Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

Os cardiomiócitos fornecem a força contrátil para o coração. Cada miócito contém elementos citoesqueléticos e contráteis organizados essenciais para a contração. O coração não contém apenas cardiomiócitos, mas também fibroblastos, tecido conjuntivo e miócitos modificados, como as fibras de Purkinje. Alterações em qualquer um ou em todos esses tipos de células podem ser observadas na insuficiência cardíaca, dificultando a determinação da causa final da disfunção cardíaca. A diminuição da contratilidade ventricular de um coração com insuficiência cardíaca é precedida por graus variados de acúmulo de tecido fibroso e hipertrofia e disfunção dos cardiomiócitos¹. As arritmias podem ser causadas por disfunção nas células condutoras², fibrose interrompendo a condução cardíaca³ ou alterações na expressão dos canais iônicos nos cardiomiócitos^1,4. Na verdade, esses problemas muitas vezes coexistem de maneira complicada.

Isolar e estudar cardiomiócitos permite examinar a disfunção contrátil e elétrica de miócitos individuais no contexto da função cardíaca geral. Técnicas para isolar miócitos cardíacos individuais foram desenvolvidas há mais de 40 anos em um esforço para estudar melhor a fisiologia dessa célula do coração. As técnicas de isolamento foram aprimoradas para aumentar o rendimento e a qualidade das células, com o desenvolvimento vital da perfusão coronariana via canulação da aorta, realizado pela primeira vez em 1970⁵. Este artigo descreve o isolamento de cardiomiócitos seguido de medição de contratilidade e transientes de cálcio usando fluorescência raciométrica e software de aquisição de dados de dimensionamento celular. Em modelos genéticos e ambientais de doenças cardíacas, a utilização deste protocolo fornece informações importantes sobre contratilidade celular, contratilidade e relaxamento sarcomérico, transientes de cálcio e ruptura do citoesqueleto. Esse sistema é frequentemente utilizado para testar o efeito de drogas em cardiomiócitos isolados^6,7. Empregamos o sistema para comparar a contratilidade e os transientes de cálcio de cardiomiócitos entre camundongos do tipo selvagem e camundongos com uma mutação que leva à cardiomiopatia dilatada.

O estudo de miócitos cardíacos individuais tem inúmeras vantagens sobre outros métodos comumente usados para estudar anatomia e fisiologia cardíaca. A ecocardiografia e a eletrocardiografia fornecem informações sobre a função contrátil e a condução elétrica do coração em geral. Nenhum desses métodos explica a causa ou a natureza da disfunção abaixo do nível de todo o órgão. A medição da contratilidade de cardiomiócitos individuais usando algoritmos de detecção de borda e comprimento do sarcômero pode demonstrar que alterações na célula contrátil do coração estão presentes na disfunção cardíaca global. A medição dos transientes de cálcio demonstra a influência das mudanças no fluxo de íons em nível celular para disfunção contrátil ou arritmias.

Além de complementar estudos de órgãos inteiros, este protocolo fornece células facilmente coradas para componentes subcelulares. É possível ver alterações no citoesqueleto colorindo seções de tecido de todo o coração; no entanto, só é possível visualizar uma seção transversal de células. Um cardiomiócito inteiro é mais espesso do que a seção de tecido típica e, dado o arranjo e o comprimento dos cardiomiócitos, é difícil ver células inteiras em uma única seção. Os cardiomiócitos isolados podem ser fixados imediatamente e corados para uma variedade de elementos do citoesqueleto e canais iônicos. As imagens confocais podem ser compiladas em pilhas z de espessura total da célula. Além disso, a coloração de miócitos cardíacos isolados permite a coloração de componentes impossíveis de visualizar em cortes, como as invaginações da membrana conhecidas como túbulos T.

Existem linhagens celulares cultivadas de miócitos cardíacos, algumas das quais têm perfis transcricionais e características fenotípicas semelhantes aos miócitos cardíacos. Algumas, como a linhagem celular HL-1, até retêm alguma organização sarcomérica e capacidade contrátil rudimentar⁸. Apesar dessas qualidades, as células cultivadas não têm a forma de "vagão de caixa" e a estrutura do túbulo T dos cardiomiócitos e têm menos organização sarcomérica. Esses componentes são essenciais para a função dos cardiomiócitos in vivo. Além disso, o uso de células cultivadas permite a manipulação genética, mas não a manipulação fisiológica in vivo. Os cardiomiócitos isolados mantêm sua organização celular por tempo suficiente para serem estudados, mas ainda são facilmente visualizados e até transduzidos⁹.

