Isolar células de melanócito-like primárias do coração mouse

Resumo

Neste protocolo, w e identificou um novo população de células de melanócito-like (também conhecido como melanócitos cardíacos) nos corações de ratos e humanos que contribuem para a arritmia atrial dispara em camundongos.

Resumo

Foi descoberta uma nova população de células de melanócitos tipo (também conhecido como melanócitos cardíaca) nos corações de ratos e seres humanos, que contribuem para os gatilhos de arritmias atriais em ratinhos. Para investigar as propriedades elétricas e biológicos de melanócitos cardíacos foi desenvolvido um procedimento para isolá-los do rato corações que nós derivados das destinadas a isolar cardiomiócitos murinos neonatais. A fim de obter melanócitos cardíacos saudáveis ​​adequados para mais extensa patch clamp ou estudos bioquímicos, foi desenvolvido um procedimento refinado para isolar e cultivar melanócitos cardíacos baseados naqueles originalmente projetado para isolar os melanócitos cutâneos. O procedimento refinado é demonstrado nesta revisão e produz um maior número de células de melanócito-like saudáveis ​​que pode ser banhado em uma população pura ou com cardiomiócitos.

Introdução

Nós recentemente identificada uma população de células romance no coração de camundongos e humanos que expressam enzimas melanina-síntese e morfologicamente se assemelham melanócitos cutâneos. Chamamos 'melanócitos cardíacos' essas células e descobrimos que eles estão presentes em locais anatômicos a partir do qual arritmia atrial desencadeia muitas vezes se originam em seres humanos. Encontramos também melanócitos cardíacos contribuir para arritmias atriais em camundongos com deleção da linhagem germinativa de Dct. Melanócitos cardíacas são escassamente distribuídos por todo o átrio do rato onde eles compreendem menos de 0,1% de todas as células atriais. Para investigar as propriedades elétricas e biológicos de melanócitos cardíacos foi desenvolvido um procedimento para isolá-los do coração mouse usando marcadores específicos de melanócitos Cre-induzida. Nosso procedimento inicial foi desenvolvido daqueles usados ​​para isolar cardiomiócitos murinos neonatais e rendeu um pequeno número de células adequadas para gravações de patch clamp ou análise de PCR. No entanto, para melhorar a curarº e viabilidade de melanócitos cardíacas, para mais aprofundada análise eletrofisiológica ou estudos bioquímicos, foi desenvolvido um procedimento refinado e as destinadas a isolar melanócitos cutâneos. O processo descrito e demonstrado neste teste tem a vantagem de produzir melanócitos cardíacas saudáveis, que podem ser plaqueadas como uma população pura ou com cardiomiócitos.

Protocolo

1 Preparar as soluções necessárias e Equipamentos

1. Primeiro, esterilizar os instrumentos cirúrgicos (pinças retas forma, fórceps, tesouras forma curva de forma reta, e tesouras forma curva) em autoclave por 15 min. a 121 ° C. Preparar dois conjuntos de instrumentos, onde um conjunto é usado para dissecar os corações e o outro conjunto irá ser utilizados para triturar o tecido.
2. Dissolve-se um pacote de meios de cultura MCDB153 em 900 ml de esterilizado, água filtrada e agita-se lentamente até que o pó esteja dissolvido. Adicionar 1,2 g de bicarbonato de sódio, ou de 15,7 ml de uma solução de bicarbonato de sódio [7,5% w / v], por cada litro de volume final de meio que está sendo preparada e agita-se até se dissolver. Ajustar o pH para 7,2 por adição de 1 N ou HCl ou NaOH 1 N, em seguida verter os meios de comunicação através de um filtro de topo de 0,2 um frasco sob condições estéreis num capuz de cultura de tecidos (cabine de segurança biológica). Em seguida, coletar o material e armazene-o a 4 ° C.
3. Prepare os suplementos paraadicionar ao meio de cultura (Lista de Materiais). Os suplementos devem ser adicionados ao meio antes de apenas meios de comunicação é necessária para o plaqueamento das células.
4. Prepare DPBS com FBS a 10% mais antibióticos (penicilina e estreptomicina).
5. Em seguida, preparar uma solução de tripsina a 0,25% por adição de 0,25 g de tripsina (de pâncreas de bovino, actividade> 2.500 unidades USP / mg, ultrapura; USB) a 100 ml de DPBS mais antibióticos (penicilina e estreptomicina).
6. Outros equipamentos necessários necessários para concluir este procedimento incluem um microscópio estereoscópico, placas de Petri (10 cm), tubos cônicos de 50 ml, filtros de células 40 mícrons, DPBS mais antibióticos, de 60 mm e placas de cultura de 35 mm placas de cultura.

