Isolamento, cultura e transplante de células musculares satélite

Células satélites musculares são uma pequena população de células-tronco miogênicas localizadas abaixo da lâmina basal das fibras musculares esqueléticas. Eles são caracterizados pela expressão de Pax7, Pax3, c-Met, M-caderina, CD34, Syndecan-3, e calcitonina de ^1-3. Células satélites têm provado ser responsável para a regeneração muscular, as células-tronco musculares. No músculo adulto, as células satélites são normalmente mitose repouso ^4-8. Após lesão, as células satélites são ativadas, iniciar expressão de MyoD e entrar no ciclo celular para expandir a sua descendência, chamadas de células precursoras miogênicas ou mioblastos ^3. Depois de vários ciclos de divisão celular, mioblastos sair do ciclo celular e fusível para o outro, a fim de sofrerem diferenciação em miotubos multi-nucleadas, seguido por fibras musculares maduras. Mioblastos isolados de músculo adulto pode facilmente ser expandidas ex vivo. A capacidade para mioblastos para tornar as fibras musculares na regeneração muscular eformar fibras musculares ectópica em tecidos nonmuscle é explorada por transplante de mioblastos, uma aproximação terapêutica potencial para a distrofia muscular de Duchenne (DMD), ^4, disfunção urológica ^9, e a insuficiência cardíaca ^10. Com efeito, os mioblastos foram transplantadas com sucesso no músculo de ambos mdx (modelo DMD) e ratos doentes DMD ^11-14. Os mioblastos normais injectados fundir com as fibras musculares de acolhimento para melhorar a histologia e função do músculo doente. Trabalhos anteriores demonstraram que subpopulações de mioblastos são mais células-tronco semelhantes e permanecem em um estado indiferenciado mais no músculo durante a regeneração muscular ^5. Trabalhos recentes mostraram que as células satélites recém-isoladas de músculo adulto conter uma população de células-tronco como que exibe o enxerto mais eficiente e atividade auto-renovação na regeneração muscular ^5-8. Portanto, a purificação de uma população pura de células satélites quiescentes de mu esquelético adultoesclerose é essencial para compreender a biologia de células satélites, mioblastos e regeneração muscular, e para o desenvolvimento de terapias baseadas em células.

No entanto, os métodos de purificação de correntes de potenciais células satélites quiescentes requerem a utilização de um activado por fluorescência celular separação caro (FACS) da máquina ^1,2,6-8. Além disso, a exposição ao laser FACS tende a induzir a morte celular durante a separação, o que faz com que o rendimento mais baixo de células quiescentes de satélite ^15. Aqui, apresentamos um novo método para a purificação rápida, econômica e confiável de células satélites quiescentes de rato adulto músculo esquelético. Este método utiliza dissociação enzimática seguido de célula magnética ativado triagem (MACS). A seguir ao isolamento de células satélites quiescentes puros, estas células podem ser cultivadas para obter um grande número de mioblastos após várias passagens. Mostramos também que a injeção intramuscular dessas células satélites quiescentes recém-isoladas ou ex vimioblastos vo expandidos podem ser transplantadas para cardiotoxina (CTX) induzida regeneração do músculo esquelético do rato para examinar a contribuição de células derivadas de doadores para regenerar as fibras musculares, bem como para os compartimentos de células satélites para o exame de atividades de auto-renovação.

Os animais foram alojados em um ambiente SPF e foram monitorados pela pesquisa Recursos Animais (RAR), da Universidade de Minnesota. . Os animais foram sacrificados através de meios adequados (CO ₂ inalação ou injecção de KCl, após ter sido anestesiados com injecção IP de Avertin (250 mg / kg) Todos os protocolos foram aprovados pelo Animal Care and Use Committee 'da Institucional (IACUC, Número Código: 1304-30.492 ) da Universidade de Minnesota.

