lâmina de barbear através do fórnix.
       nota: Se as gravações de patch clamp forem realizadas a partir de células piramidais, o hipocampo isolado pode ser cortado transversalmente em um ângulo de 45° para expor a camada piramidal de Cornu Ammonis (CA)1 (preparação "angle-cut") sem comprometer o circuito de rede local na porção restante do hipocampo.
   14. Transfira a preparação para uma solução de sacarose à temperatura ambiente e deixe-a recuperar durante 15 a 30 minutos antes de transferir para a câmara de registo.

3. Configure a perfusão rápida para registrar o hipocampo isolado

1. Configure o sistema de perfusão alimentado por gravidade para permitir o influxo contínuo de alta velocidade de aCSF oxigenado a 20 - 25 mL / min.
   1. Preparar previamente os frascos de aCSF (1X) e mergulhá-los num banho de aquecimento (~30 °C) pelo menos 15 minutos antes do início da experiência. Ligue o sistema de aquecimento de solução em linha (30 °C).
   2. Use borbulhadores de aquário e linhas de tubulação conectadas a um tanque de carbogênio para oxigenar o aCSF durante todo o experimento e adicione CaCl₂ [2 mM] antes do início da perfusão.
   3. Pare o fluxo de aCSF e transfira o hipocampo para a câmara de registro usando a extremidade larga de uma pipeta de vidro. Deixe a preparação saturada de sacarose afundar e assentar no fundo.
   4. Coloque a preparação no centro da câmara de registro (alinhada com o eixo de entrada-saída) com a superfície lisa de CA1 e SUB na parte superior.
   5. Estabilize o hipocampo com pequenos pesos nas extremidades septal e temporal e reinicie o fluxo do LCR.

4. Eletrofisiologia no Hipocampo Isolado

1. Registro extracelular de oscilações hipocampais in vitro
   1. Para monitoramento extracelular do Potencial de Campo Local (LFP) ou atividade de unidade única do hipocampo isolado in vitro, use micropipetas de vidro (1 - 3 MΩ) preenchidas com aCSF. Grave sinais de potencial de campo acoplados a CA de baixo ruído com um amplificador patch clamp de ganho x1000, filtragem passa-banda on-line de 0,1 a 500 Hz e uma taxa de amostragem de 5 a 20 kHz.
      nota: O microscópio personalizado usado neste protocolo é equipado com objetivas de baixa (2,5X) e alta ampliação (40X) para uma visão de baixa ampliação do hipocampo, bem como microscopia de vídeo infravermelho e epifluorescência para reconhecimento de célula única. Os componentes deste sistema incluem o microscópio de fluorescência vertical, cubos de filtro de fluorescência, uma câmera de vídeo analógica e um frame grabber digital com software de imagem, uma câmara de perfusão personalizada no palco (Figura 2A, inserção i) e micromanipuladores de alta precisão para gravações neuronais e colocação de fibra óptica.
   2. Use a câmera montada no microscópio e conectada a um monitor de computador para inspecionar a preparação do hipocampo sob baixa ampliação (2.5X) e verifique rapidamente se não há rebaixos ou danos à superfície externa. O arranjo diagonalmente orientado das fibras alvéolas ao longo da superfície lisa de CA1 deve ser visível (Figura 2A, inserção ii) quando a luz transmitida através do hipocampo.
   3. Use a objetiva de campo amplo de baixa ampliação para visualizar o hipocampo isolado e a colocação de eletrodos LFP em locais de gravação específicos.
      nota: Um layout da preparação isolada do hipocampo com vários eletrodos colocados em diferentes locais de registro é ilustrado na Figura 2A.
   4. Abaixe um eletrodo LFP no banho até que ele toque a superfície (alveus) da área CA1.
      nota: Isso geralmente produz um transiente rápido na gravação acoplada a CA, semelhante ao que acontece quando o eletrodo entra em contato com a mídia de gravação. Um monitor de áudio pode ser útil para ouvir o sinal do canal LFP após esta etapa.
      nota: Freqüentemente, os primeiros sinais de atividade só aparecem após 10 a 15 minutos, por isso é importante não avançar rapidamente na preparação. Se após esse período, o eletrodo LFP de superfície ainda não estiver captando atividade, avance um pouco mais para baixo no estrato oriens e faça uma pausa periodicamente para ver se surge alguma forma de atividade ao se aproximar da camada celular principal. Se nada for detectado após mais 5 a 10 minutos, retraia cuidadosamente o eletrodo e coloque-o em outro lugar ao longo da mesma região.
   5. Avance o eletrodo LFP através da camada piramidal. Observe que a atividade de pico extracelular aumenta inicialmente à medida que a descarga de uma única unidade de neurônios individuais (principalmente células piramidais e inibitórias) é detectada. Abaixe ainda mais o eletrodo e observe que o pico começa a desaparecer novamente à medida que a ponta cruza o radiato. Observe que uma oscilação de rede claramente visível na faixa de frequência (4 - 12 Hz) torna-se aparente e atinge a amplitude máxima (~ 100 - 300 μV) à medida que o local de gravação é abaixado através do radiato.
2. Oscilações em uma única região
   1. Para testar as propriedades espaciais das oscilações espontâneas na região CA1, coloque a ponta de um eletrodo LFP de referência em um local CA1 medial (localizado medialmente ao longo do eixo septo-temporal longitudinal) e abaixe-o no radiato conforme descrito anteriormente.
   2. Coloque um segundo eletrodo LFP em um local CA1 (200 - 800 μm septal ou temporal a partir do primeiro LFP) e observe que as oscilações de CA1 podem ser sincronizadas em distâncias relativamente grandes.
3. Oscilações entre camadas
   1. Para testar as propriedades das oscilações nas camadas do hipocampo, deixe um eletrodo LFP de referência em um local de radiato CA1. Começando logo acima do estrato oriens, abaixe um segundo eletrodo na camada de células piramidais e através do radiato. Observe uma inversão gradual do sinal LFP (reversão de fase relativa) através da camada piramidal.
      nota: Para exemplos representativos desses tipos de atividade, consulte a Figura 2B. Exemplos de perfis laminares / de profundidade e análise de densidade de fonte de corrente (CSD) ilustrando o local de reversão de fase em hipocampos isolados foram publicados anteriormente.

