Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por In Utero Eletroporação ou injeção estereotáxica Viral

Nota preliminar

A cirurgia deve ser realizada por pesquisadores treinados totalmente após a aprovação das autoridades locais para o bem-estar animal. Todas as precauções devem ser tomadas para minimizar a dor eo estresse causado ao animal, incluindo anestesia profunda, a administração de analgesia pós-operatória e, para operações que duram mais de 10 minutos, a aplicação de um lubrificante ocular para evitar a desidratação da córnea e cegueira. Ratinhos anestesiados deve ser mantido constantemente aquecido a 37 ° C até à recuperação completa e cada ferramenta cirúrgica e solução tem de ser estéril. Embora o uso de uma capa biológica não é estritamente necessário, o operador deve tomar todas as precauções razoáveis ​​para minimizar a possibilidade de infectar o animal durante a operação, vestindo um jaleco, máscara e luvas. Da mesma forma, cada passo sobre a geração e utilização de vírus deve ser autorizado e deve ser realizada em áreas S2 de acordo com os regulamentos das autoridades locais.Finalmente, uma descontaminação completa de todas as ferramentas e superfícies que poderiam ter estado em contacto com o vírus deve ser realizado de acordo com as práticas de instalações aprovadas de desinfecção (por HIV, limpando com 70% Et-OH e / ou autoclavagem).

Parte 1: Expansão do embrionário NSC

1. Em electroporação utero

1. Após a clonagem (isto é, os transgenes cdk4/cyclinD1) em PCMS-EGFP (Clontech) ou pDSV-mRFPnls vetores ^16, purificar os plasmídeos utilizando kit EndoFree e ressuspender em PBS estéril a uma concentração de 3-5 ug / uL. Logo antes da cirurgia, misturar os plasmídeos com FastGreen 0,05% em PBS a uma razão final de ca. 4:04:01 e centrifugar a mistura durante 2 min a 16000 xg para remover todo o precipitado.
2. Coloque a mistura de DNA em um vidro de borosilicato anteriormente puxado capilar. Parâmetros puxando usando um P-97 pipeta extrator são: tração: 200; vel: 140; tempo: 140. O calor é determinada por um teste de rampa e depende da especificaçãoific lote de capilares a ser utilizado. Montar o tubo capilar sobre o bocal do PicoPump que está perto do in utero eletroporação plataforma (Figura 1A) e, sob um microscópio estereoscópico, e dobrar a ponta nick-a no ponto de inflexão.
3. Esterilizar todos os instrumentos de cirurgia em uma conta de vidro seco esterilizador e profundamente anestesiar um rato grávida no dia 12-15 de gestação usando um vaporizador isoflurano. Colocar o animal na posição supina sobre uma plataforma de aquecimento regulado a 37 ° C e manter sob administração de isoflurano constante por meio de um cone de nariz.
4. Raspar a pele do abdómen, desinfectar, com tempos de Betaisodona múltiplas, eventualmente limpando em meio com 70% de etanol, e injectar a buprenorfina (diluído em PBS) por via subcutânea, a 0,1 mg / kg de concentração como preventivo analgésico. Com uma tesoura fina, fazer um corte longitudinal 2 centímetros da pele e, em seguida, a parede de base muscular para aceder à cavidade peritoneal. Dispense na ca cavidade peritoneal. 2ml de solução IUE (D-PBS contendo 100 U / ml de pen / strep) previamente aquecida a 37 ° C e manter a solução em um bloco de aquecimento.
5. Cobrir o rato com drap estéril contendo uma fenda a partir do qual os úteros serão removidos. Retrair a incisão com afastador de tungstênio, identificar o útero e puxe-o segurando-o com uma pinça entre embriões adjacentes (Figura 1B; esquerda) e finalmente colocá-lo para baixo no drap estéril. Durante toda a operação, lavar o útero com IUE solução para hidratar a cavidade do corpo e órgão e evitar a desidratação do animal.
6. Lidar com o útero cuidadosamente segurando-o entre o polegar eo indicador e rode um embrião até a sua cabeça é visível e orientada para o operador. Identificar os hemisférios telencefálicos e injetar um deles do lado dorso-lateral. Libertar 1-2 ul da solução de ADN, utilizando o interruptor de pé de um PicoPump até o ventrículo está delineada por FastGreen (Figura 1B; direita).
7. (Figura 1C) e entregar 6 impulsos de 30 V para 50 ms com 950 ms de intervalo entre cada pulso usando um electroporador de forma quadrada gerar campos eléctricos operados através de um pedal. Evite colocar os eletrodos perto da placenta, pois isso pode causar hemorragia e danos ao embrião.
8. Quando todos os embriões são injetadas e eletroporadas, coloque o útero de volta para a cavidade abdominal e fechar as paredes musculares com um fio de sutura sutura cada 3-4 mm. Os nós deve ser confortável para o músculo, mas não demasiado apertado para permitir que um pouco de inchaço do tecido. Finalmente, feche a pele sobrejacente usando clipes de metal. Desinfectar a pele com Betaisodona, retire o rato da máscara de isoflurano e transferi-lo em uma gaiola habitação quando totalmente acordado. Monitorizar a recuperação do rato até que o comportamento locomotor é normal.