Os cardiomiócitos isolados são extremamente versáteis, fornecendo um substrato para analisar de forma idêntica células de condições experimentais variadas. O isolamento e a análise fisiológica de miócitos têm sido usados por inúmeros laboratórios para uma variedade de experimentos, incluindo o estudo do efeito de drogas^6,7 ou pequenas moléculas¹⁰, estressores ambientais¹¹, infecção¹², doença¹³ ou mutação genética^14,15 na contratilidade e / ou transientes de cálcio e estudando a regulação da contratilidade e liberação de cálcio dentro de um cardiomiócito^15-17. Com a aplicação de qualquer um desses estressores, as alterações na função cardíaca podem ser devidas a qualquer combinação de alterações nos próprios cardiomiócitos e alterações no ambiente circundante do coração, como cicatrizes, alterações na condutividade ou alterações na matriz extracelular. Este é um protocolo ideal para responder a perguntas de pesquisa sobre a estrutura e função individual dos miócitos no contexto da insuficiência cardíaca por qualquer causa.

Embora tenha inúmeras vantagens sobre outras técnicas, a análise fisiológica de cardiomiócitos isolados não é ideal para todas as questões de pesquisa. O isolamento é um procedimento terminal, portanto, os cardiomiócitos só podem ser avaliados em um momento da vida do camundongo. Isso pode ser parcialmente superado usando coortes e sacrificando camundongos individuais ao longo do desenvolvimento da doença ou monitorando o camundongo para determinar se ele tem insuficiência cardíaca clinicamente significativa antes do isolamento. Embora este protocolo possa determinar se ocorreu disfunção cardiomiócita, não se pode concluir que essa disfunção é a causa raiz da insuficiência cardíaca sem informações experimentais adicionais. É possível que a própria disfunção cardiomiócita seja secundária a outras alterações no coração. Apesar desses desafios, o estudo de cardiomiócitos oferece informações valiosas para determinar a natureza da disfunção no coração, especialmente quando combinado com outros experimentos.

O protocolo a seguir é adaptado de um fornecido pelo Dr. Chee Lim, Vanderbilt University. Embora os dados de contratilidade e fluxo de cálcio sejam altamente reprodutíveis e úteis na comparação de corações com manipulação genética ou ambiental, o isolamento em si continua sendo um protocolo dependente da técnica, exigindo otimização. Minimizar o tempo entre a remoção do coração do camundongo e a perfusão do coração por meio da canulação aórtica é essencial para uma digestão de qualidade. Além disso, o tempo de digestão e a concentração enzimática podem ser otimizados para miócitos da mais alta qualidade. As etapas que provavelmente exigem otimização, juntamente com sugestões de otimização, são indicadas abaixo.

Certifique-se de todos os procedimentos que envolvem animais são aprovados pelo uso de animais apropriados e cuidados com o corpo.

1 Prepare Banco Buffers em adiantado

1. Prepare 2 L estoque de Ca2 ⁺ de Tyrode livre (Tabela 1). Ajustar o pH para 7,4 com NaOH.
2. Prepare 2 L estoque 1,2 mM de Ca2 ⁺ Tyrode (Tabela 2). Ajustar o pH para 7,4 com NaOH.

2 No dia do experimento, Prepare Perfusão, Transferência e Digestão Buffers

1. Prepare tampão de perfusão de 150 ml em Ca ^{2 +} de Tyrode livre (Tabela 3) e filtrar através de um filtro de 0,2 m.
2. Preparar 35 ml de Ca ^{2 +} transferência livre "Tampão A" (Tabela 4) e 25 ml de Ca2 ⁺ contendo "Tampão B" (Tabela 5). Filtre através de um filtro a cada 0,2 m.
3. Preparar soluções de 00,06, 0,24, 0,6, e 1,2 mM de Ca ^{2 +} por mistura de tampão A e B por Tabela 6.
4. Preparar um tampão de digestão de 25 ml por dissolução de enzimas de digestão em 25 ml de tampão de perfusão (Tabela 7) com base no peso corporal (BW) do rato. Filtrar através de um filtro de 0,2 m antes da utilização.

