Induzindo Lesão Cerebral Traumática Penetrante em Moscas Drosophila Adultas

1. Traumatismo cranioencefálico penetrante (PTBI; Figura 1)

1. Classifique as moscas F1 recém-fechadas. Selecione machos jovens dentro de 6 h após a eclosão. Coloque esses machos em frascos limpos contendo comida, com 40 ou menos moscas por frasco.
   NOTA: Isso é mais facilmente realizado no meio da manhã, anestesiando moscas na almofada CO₂ } e identificando machos adultos que ainda têm mecônio (visível como uma mancha esverdeada escura através da parede abdominal) em suas entranhas.
2. Higienize os pinos Minutien (consulte Tabela de Materiais) por pelo menos 5 min, colocando ~ 100 pinos em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL cheio de etanol a 70%.
3. Higienize a almofada de CO₂ e um pincel borrifando etanol a 70% e seque com um lenço de papel limpo e sem fiapos. Assim que as ferramentas estiverem limpas e secas, transfira 40 ou menos machos F1 classificados de volta para a almofada limpa.
4. Separe os machos F1 em 2 grupos na almofada de mosca. Um grupo servirá como controle, moscas não feridas. O segundo grupo experimental será submetido ao PTBI.
5. Usando uma pinça, puxe 4-5 novos pinos Minutien para fora do tubo da microcentrífuga e coloque-os perto da borda da almofada CO₂. Sob o escopo de dissecação, escolha um pino Minutien reto com uma ponta afiada.
   NOTA: Usar um único pino Minutien para um experimento reduzirá a variabilidade. Reutilize pinos afiados. Coloque os pinos danificados ou rombos em um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mL contendo 70% de etanol para descarte seguro.
6. Se estiver trabalhando com moscas da cruz padrão, ligue a lâmpada de diodo emissor de luz (LED) do microscópio estéreo equipada com os filtros de excitação e emissão apropriados para a proteína de fluorescência verde (GFP). Isso permite excitação em 440-460 nM e permite a visualização de 500-560 nM.
   NOTA: Com este conjunto de lâmpadas e filtros, os corpos celulares do corpo do cogumelo ficarão fluorescentes em verde através da cutícula da cabeça (Figura 1C). Para moscas gêmeas permanentes ou moscas de outros genótipos, um iluminador de luz branca padrão para o microscópio estéreo pode ser usado para visualizar pontos de referência na cutícula da cabeça para direcionar a lesão ao corpo do cogumelo (Figura 1C).
7. Use a pinça para pegar e segurar o pino Minutien selecionado em uma mão (para pessoas destras, geralmente é a mão direita) e o pincel na outra mão (geralmente esquerda). Escolha uma mosca do grupo experimental e posicione a mosca de forma que você tenha uma visão dorsal da cápsula da cabeça com a cabeça da mosca à direita. Coloque a escova na parte anterior do tórax dorsal e empurre suavemente para baixo para estabilizar a mosca.
8. Aponte a ponta do alfinete Minutien para os corpos celulares do corpo do cogumelo no lado direito da cabeça e penetre na cápsula da cabeça. Se estiver usando pontos de referência, direcione a cutícula dorsal da cabeça entre os ocelos e a borda dorsal do olho (Figura 1).
9. Depois de completar a lesão, use o pincel para empurrar a cabeça para fora do pino Minutien suavemente.
10. Se estiver usando o cérebro para RNA-Seq ou qRT-PCR, faça uma segunda lesão no lado esquerdo da cabeça.
11. Repita as etapas 2.8-2.10 para ferir todas as moscas do grupo experimental.
12. Depois que todas as moscas forem feridas, coloque o controle e as moscas feridas em frascos separados e rotulados contendo alimentos. Coloque os frascos horizontalmente (ou seja, de lado) enquanto as moscas se recuperam da anestesia e durante o envelhecimento subsequente para evitar que as moscas fiquem presas na comida.
13. Coloque as moscas cruzadas padrão a 25 °C e as moscas gêmeas permanentes a 30 °C para envelhecer.
14. Para moscas com mais de 24 h, coloque-as em alimentos limpos a cada 1-2 dias.

Figura 1: Lesão cerebral traumática penetrante (PTBI) no cérebro central adulto de Drosophila. (A) Esquema do exterior de uma cabeça de mosca adulta. Esta é uma visão frontal. Assim, o lado direito do animal está à esquerda do espectador. (B) Esquema do interior da cabeça de uma Drosophila adulta com a trajetória da lesão indicada em cinza. Esta é uma visão posterior. Assim, nesta imagem e nas figuras subsequentes, o lado direito do cérebro está à direita. O PTBI cerebral central afeta várias estruturas cerebrais, incluindo o corpo do cogumelo (verde) e tecidos fora do cérebro, incluindo o corpo gordo (azul) e hemócitos (vermelho). CB = região central do cérebro. OL= região do lobo óptico. (C) Vista dorsal de uma cabeça adulta viva na qual os corpos dos cogumelos (pontas de setas) são marcados com uma proteína fluorescente verde (GFP). Este é o 'genótipo padrão' (consulte o texto para obter detalhes). O protocolo PTBI resulta de forma reprodutível em lesões nos corpos dos cogumelos.