2. Processamento da samsoas

1. Um ou mais dias após a electroporação, o sacrifício do rato, recolher os embriões e identificar aqueles correctamente electroporação usando um estereomicroscópio fluorescente (Figura 1D). Dissecar os cérebros em PBS gelado, e fixá-los durante a noite, em PFA a 4% (de paraformaldeído em tampão fosfato pH 7,4). Eventualmente, BrdU pode ser administrado antes sacrifício de acordo com diferentes paradigmas para investigar cinética do ciclo celular e proliferação celular ^3.
2. Os cérebros são então processados ​​para seccionamento e coloração imunológica para os vários marcadores de células gliais radiais, progenitores basais e neurónios (PAX6, nestina, Tbr2, Tbr1, TUJ1 etc), para avaliar o efeito dos transgenes funcionais no NSC-alvo e sua progénie que são identificado pela expressão do gene repórter co-electroporated.

Figura 1.Em eletroporação utero. (A) Representação esquemática de uma plataforma no útero eletroporação. (B) Desenhos mostrando o posicionamento do rato prenhe durante a cirurgia (direito) e a injecção da mistura de DNA / FastGreen (azul), no hemisfério telencefálica de um embrião de rato (à esquerda). (C) Esquema mostrando a colocação dos eléctrodos em contacto com as paredes do útero, com o ânodo (+) adjacente ao sítio de injecção (azul). As setas indicam a migração de DNA para o ânodo. (D) Imagem de um rato hr 24 embrião após a eletroporação com plasmídeos GFP no dia embrionário 13. A linha tracejada demarca o hemisfério telencefálico. Esquema em A modificado a partir Calegari et al., 2004 ^17.

Parte 2: Expansão do Adulto NSC

1. A produção de derivados de HIV-partículas virais

1. Dia 1: placa de 5 x 10 ⁶ 293T células numa cm 10prato com 8 ml de D-MEM contendo 10% de soro fetal inactivado pelo calor de bovino e 100 U / ml de pen / strep (meio de cultura). Usar 15 pratos para uma preparação viral e cultura durante a noite a 37 ° C, 5% CO _2.
2. Dia 2: para cada prato, dilua em 1 ml de D-MEM sem formatação de 5 ug de cada um dos três plasmídeos codificando para i) proteína de envelope VSVG (tipo vírus da estomatite vesicular G), ii), gag / pol (grupo antigénio específico / polimerase) e iii) uma construção policistrónica expressando os transgenes funcionais e repórter (ou seja, cdk4/cyclinD1/GFP) previamente clonado num vector de transferência do VIH-based (p6NST90) ^9. Misturar a solução com 1 ml de D-MEM contendo 45 ul de polietilenimina que tenha sido previamente dissolvido em PBS a 1 mg / ml de solução concentrada, e incuba-se durante 15-30 minutos à temperatura ambiente. Enquanto isso, remova a mídia a partir de células e adicionar 4 ml por prato de doce D-MEM contendo 15% de calor soro fetal bovino inactivado e 100 U / ml de pen / strep. Adicionar a m 2l da mistura de transfecção e cultura durante a noite.
3. Dia 3: adicionar 120 ul de 500 mM Na-butirato por prato para aumentar a expressão dos transgenes, misturar suavemente e cultura durante 6-8 horas após o qual substitui o meio de transfecção com 5 ml de meio de cultura.
4. Dia 4: recolhem-se os sobrenadantes (total ml ca. 70), passar através de um filtro de 0,22 ^ M e de transferência, em 2 tubos de centrífuga de polialómero (35 x 89 mm). Ultracentrífuga a 110.000 xg durante 90 min a 4 ° C utilizando um rotor oscilante. Rejeitar o sobrenadante, adicionar 6 mL de PBS a cada tubo e incubar em gelo durante 1 hr. Ressuspender o sedimento e transferi-lo para um tubo de centrífuga polialómero (14 x 95 mm). Ultracentrífuga a 110.000 xg durante 90 min a 4 ° C utilizando um rotor oscilante. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 50 ul de PBS, fazer alíquotas de 5 ul e armazenar a -80 ° C. Título virai irá estar no intervalo de 10 ⁸ -10 ⁹ cfu / ml. (Nota: os vírus são muito sensíveis à temperatura e armazenamento, avoID de recongelamento, manter em gelo seco durante o transporte e descongelar logo antes do uso.)