1. Isolamento de células mononucleares de Rato Músculo Esquelético

1. Devidamente sacrificar um ou dois ratos adultos jovens (3-8 semanas).
   1. Aperte e cortou a pele do abdômen com uma tesoura afiada. Retire a pele para mostrar completamente tríceps e musculatura dos membros posteriores (puxar a pele em direções opostas).
   2. Remova todos os músculos das pernas esqueléticas (tibial anterior, gastrocnêmio e quadríceps) e tríceps ao longo dos ossos com uma tesoura. Em seguida, transferir os músculos para gelado, PBS estéril numa placa de 10 centímetros.
2. Lave sangue de músculos em PBS e músculos de transferência para um novo 6 centímetros estéril placa: 1 placa de 1-2 ratos.
3. Remover o tecido conjuntivo, vasos sanguíneos, feixes nervosos e tecido adipogênica sob um microscópio de dissecação.
4. Com uma tesoura para oftalmologia, cortar e picar o tecido em uma pasta lisa (Figuras 1A e 1B). Tente não deixar pedaços grandes, já que não será dividida prontamente pela solução enzimática.
5. Transferir músculos picados para um tubo Falcon de 50 mL, e adicionam-se 5 ml de solução de colagenase (0,2% de colagenase do Tipo 2 em 10% de FBS em DMEM). Incubar a 37 ° C durante 60 min.
6. Triturar (para cima e para baixo com uma agulha 18 G) para homogeneizar a mistura (Figura 1C). Em seguida incubar ainda mais a mistura a 37 ° C durante 15 min.
7. Triturar novamente para homogeneizar mistura para dissociar-se em suspensão única célula. Adicionar 2% de FBS em DMEM até 50 ml para a suspensão de células individuais e misturábem.
8. Coloque um filtro celular (70 mM) em um tubo Falcon de 50 ml (Figura 1D). Transferir o sobrenadante contendo as células dissociadas em um coador de células, e a suspensão celular pipetar para cima e para baixo no filtro até que ela passe através.
9. Contar o número de células em hemocitômetro. Centrifugar os tubos a 2000 rpm a 4 ° C durante 5 min; aspirado e descartar o sobrenadante.
10. Ressuspender com 10 ml de 2% de FBS em DMEM. Centrifugar os tubos a 2000 rpm a 4 ° C durante 5 min; aspirado e descartar o sobrenadante.
11. Ressuspender com 200 mL de 2% FBS em DMEM e suspensão de células transferência para tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Normalmente, cerca de 2 x 10 ⁶ células devem ser colhidas a partir de músculos de um rato. As células vão ser diluídas para uma concentração de 1 x 10 ⁶ células em 100 ul de 2% de FBS em meio DMEM.

2. Anticorpo Coloração e separação com MACS

Durante o seguinte procedures, manter condições estéreis utilizando tampões estéreis. Cada volume de anticorpos adicionados e meio de suspensão de célula é calculada para as células dos músculos inteiros de um rato. Se as células são colhidas a partir de duas ou mais ratos, a quantidade de reagentes deve ser optimizado.

