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Summary

Drosophila melanogaster é um organismo modelo eficaz para explorar a base molecular da regulação da longevidade. Este protocolo irá discutir as etapas envolvidas na criação de um reprodutível, medição de base populacional de longevidade, bem como potenciais armadilhas e como evitá-los.

Abstract

O envelhecimento é um fenômeno que resulta na deterioração fisiológica constante em quase todos os organismos em que foi examinado, levando à redução do desempenho físico e aumento do risco de doenças. Envelhecimento individual se manifesta ao nível da população como um aumento dependente da idade de mortalidade, que é muitas vezes medido em laboratório, observando vida em grandes grupos de indivíduos da mesma idade. Experiências que visam quantificar a extensão em que as manipulações genéticas ou ambientais impacto esperança de vida dos organismos modelo simples foram coroados de êxito para a compreensão dos aspectos do envelhecimento que são conservadas entre taxa e para inspirar novas estratégias para prolongar vida útil e prevenção de doenças associadas à idade nos mamíferos .

A mosca do vinagre, Drosophila melanogaster, é um organismo modelo atractivo para estudar os mecanismos de envelhecimento devido ao seu tempo de vida relativamente curto, a criação conveniente, e genética fáceis.No entanto, medidas demográficas de envelhecimento, incluindo a idade específica de sobrevivência e mortalidade, são extremamente suscetíveis a variações ainda menores em delineamento experimental e meio ambiente, e para a manutenção de práticas estritas de laboratório para a duração dos experimentos de envelhecimento é necessária. Estas considerações, juntamente com a necessidade de praticar o controle cuidadoso do fundo genético, são essenciais para a geração de medições robustos. Na verdade, há muitas controvérsias em torno notáveis ​​inferência a partir de experimentos de longevidade em leveduras, vermes, moscas e ratos que foram traçadas a artefatos ambientais ou genéticos ^1-4. Neste protocolo, descrevemos um conjunto de procedimentos que foram otimizados ao longo de muitos anos de medir a longevidade em Drosophila utilizando frascos de laboratório. Descrevemos também o uso do software DLIFE, que foi desenvolvido pelo nosso laboratório e está disponível para download ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / software). DLIFE acelera o rendimento e promove as boas práticas, incorporando melhor projeto experimental, simplificar a manipulação mosca e coleta de dados, padronização e análise de dados. Também vamos discutir as muitas armadilhas em potencial no projeto, coleta e interpretação de dados de expectativa de vida, e nós fornecemos medidas para evitar esses perigos.