2 Isolando Corações de Neonatais rato filhotes de cachorro

1. Em primeiro lugar, obter P0 para p2 de rato neonatal filhotes (n = 6 a 8). Recomenda-se usar os filhotes gerados por meio de cruzamento DCT-Cre fêmeas homozigotas com os machos que são heterozigotos para tanto o R26R: alelo EYFP ou o alelo Z / EG para rotular omelanócitos semelhante. Ambos R26R: EYFP e Z / EG ratinhos estão disponíveis a partir de Jackson Laboratories (números 006148 e 003920 banco, respectivamente).
2. Em seguida, a eutanásia os filhotes recém-nascidos de rato, limpe o peito com um algodão embebido em álcool e em seguida, coloque os filhotes em uma placa de Petri de 10 cm com DPBS.
3. Cortar a pele sobre o peito e esterno com pinça e tesouras esterilizadas e em seguida, abra o baú com cuidado sob microscópio estereoscópico. Os corações dos filhotes recém-nascidos de rato são muito pequenos por isso tome cuidado para se certificar de remover todo o coração com os átrios anexados.
4. Lave os corações em DPBS e transferi-los para um novo prato de 10 cm Petri.

3. digestão enzimática

1. Traga a placa de Petri com o coração excisadas para uma capa de cultura de tecidos (cabine de segurança biológica) e, em seguida, siga os passos abaixo usando técnicas estéreis na capa.
2. Em primeiro lugar, os corações lavar três vezes em DPBS estéril mais antibióticos.
3. Colocar os corações (n = 6-8) numa60 mm de placa de cultura e adicionar 6-8 mL de solução de tripsina a 0,5% para o prato.
4. Em seguida, o coração cortado em pedaços pequenos (menos de 1 mm de tamanho) e incubar a 37 ° C durante 30 min numa atmosfera de _CO2 a 5%.
5. Após o período de incubação estiver completa, despejar a solução resultante de tecido cardíaco e tripsina a partir do prato para um tubo de 50 ml estéril cónica.
6. Em seguida, usando uma pipeta estéril de 10 ml, rapidamente mas suavemente, tritura-se a solução no tubo de 50 mL cónico 30-50 vezes.
7. Filtra-se a solução resultante através de um filtro de células de 40 mícrons no início de um novo tubo cónico limpo de 50 ml e recolher o filtrado.
8. Em seguida, o tubo de centrifugação de 50 ml a 240 x g numa centrífuga de bancada durante 5 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento restante em 6-8 ml de DPBS estéril. Repita este passo mais duas vezes. Esta etapa pelotas miócitos atriais e melanócitos cardíacos, mas não derrubar a fifibroblastos desde os fibroblastos são menores e permanecerão no sobrenadante.

4. chapeamento Cardiac Melanócitos como células

1. Após a terceira lavagem, após a centrifugação, com cuidado drenar ou aspirar para fora da solução de lavagem (DPBS) e ressuspender o sedimento em 6 ml de meio de cultura MCDB aos quais foram adicionados os suplementos.
2. Agora, extrair a solução ressuspenso para uma pipeta de transferência estéril e colocar as células em uma placa de 35 mm, ou de um poço de uma placa de 6 poços, e reunir as células cardíacas isoladas a partir de três ratinhos neonatais em um prato de 35 mm ou bem.
3. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C numa atmosfera de _CO2 a 5%, aspirar fora do meio de cultura, juntamente com quaisquer células não ligadas e depois enxaguar as placas uma vez com DPBS. Em seguida, adicione meio fresco para as placas e substituir os meios de comunicação a cada 2 dias. As células isoladas a partir de corações neonatais ou embrionários pode ser mantido em cultura durante até 3 semanas, enquanto que as células isoladas de ouvir adultots podem ser mantidas em cultura durante até 10 dias.