3. Setup Experimental

1. Montar um aparelho de Langendorff o fluxo constante, disponíveis comercialmente ou através de um bomba peristáltica, tubagem, e um permutador de calor da bobina para permitir uma taxa de fluxo de 3 mL / min de perfusato aquecida a 37 ° C. Um esquema simples é fornecida na revisão de 2011 por Bell, et al ^18.
2. Ajuste temperatura do banho de circulação de água (~ 47 ° C) do aparelho de Langendorff de modo que a partir da saída da cânula é de 37 ° C a uma taxa de fluxo de 3 ml / min.
3. Executar etanol a 70%, através do sistema de perfusão durante 15 min, seguido de 100 ml de tipo I de água ultrapura. Tampão de perfusão Executar através do system durante 5 minutos, enquanto a eliminação de bolhas de ar.
4. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos com um método desejado.
5. Criar uma cânula, anexando uma peça curta (cerca de 3 mm) de tubagem PE-50 para a ponta de um adaptador Luer 23 L-topo. Ponta de tubo de calor para criar um rebordo ao longo da aorta que vai ser posicionado.

4. Cardiomyocyte Isolamento

1. Injectar rato com 0,2 mL de solução de heparina (1000 IU / ml), por meio de injecção intraperitoneal.
2. Após 5 min, anestesiar rato com isofluorano. Quando totalmente anestesiados (sem resposta à forte pitada pé), spray peito com etanol 70%. Abra o peito, rapidamente extirpar do coração, tomando cuidado para não danificar a aorta, e coloque em 4 ° C tampão de perfusão. Use uma pinça curva para agarrar e levantar sob o coração. Isso cria espaço para cortar os anexos por trás do coração com uma tesoura fina.
3. Canular coração, segurando gentilmente a borda da aorta com dois pares de uma pinça fina e puxando cuidadosamente o opening da aorta ao longo da borda da cânula. Assegurar a ponta da cânula não está para além da válvula aórtica no ventrículo e, como isso vai inibir a perfusão do coração através das artérias coronárias.
4. Fixar a aorta à cânula por amarrar um laço de seda de sutura 5-0 em torno da aorta imediatamente acima do bordo da cânula.
5. Nota: Os passos 4.2 através de 4.4 deve ser concluída o mais rapidamente possível para a digestão de melhor qualidade.
6. Nota: O coração pode ser suspenso directamente sobre a cânula já ligado ao aparelho de Langendorff com fluir tampão de perfusão. No entanto, pendurando o coração para uma cânula ligada a uma pequena seringa de tampão de perfusão sob um microscópio de dissecção foi encontrada para ser mais bem sucedido. Isso permite que uma pequena quantidade de tampão de perfusão a ser empurrado através, prestando atenção para limpeza de artérias coronárias e garantindo coração está firmemente conectado à cânula. A cânula é então pendurado na Langendorff com tampão de corrida de perfusão.
7. Perfundiro coração com Ca2 ⁺ livre tampão de perfusão a um caudal de 3 ml / min durante 2-3 min.
8. Mudar para a enzima tampão de digestão e perfuse por 7-10 min, o coração vai se tornar mais suave e de cor mais clara.
9. Nota: O tempo de digestão pode ser ajustada com base na atividade enzimática e tamanho do coração.
10. Uma vez que o coração é palpável flácido, retire o coração da cânula e coloque em um prato p60 estéril com tampão A (Ca2 ⁺ buffer de transferência gratuita).
11. Remover átrios e grandes vasos. Remover ventrículo direito, se desejar. Com uma pinça, separar o ventrículo em pedaços pequenos. Pipeta várias vezes com uma pipeta esterilizada de 5 ml de transferência para dispersar ainda mais as células.
12. Filtra-se a suspensão de células para um tubo cónico de 50 ml através de um filtro de 250 um de malha de nylon.
13. Permitir que a suspensão para sedimentar durante cerca de 10 min.
14. Transferir a pelota na solução de Ca ^{2 +} de 0,06 mM. Permitir que as células sedimentar durante 10 minutos. Células saudáveis ​​irá agregar, enquanto a maioria das células mortas vão flutuar. Aspirar o sobrenadante, e transferir o sedimento para o Ca ^{2 +} solução 0,24 mM.
15. Repetir 10 min de incubação, a aspiração, e transferir-se através dos restantes dois Ca ^{2 +} soluções até que as células estão na solução 1,2 mM. Neste ponto, a maioria das células deverá ser em forma de haste miócitos.