Protocol

Recomendamos armazenar alimentos experimentais, pasta de levedura e placas de agar de uva que aparecem no protocolo, a 4 ° C e utilizando-os dentro de 1-2 meses, desde que o molde e secura não tiver definido dentro das condições ambientais padrão, tanto para o larvar e adulto estágio envolve a manutenção de moscas em uma incubadora a 25 ° C com um ciclo de 12:12 horas de luz escura e 60% de humidade relativa. 1. Preparação de Alimentos Experimental Para o crescimento larval, usamos uma versão modificada Caltech Médio 5, que é abreviado neste protocolo como CT. Recomenda-se uma dieta de adultos de Drosophila (SY) que consiste em açúcar (sacarose) e levedura (levedura de cerveja inteiro liofilizado) em uma base de agar a 2%, que foi fervida, suplementado com antibióticos e agentes anti-fúngicos, e distribuído (10 ml por frasco) 6. Alimento deve ser deixado solidificar e evaporar durante 12-24 horas antes do armazenamento. Uma vez que o ambiente nutriente pode substancialmente longevidade impacto, consistência nos processos de cozimento é fundamental, tanto dentro de um experimento e para a comparação entre os experimentos. Se um agente farmacológico é para ser adicionado ao alimento para adultos, esta droga pode ser misturado em um pequeno lote de alimentos e em camadas (2 ml) na superfície da comida, com os frascos de controlo que receberam camadas contendo apenas veículo. 2. Preparação de uma pasta de levedura viva Combine 5-6 ml de água com 3 g de levedura seca activa e misturar bem. A consistência da pasta de levedura deve ser a de uma manteiga de amendoim lisa. 3. Preparação de uma placa de agar de uva Adicionar um pacote de uma pré-mistura de agar de uva em 500 mL de água destilada num balão de 1000 ml e seguir as instruções da embalagem para dissolver a mistura de agar de uva. Verter cuidadosamente uma espessa camada de a mistura em placas de 100 mm de Petri, evitando a formação de bolhas. Um pacote de pré-mistura produz cerca de 14 graágar placas PE. Deixar os meios arrefecer e solidificar a temperatura ambiente, com tampas de 15 min. As placas podem ser mantidas a 4 ° C, envolvido em película de plástico, ou utilizado imediatamente. 4. Coleta de ovos sincronizados Todos os meios utilizados no presente protocolo, isto é, de levedura, de placas de ágar de uva, CT e 10% de alimento SY, deve estar à temperatura ambiente. Espalhe uma camada de 2-3 cm de diâmetro de levedura cole em uma placa de ágar de uva e reserve. Coloque uma gaiola grande coleção de ovos em uma almofada de CO 2 com a malha lateral-down para anestesiar as moscas. À base de nitrogênio anestesia é uma alternativa para o CO 2, usada por alguns laboratórios, que pode produzir resultados de alta qualidade 7. Utilizando um funil, transferir 150-200 pares de moscas dentro da jaula recolha de ovos. Colocar a placa de agar de uva para cobrir a extremidade aberta da gaiola, e fixá-lo com uma tampa de extremidade. Coloque a gaiola do seu lado até moscas acordar.Em seguida, manter a gaiola, com o lado da placa de agar de uvas para baixo, na incubadora durante a noite. No dia seguinte, a placa de troca de uva com um prato de uva recém-fermentado. Colocar somente cerca de 1 cm de diâmetro de massa de levedura sobre a superfície da placa. Descarte o 1 º placa de uva dia. Permitir que os embriões de recolher na superfície da placa de agar de uva para 16-22 hr. Uma vez feito, recolher a placa de ágar de uva e descartar as moscas pai. Lava-se a superfície das placas de agar de uva com 1x Tampão fosfato salino (PBS). Os ovos podem ser mobilizados por gentilmente raspando com um cotonete. Tomar cuidado para não danificar o início, ou raspar finos pedaços de agar para fora da superfície da placa. Com o auxílio de um funil, despeje os ovos lavados para um tubo cónico de 15 ml. Deixe os ovos se depositam no fundo do tubo e decantar o sobrenadante, tendo o cuidado de não perder qualquer ovos. O volume restante deve ser em torno de 2-3 ml. Adicionar 8-10 ml de PBS ao tubo e repetir o passo 2-3 acima morvezes e para lavar os ovos até o sobrenadante é clara. Livrar-se de levedura residual é a chave nesta etapa. Após a lavagem, drenar todo o sobrenadante até que o volume remanescente é de 2 ml. Alíquota de 32 ul de ovos em garrafas CT usando uma ponteira grande furo. Ovos na ponta da pipeta deve ser compacto, com pouco ou nenhum líquido aspirado. Isto pode ser alcançado através da inserção da ponta da pipeta em profundidade o assentamento de ovo e rapidamente libertar o êmbolo para aspirar. Lugar semeado CT garrafas de volta na incubadora durante todo o desenvolvimento da mosca. 5. Recolha de Idade de correspondência adulto voa Adultos normalmente eclose a partir do dia 9 em diante. Descarte as moscas que surgiram no primeiro dia e garrafas lugar de volta na noite incubadora. Essa prática vai evitar a seleção inadvertida para emergentes iniciais e permitir a recolha de um número máximo de moscas sincronizados. 16-22 horas mais tarde, transferir o adulto dias de idade voa intgarrafas de alimentos Ø 10% Sy. Se necessário, um outro lote podem ser recolhidos no dia seguinte. Retorno voa de volta para a incubadora e permitir moscas para atingir a maturidade sexual e companheiro por dois dias. Gravar no dia da transferência para frascos de 10% SY como o primeiro dia de vida adulta. 6. Classificando Moscas e configuração Experimento Longevidade Anestesiar pequenos grupos de moscas sobre a almofada de anestésico, os machos e fêmeas de classificação em dois grupos, usando um pincel. Se usando CO 2, é fundamental para minimizar a exposição para evitar possíveis problemas de saúde de longa duração que podem comprometer a integridade da experiência longevidade. Coloque 30 moscas do mesmo sexo em frascos individuais. Supondo que nenhum cromossomo balanceador na população e descendência saudável, cada garrafa deve produzir cerca de 3-4 frascos de cada sexo. Alíquotas de moscas em frascos individuais não deve durar mais do que 3-4 minutos, de modo que, no total, as moscas são apenas expostos a anestesia durante um máximo de9-10 min. Repita os passos de 6,1-6,2 até que haja 8-10 frasco repetições para cada sexo e tratamento experimental. 