Células 5 Isolando Cardiac Melanócitos como de rato adulto Coração

1. Em primeiro lugar, retirar os corações de ratos maduros (3-4 semanas de idade, n = 3), através de uma esternotomia linha média após a administração de heparina 100 U intraperitoneal para os ratinhos e, em seguida, eles eutanásia. Recomenda-se usar pentobarbital para sacrificá camundongos para este procedimento, mas este medicamento não está disponível em todos os locais.
2. Em seguida, lave os corações excisadas em DPBS estéreis contendo antibióticos em uma capa de cultura de tecidos (cabine de segurança biológica). Aperte os corações um pouco com uma pinça de dissecação curvas para remover qualquer vestígio de sangue restante deles e, em seguida, enxaguar os corações em DPBS mais uma vez.
3. Remover os átrios e anel atrioventricular dos corações (estas estruturas contêm as células de melanócito-like) e coloque as amostras de tecido excisadas em um prato de 35 mm.
4. Corte os corações em pedaços pequenos usando uma tesoura curva e forçaps e, em seguida, adicionar 6-8 mL de solução de tripsina a 0,5% para o prato. Em seguida, os pratos incubar a 37 ° C durante 45-60 min.
5. Agora, siga os passos do procedimento acima a partir do passo 3.6 em diante.

Resultados

O protocolo descrito neste artigo é uma técnica aprimorada em comparação com o que anteriormente publicado para isolar melanócitos cardíacos do coração murino. Este procedimento emprega a utilização de marcadores fluorescentes accionados por síntese de melanina-específica enzima Cre-recombinase para marcar as células de melanócitos, como cardíacas. É importante a utilização de um marcador para rotular melanócitos cardíacas quando se trabalha com células embrionárias ou neonatais recém-isolados, uma vez que as diferenças...

Discussão

Melanócitos cardíacas estão presentes em locais anatômicos dentro do coração que normalmente dão origem a gatilhos arritmia atrial. Essas regiões incluem as veias pulmonares, o anel atrioventricular, a posterior do átrio esquerdo e do forame oval (Figura 4). Para compreender o papel dessas células desempenham na arritmogênese, desenvolvemos técnicas para isolá-los e estudar sua fisiologia. No entanto, reconhecemos que melhorar esta técnica para produzir quantidades mais saudáveis ​​e maiores de melanóci...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
MCDB 153	Sigma-Aldrich	M7403	Dissolver em água
DPBS, sem cálcio nem magnésio	Invitrogen	14190136	Conc. estoque: 1x Conc. de trabalho: 1x
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen	15140163	Conc. estoque: 100x Conc. de trabalho: 1x
Soro bovino fetal	Life Technology	Certificado	Conc. de trabalho: 4%
TPA	Sigma-Aldrich	P1585	Dissolver em DMSO Conc. estoque: 3,2 μM Conc. de trabalho: 32 nM
Transferrina	Sigma-Aldrich	T8158	Dissolver em DPBS Conc. estoque: 0,1 mg/ml Conc. de trabalho: 1 μg/ml
AMP cíclico dibutiril	Sigma-Aldrich	D0627	Dissolver em DPBS Conc. estoque: 0,5 mM Conc. de trabalho: 5 μM
Insulina	Sigma-Aldrich	I6634	Dissolver em ácido acético 10 mM Conc. estoque: 1 mg/ml Conc. de trabalho: 5 μg/ml
FGF básico	BD Biosciences	354060	Dissolver em água Conc. estoque: 4 ng/μl Conc. de trabalho: 4 ng/ml