1. Adicionar 1 ml de cada um CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE, e Integrina anticorpo α7 em 200 ul de suspensão de células. Incubar em gelo durante 30 min.
2. Lavar as células: Após a incubação, adicionar 1 ml de 2% de FBS em DMEM na suspensão de células no tubo de 1,5 ml e centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min. Repita esta etapa duas vezes.
3. Aspirar e desprezar o sobrenadante.
4. Ressuspender as células com 200 mL de 2% FBS em DMEM, e adicionar 10 ml de Anti-PE esferas magnéticas. Incubar em gelo durante 30 min.
5. Lavar as células: Após a incubação, adicionar 1 ml de tampão de MACS para a suspensão de células no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e, em seguida, centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min. Repita este passo twgelo. Note-se que as células deverão ser lavadas pelo tampão MACS antes de ser separada por coluna magnética.
6. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Ressuspender as células com 1,0 ml de tampão de MACS.
7. Configure coluna LD em uma placa magnética, e lavar a coluna com 2,0 ml de tampão MACS (Figura 1E).
8. Transferência da suspensão de células para dentro da coluna de LD, e recolher a fracção de escoamento num tubo de 1,5 ml. Esta fracção contém células PE-negativo.
9. Centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 minutos, aspirado e desprezar o sobrenadante.
10. Suspenda as células com 200 ul de 2% de FBS em DMEM, e adicionar 10 ul de IgG anti-ratinho esferas magnéticas. Incubar em gelo durante 30 min.
11. Lavar as células: Após a incubação, adicionar 1 ml de tampão de MACS para a suspensão de células em 1,5 ml de tubo e, em seguida, centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Repita esta etapa duas vezes. Ressuspender as células com 500 ul de tampão de MACS.
12. Configure coluna MS em uma placa magnética, e lavar a coluna com 500 mL de tampão MACS (Figura 1F).
13. Transferência suspensa solução de células na coluna MS, e descartar a fração de fluxo (células α7 negativo integrinas).
14. Enxágüe com 1 ml de tampão MACS, e repita esta etapa duas vezes.
15. Depois de enxaguar, remover a coluna a partir do campo magnético do separador. Aplicar 1,0 ml de tampão de MACS para a coluna, e eluir as células magneticamente marcadas (células α7-positivo Integrina) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, empurrando o êmbolo da seringa a partir do topo da coluna. Recolhe-se o fluxo de passagem para um tubo de 1,5 ml. Repete-se a eluição com 1,5 ml de tampão de MACS e recolher o fluxo de passagem.
16. Centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 minutos, aspirado e desprezar o sobrenadante.
17. Ressuspender as células purificadas com 1 ml de meio de mioblasto (FBS a 20% continha Hams F-10 com bFGF), e células da placa em Matrigel-revestidas 10 centímetrosplaca com 8 ml de mioblasto Médio (5 ml em seis centímetros placa) (Figura 1G). Note-se que de 1-2 x 10 ⁵ células pode, potencialmente, ser isolado a partir de um músculo intacto do rato.

3. Manutenção

1. Alimentar as células a cada dois dias com meio mioblasto. O aparecimento de mioblastos em crescimento é de uma pequena e rodada expressando MyoD (Figura 2) e Pax7 (dados não mostrados) no seu núcleo.
2. Mioblastos devem ser passadas antes dos 50% de confluência ou quando iniciar a fusão celular. Depois de enxaguar uma vez com PBS, incubar as células com uma solução de tripsina a 0,25% a 37 ° C durante 3 minutos em uma incubadora de CO ₂ e recolher células dissociadas com meio mioblasto. Após centrifugar células (1.000 rpm por 5 min), suspender com meio mioblasto e replate células em novas placas Matrigel-revestidos. Placas revestidas com colagénio pode ser usado após a passagem 3. Uma placa pode ser geralmente dividida em 3-5 placas.

4. Diferentiation

1. Alimente novamente com Diferenciação Médio em dias alternados.
2. Por volta do dia 1 de Diferenciação Médio, mioblastos sair do ciclo celular e sofrem diferenciação em cadeia pesada da miosina (MHC) positivo miócitos. Estes myoctyes começar a fusão das células com o outro para gerar miotubos multinucleados. Tipicamente, a maioria dos mioblastos tornar miócitos MHC-positivos mononucleares de diferenciação ou miotubos (Figura 2) por dia 3-5 na Diferenciação Médio.

5. Mioblasto Transplante em mouse para Skeletal regeneração muscular

1. Anestesiar o rato com Avertin (250 mg / kg) por via intraperitoneal (IP) de injecção.
2. Raspar o cabelo da pele em torno do músculo tibial anterior (TA). Vinte e quatro horas antes do transplante de mioblastos, 10 uM CTX (50 ul) é injectada por via intramuscular para o Node / músculo de ratinho SCID TA para induzir a regeneração do músculo através de uma seringa de 31 L de insulina através da pele raspada (Figura60, 3).
3. Mioblastos em proliferação são dissociados com uma solução de tripsina a 0,25% e centrifugadas a 1.000 rpm durante 5 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Ressuspender 1 x 10 ⁶ células, com 50 ul de 2% de FBS em DMEM. Transferir as células em suspensão com uma seringa de insulina de 31 L.
4. Os ratinhos receptores serão anestesiados com Avertin (250 mg / kg) por injecção IP, e os 1 x 10 ⁶ mioblastos (Figura 2) são injectadas por via intramuscular em regeneração muscular TA.
5. Colheita TA muscular por 1-4 semanas após a injecção das células para análise histológica (Figura 3).