7. Configurando a planilha Excel para controlar o Experimento Longevidade Recomendamos randomizar posição frasco, em vez de frascos de agrupamento por condição experimental, a fim de evitar imprecisões associadas à localização frasco dentro da incubadora e para obscurecer a identidade do frasco para o experimentador. Para fazer isso, primeiro atribuir um ID aleatório numérica para cada frasco em um programa de planilha, em seguida, organizar os frascos em bandejas por número de identificação. Se você estiver usando o software de gerenciamento de DLIFE experiência, siga o tutorial sobre configuração da experiência para gerar o número de identificação para cada frasco. (Opcional) Se você estiver usando um leitor de RFID ou leitor de código de barras em associação com DLIFE, anexar uma tag RFID ou de código de barras a cada frasco e associar a marca com identificação numérica do frasco em DLIFE. O programa irá reconhecer cada frasco quando digitalizados com um leitore orientar uma para gravar os dados no local correto em uma planilha. O uso de um leitor de etiquetas em conjunto com DLIFE reduz significativamente os dados época de coleta e erro de gravação. 8. Manter o experimento Longevidade Os frascos contendo alimentos frescos devem estar à temperatura ambiente para cada transferência. Durante o período experimental, as moscas transferir para frascos contendo novos alimentos frescos cada 2 dias (fêmeas jovens), ou 3 vezes por semana (machos ou fêmeas> 3 semanas de idade). Este passo assegura que o ambiente de alimentação para fêmeas jovens não é perturbada pela presença de larvas. Esta transferência deverá ser concluída sem anestesia, o que pode causar a morte aguda, especialmente em moscas mais velhas (Pletcher, observações pessoais). Durante cada transferência frasco, registrar a idade, contar as moscas mortas no frasco de idade, e as moscas mortas que são transportados para o novo frasco. Grave esta informação separadamente emduas colunas em uma planilha (ou DLIFE ou sua própria planilha). Isto irá garantir que as moscas não são realizadas duas vezes contadas. O número total de mortes (mortos + realizada) deveria pelo menos igual ao número de moscas realizadas a partir da transferência anterior. Subtrair o número de moscas anteriormente desenvolvidas a partir do número total de mortes para determinar o número de mortes por novas. Uma mosca é considerado certo-censurada se deixasse o experimento antes da morte natural através de fuga ou morte acidental. Animais saem da experiência desta forma deve ser inserido em uma coluna separada no dia em que a mosca saiu do experimento. Censurado moscas não são contabilizados como mortos (veja abaixo). Continuar a repetir os passos 8,1-8,2 até o último sobrevivente está morto. Esteja ciente de que, como a idade moscas, algumas moscas podem mentir sobre a sua volta e aparecem mortos devido a sua inatividade. Portanto, quando a contagem moscas transportadas (morto), toque no lado dos frascos para determinar se existem movimentos das pernas. Se assim for, thesmoscas eletrônicos ainda estão vivos. No caso em que as moscas permanecem presos à comida no frasco de idade, mas vivos, eles não devem ser contados como mortos e deve ser resgatado por mais tocando do frasco para retirar a mosca. Censurando moscas que deve ser usado com cuidado, uma vez que pode resultar em viés experimental. 9. Análise de Dados A curva de sobrevivência mostra a probabilidade de que um indivíduo sobrevive para uma dada idade e normalmente é calculado usando uma abordagem de Kaplan-Meier (Figura 1) 8. Na ausência de dados da direita censurados, a fórmula pode ser simplificada tal que a sobrevivência específica da idade com a idade de x (S x) é determinado dividindo-se o número de indivíduos vivos no início de um período censo na idade x (N x) pelo número total de moscas no experimento (N 0) em que S x N x = / N 0. 9,2) Sobrevivência curvas são a forma mais comum de apresentação de dados, e elespode ser testado para a igualdade entre grupos usando um teste de log-rank. Inferência razoável pode ser desenhado a partir de tão pouco quanto 50-100 indivíduos de uma coorte. A sobrevivência é uma medida cumulativa, contudo, e, por conseguinte, que não são as mortes relacionadas com o envelhecimento, tais como os primeiros anos de vida, irá diminuir a sobrevivência ao longo do tempo de vida o que torna difícil a efeitos específicos para averiguar o envelhecimento. Um método de visualização de dados é a segunda função de mortalidade específica por idade, o que mostra o risco de morrer por cada intervalo de idade e apresenta uma descrição mais matizada dos dados de sobrevivência 9,10. Medidas de mortalidade são independentes um do outro para a idade, e a forma da curva de mortalidade é útil para inferir sobre a dinâmica do envelhecimento, em particular quando os tratamentos são ajustados durante a vida adulta. Estimativas de mortalidade específicas por idade, no entanto, não têm precisão e exatidão com amostras pequenas, e muitas vezes exigem vários-para-muitos centenas de indivíduos por coorte para uma es confiáveltimate 11. Outros métodos para estimar diferenças de longevidade incluem paramétrico (eg Gompertz) e semi-paramétricos (por exemplo, a regressão de Cox) modelos. Estes modelos podem ser poderosos, mas deve ser aplicado com cautela por causa das suposições feitas sobre a forma das curvas de mortalidade e da natureza dos efeitos do tratamento, o que poderia levar a inferência incorreta 11,12.