Tabela 1.

Tabela 2.

Figura 1: Procedimento de dissecção para a preparação isolada do hipocampo intacto.

(a) Vista geral da configuração da dissecação. Em cima à direita: balão de solução de sacarose gelada carbogenada (1); canto inferior esquerdo: bandeja plástica cheia de gelo (2) segurando o prato de dissecção coberto com papel para lentes (3); A câmara de retenção fria contendo a solução de sacarose (4); e um conjunto de ferramentas cirúrgicas (5). (b) Vista do cérebro do camundongo antes da hemissecção na placa de dissecação. (c) Recuperação do cérebro hemisseccionado na câmara de retenção fria e visão ampliada (inserção) do hemisfério esquerdo do cérebro antes de inserir a extremidade menor da espátula revestida sob o septo. (d) Uma espátula revestida colocada sob o hipocampo isolado, ao longo da região CA1 / SUB, com o tecido cerebral restante é puxada por baixo.

Figura 2: Configuração da configuração para registro in vitro de oscilações da preparação do hipocampo intacto na câmara de gravação submersa.

(a) O hipocampo isolado é mostrado com um layout de regiões hipocampais e múltiplos eletrodos colocados em quatro locais de registro diferentes distribuídos septotemporalmente (indicados por asteriscos brancos). Na vista da plataforma da câmara de registro mostrada acima (inserção i), a entrada e a saída para o fluxo de perfusão rápida são indicadas por números (1, 2). Na imagem ampliada do hipocampo mostrada abaixo (inserção ii), um único eletrodo é colocado no CA1 sepetotemporal médio, e as fibras do alvério são facilmente visíveis, correndo diagonalmente em direção ao subículo. S: septal, T: temporal, f/fx: fímbria-fórnix. (b) Representação esquemática da organização das camadas CA1 com traços LFP representativos registrados simultaneamente do estrato oriens (cinza) e do estrato radiado (preto). Observe a fase invertida dos sinais entre as duas camadas. Alv: estrato alveus, PR: estrato piramidal, SR: estrato radiatum. SLM: Estrato Lacunoso Moleculare. (c) Exemplo de traço LFP mostrando oscilação espontânea registrada na área CA1 / SUB (segmento de 20 segundos) e segmentos expandidos de 2 segundos (abaixo) do sinal não filtrado; passa-banda filtrada para frequências (0,5 - 12 Hz); gama lenta (25 - 55 Hz); e gama rápida (125 - 250 Hz).