Células satélites quiescentes recentemente isoladas exibir uma forma pequena e redonda (Figura 1G) e Pax7 expressa como um marcador definitivo para as células satélites quiescentes. Mais de 90% das células recentemente isoladas expressam Pax7 (Figura 1H e 1I). A maioria das células contaminadas são a partir de células de sangue que não crescem de forma eficiente in vitro seguintes condições de cultura de mioblastos. Assim, mioblastos derivados de células satélite dominar na cultura. Opcionalmente, pode-se repetir os passos de purificação em coluna de MS (passos 2,11-2,14) para aumentar a pureza das células satélites isoladas. Estas células satélites quiescentes vai entrar no ciclo celular dentro de 24 horas após o isolamento se submeter células precursoras miogênicas ou mioblastos. Estas células podem ser passadas por tripsinização a cada 4 dias até que a taxa de proliferação das células é reduzida. Normalmente, essas células podem ser mantidas até que a passagem 10. Estes mioblastos em proliferação expressam MyoD ( (Figura 2). Estes ex vivo mioblastos expandidos podem ser utilizados para os experimentos de injeção intramuscular de células para exame da contribuição de mioblastos para regenerar as fibras musculares e as células satélites auto-renovação. Vinte e quatro horas antes da injeção das células, CTX é injetado em músculos TA de dois meses de idade, os ratos imunodeficientes Nod / SCID. Mioblastos dissociadas são injectados no músculo regeneração induzida por CTX (Figura 3). O músculo injectado pode ser colhida de alguns dias a vários meses após a injecção. Células dadoras são tipicamente geneticamente marcado com proteína verde fluorescente (GFP) do gene 6, gene β-galactosidase 16 da fosfatase alcalina de 18 por transfecção de plasmídeo, infecção vector viral, ou a preparação a partir de ratinhos transgénicos que transportam um transgene. As células-satélite de Myf5 heterozigotos + / nLacZ camundongos 19, em que as células miogênicas pode ser detectado após coloração X-gal, foram isolados. Os ratinhos Myf5 + / nLacZ transportar o β nuclear -. Gene galactosidase inserido no locus do gene Myf5, onde a expressão do gene β-galactosidase recapitula a expressão de Myf5 endógeno em células satélite e de células precursoras miogénicas ou mioblastos 20 Figura 3 mostra toda TA coloração do músculo para a detecção de β-galactosidase-positivo células nucleares derivadas de doadores, que incluem mioblastos em proliferação, as células satélites auto-renovação e fibras musculares recém-formadas. Se necessário, estes músculos TA coradas pode ser usado para análise histológica siCÇÕES para outros métodos de imunodetecção.

Figura 1. Preparação de células satélites musculares de rato músculo esquelético. A:. Mincing tríceps dissecados e músculos dos membros posteriores por tesouras B:. Visualização ampliada do painel A C: trituração picados pedaços de músculo tratado com colagenase por 18 G agulha D:. Filtrantes dissociada preparação muscular, filtro de células E:. MACS separação de dissociada Eu células satélites recém-isoladas Pax7 positivo:: coloração DAPI para o painel G células musculares por coluna LD F:. MACS separação das células musculares dissociadas por coluna MS G:.. células satélites recentemente isoladas H..

Figura 3. Injeção intramuscular de mioblastos expandidas em rato músculo esquelético. A: X-gal coloração de mioblastos isolados de camundongos Myf5 + / nLacZ B, C:. Injeção intramuscular de Myf5 + / nLacZ mioblastos no músculo TA. Myf5 + / nLacZ em regenerar as fibras musculares. Coloração X-gal foi realizada no músculo TA injetados com mioblastos de 1 mês.

Não há conflito de interesse declarados.