2. Injeção estereotáxica

1. Anestesiar um rato 6-10 semanas de idade com isoflurano e colocar o animal em decúbito ventral sobre uma estrutura estereotáxica (Figura 2A), utilizando as barras de orelha e o suporte paladar para fixar correctamente a cabeça. O animal é mantido quente sobre uma almofada de aquecimento regulado a 37 ° C e sob administração de isoflurano constante.
2. Injectar por via subcutânea 100 ml de solução buprenorfina trabalhando como preventivo analgésico, raspar uma faixa de pele sobre a cabeça do rato, e desinfectares como descrito em 1.4. Usando um bisturi, faça uma ca. 1,5 centímetros longa incisão longitudinal na pele, cabeça expor o crânio no nível da sutura sagital. Retrair a pele e limpe cuidadosamente a superfície do osso com um cotonete estéril.
3. Half-encher um copo capilar (especificações 1.2) com óleo de parafina e montá-lo na bomba injetora inserindoo capilar até ao segundo anel (Figura 2B). Mover o suporte do capilar no eixo x, y e z, até a ponta do capilar é posicionado sobre a bregma, o ponto de articulação entre as suturas sagital e lateral (Figura 2C) (a ser determinado com a ajuda de um estereomicroscópio), e re set-x, y, z e os valores para 0.
4. Mova o capilar de ± 1,6 mm no eixo médio-lateral (x) e -1,9 mm no eixo ântero-posterior (y) e marcar o osso usando uma caneta marcador cirúrgico. Fazer um buraco de ca. 0,5 mm de diâmetro sobre o crânio, usando um furador eléctrico prestar atenção para não danificar o cérebro.
5. Colocar uma gota de 5 ul de suspensão viral (uma aliquota) sobre um pedaço de parafilm colocada nas barras de ouvido e mergulhar a ponta do capilar na gota. Sugar ca. 3,5 ul de suspensão viral utilizando um injector nanolitro fixado em 55 nl / seg. Executar este passo rapidamente como a gotícula irá evaporar-se.
6. Mover o capilar para o local of injeção e movê-lo para baixo até a ponta toca a superfície pial. Redefinir o valor do eixo dorso-ventral (z) a 0. Neste ponto, penetram no tecido com o capilar para -1,9 mm e libertar 1,5 ul de suspensão virai a uma taxa de 4 nl / seg. Esperar durante 2-3 minutos, para minimizar o refluxo de suspensão viral através da pista capilar e, em seguida, retirar o tubo capilar. Uma segunda injecção pode ser realizada no hemisfério controlateral.
7. Sutura da pele, desinfectar, e permitir que o animal recuperar da anestesia, como descrito anteriormente para in utero de electroporação (1,8).

Figura 2. Injecção estereotáxica viral. (A e B) Representação esquemática dos componentes necessários para a realização da injecção estereotáxica (A) e um suporte de capilar desmontada mostrando a inserção de uma capillary até que o segundo anel (B). (C) Imagem da cabeça de rato imobilizada por as barras de suporte do ouvido e palato com a pele cortada para expor o crânio (à esquerda). A ampliação da caixa a tracejado (direita) mostra as suturas sagital e laterais, a bregma, e do local de injecção (círculo).

3. Processamento da amostra

1. Uma a três semanas após a infecção, perfundir o rato com ca. 100 ml de PFA 4%, dissecar o cérebro e pós-corrigi-lo durante a noite em PFA 4%. Eventualmente, BrdU e / ou tamoxifeno pode ser administrado antes do sacrifício de acordo com diferentes paradigmas para investigar cinética do ciclo celular e para interromper a expressão dos transgenes virais flanqueadas por locais loxP, respectivamente ^9.
2. O cérebro pode então ser processado para imunocoloração utilizando vários marcadores de células tronco e progenitoras e neurónios (eg Sox2, GFAP, nestina, Tbr2, doublecortin, etc).