Representative Results

Um esquema simplificado do protocolo é apresentada na Figura 1, em que os passos principais são delineadas. A parte do protocolo de sincronização podem ser utilizados para ensaios diferentes que necessitam de moscas adultas pareados por idade. As curvas de sobrevivência típicas de moscas do tipo selvagem são mostradas na Figura 2a, utilizando o software de gestão de DLIFE experiência (Figura 2b, c). Machos adultos geralmente vivem m…

Discussion

O protocolo aqui apresentado descreve um método para produzir medições reprodutíveis da longevidade da Drosophila, que é adaptável para a avaliação de intervenções farmacológicas, genéticos e ambientais. Aspectos cruciais do protocolo incluem controlando cuidadosamente o ambiente de desenvolvimento larval, minimizando o estresse do adulto, e minimizando o viés entre os grupos experimentais e controles. Apresentamos também a utilização do software de gestão DLIFE vida experiência. Por simplesme…

Materials

Active Dry Yeast	Fleishmann’s Yeast	2192
Grape Agar Powder Premix	Genesee Scientific	47-102
Large Embryo Collection Cages	Genesee Scientific	59-101
Large Replacement End Caps	Genesee Scientific	59-103
6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene	Genesee Scientific	32-130
Flugs Closures for Stock Bottles	Genesee Scientific	49-100
<em>Drosophila</em> Vials, Wide, Polystrene	Genesee Scientific	32-117
Flugs Closures for Wide Vials	Genesee Scientific	49-101
Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul	Denville Scientific	P1105-CP
Flystuff Flypad, Standard Size	Genesee Scientific	59-114
BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-70C
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H;	Fisher Scientific	08-757-12
Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow	Fisher Scientific	10-200-47
PBS pH 7.4 10x	Invitrogen	70011044
Gelidium Agar	Mooragar	n/a
Brewer's Yeast	MP Biomedicals	0290331280
Granulated Sugar	Kroger	n/a
Tegosept	Genesee Scientific	20-266	Fly Food Preservative
Propionic Acid, 99%	Acros Organics	149300025	Fly Food Preservative
Kanamycin Sulfate	ISC BioExpress	0408-10G
Tetracycline HCl	VWR	80058-724