1. No geral, em electroporação utero produz 60-80% de embriões electroporadas exibem forte expressão do gene repórter em uma ampla área do córtex lateral (Figura 3A). As proteínas fluorescentes pode ser facilmente detectado em embriões inteiros de montagem assim que 3-6 horas após a cirurgia, com o sinal de duração de mais de uma semana. Dentro da área de alvo, cerca de 30-50% de células normalmente expressam o transgene (s) com a proporção de células co-expressão de duas (ou mais) co-electroporadas transgenes sendo geralmente superior a 90% (Figura 3B, para a esquerda) 6,8 de 15. Embora um nível mínimo de apoptose (ca. 2,0-2,5%) pôde ser observada após cerca de 2 horas a partir de electroporação, este valor irá retornar para níveis fisiológicos (0,5-1,0% ca.) após cerca de 6 horas (FC, dados não publicados). A proporção de embriões ou camundongos prenhes morrer devido a cirurgia é geralmente insignificante (<5%). Co-electroporação com cdk4/cyclinD1 sob estas condições, seguido por 48 horas de desenvolvimento desencadeia um aumento na expansão de células progenitoras neurais em 30% (Figura 3B, para a direita, e C) 15.

Figura 3. Expansão de células progenitoras neurais por cdk4/cyclinD1 superexpressão. (A) imagem de fluorescência de uma secção através da cortical lateral de um embrião de rato 24 horas após a electroporação com GFP e RFP plasmídeos no dia embrionário 13. (B) as imagens fluorescentes como em A 48 horas após a co-electroporação com cdk4/GFP e cyclinD1/RFP plasmídeos e imunomarcação para o marcador de células progenitoras Tbr2 basal. Repórteres fluorescentes com DAPI counterstainig (esquerda) e Tbr2 (direita) são mostrados. Linhas indica a superfície apical da zona ventricular (VZ; linha branca) e os limites da zona subventricular (SVZ; amarelos linhas tracejadas). Observe o aumento thickness da SVZ na porção electroporated do córtex (pontas de seta brancas), devido a um aumento da geração e da expansão de células progenitoras basais após sobre-expressão de cdk4/cyclinD1. (C) A quantificação do efeito mostrado na B. Barras = SD, p <0,05, n = 3. Gráfico de barras em C é retirado de Lange et al., 2009 15.

1. Após a injeção estereotáxica viral, ca. 80% dos ratos operados exibir forte expressão dos transgenes em todo o giro denteado todo. A expressão constitutiva de GFP pode ser facilmente detectado em 40 secções uM logo que 4 dias após a cirurgia. Ao longo do eixo rostral-caudal para o giro denteado, cerca de 10-30% de células (equivalente a um total de cerca de 10,000-30,000. Células) normalmente expressam o transgene (s) (Figura 4A) 9. A proporção de ratos que morrem devido a cirurgia é insignificante (<5%). Três semanas a superexpressão de cdk4/cyclinD1 sob estas condições provoca um aumento no NSC por mais de doisdobras (Figura 4B), enquanto que diminuindo a neurogénese em 70% (Figura 4C) 9.

Figura 4. Efeitos da infecção viral. (A) reconstrução 3D de 7 imagens de fluorescência tomadas a partir de 40 um de espessura de série secções coronais (1 a cada recolha de 6) ao longo do eixo rostral-caudal para o hipocampo. GFP + células infectadas (verde) e DAPI coloração nuclear (azul) do giro denteado são mostrados (superior). Brilhantes imagens de campo dos cortes coronais correspondentes aos mostrados em A (meio) e representação em 3D (fundo) de todo o hemisfério cerebral com o hipocampo em destaque na verde pseudo (modificado a partir do Cérebro Allen Atlas; www.brain-map.org ) . Setas brancas apontar o local da injecção. Lateral (L), rostral (R), e dorSal (D) eixos (x, y, e z coordenadas estereotáxicas) são indicados (direita). (B e C) Proporção de nestina + NSC (B) e DCX + neurônios (C) dentro da população de células infectadas GFP + 3 semanas após a injeção estereotáxica de GFP (branco) ou cdk4/cyclinD1/GFP (preto) vírus. Bares = SD, p <0,005, n = 3. Gráficos em B e C constante do Artegiani et al., 2011.

BA e FC apresentaram um pedido de patente que descreve a expansão condicional de células-tronco adultas somáticas por cdk4/cyclinD1 vírus (PE 10.160.288,6).