5. medição na contração e cálcio Transitórios

1. Nota: Tanto a contratilidade e transientes de cálcio podem ser medidos simultaneamente.
2. Prepare Fura-2 AM solução por ressuspensão em DMSO anidro para uma concentração de 1 ug / uL. Solução de Fura-2 AM pode ser armazenado num exsicador a -20 ° C.
3. Carga 1 ml de células em suspensão com 1 ml Fura-2 AM. Permitir que as células se sentar no escuro 10 min, em seguida, aspirar o sobrenadante. Lavar duas vezes com uma solução de Ca2 ⁺ de Tyrode, permitindo que as células de granulação no escuro durante 10 min entre as lavagens.
4. Coloque uma lamela de vidro em uma inserção de estágio que permite pe aquecidarfusion / aspiração e eletrodo de andar com um estimulador campo miócitos. Coloque inserção fase em microscópio invertido configurado para medição de fluorescência, adicionando uma gota de óleo de lente se utilizando uma objectiva de imersão em óleo.
5. Configure perfusão gravidade aquecida com solução 1,2 mM de Ca2 ⁺ de Tyrode tão solução no palco atinge 37 ° C. Anexar aspiração a vácuo. Anexar eletrodos.
6. Ligue o sistema de microscópio, e abrir a fluorescência e aquisição de dados dimensionamento celular software ratiometric.
7. Adicione algumas gotas de células carregadas Fura-02:00 à inserção fase, bloqueando momentaneamente perfusão permitir que as células saudáveis ​​para resolver.
8. Use objectiva de 40x de localizar celular desejado. Uma célula saudável deve ser em forma de haste e não contrair espontaneamente. É visível e uniformemente contrato deve quando a célula é estimulada em 5-20 V.
9. Nota: a análise fisiológica requer uma digestão de alta qualidade. É possível ter células que parecem saudáveis, mas não fazer pa ce bem para análise fisiológica. Protocolo de digestão pode exigir refinamento para obter alta qualidade, os miócitos saudáveis. Além disso, corações mutantes ou doentes podem necessitar de modificações no protocolo.
10. Ajustar a rotação da lente e abertura mudança tão célula desejada está alinhada horizontalmente na tela e no fundo não é visível.
11. Alinhe bares detecção de bordas a cada final de miócitos e ajustar limite. Alinhar detecção sarcómero sobre uma porção de célula com sarcómeros uniformes. Quanto mais tempo você pode fazer este bar, mais preciso será o modelo matemático de comprimento do sarcômero será, desde que ele não esteja em duas populações de sarcômeros.
12. Células ritmo em 2 Hz e 5-20 V para 10-15 segundos antes de gravar.
13. Rastreamento Record. A luz ambiente deve ser minimizado para a melhor gravação de cálcio transiente.

6 Análise

1. Analisar os traços usando fluorescência ratiometric e dimensionamento de células software de aquisição de dados.

1. Este protocolo prevê excesso de células que podem ser usados ​​para uma variedade de outras experiências, incluindo: fixação e imunomarcação, avaliando os efeitos diretos da droga, a cultura de curto prazo, e microscopia de força atômica.

Uma vez que a contratilidade e traçados transitórios são coletados (Figura 2), os dados são facilmente analisadas com o software apropriado. Toda a rastreio, ou respectivas porções, pode ser calculada a média (Figura 3). Contractilidade pode ser analisado de uma variedade de maneiras. Para a função sistólica, pode-se avaliar a magnitude da contração com fração de encurtamento, ou a velocidade de contração com o tempo para atingir o encurtamento, e velocidade de contração. A função diastólica podem ser analisadas de forma semelhante com o tempo para 50% de encurtamento e velocidade de relaxamento. Para transientes de cálcio, os dados podem ser comparados semelhantes incluindo linha de base e pico de Fura-2 e os rácios de tempo para atingir o pico ou de linha de base (Tabela 8). Estas análises de fornecer dados comparáveis ​​de WT e KO corações em função contrátil celular sistólica e diastólica, bem como o fluxo de cálcio, qualquer um dos que poderiam ser alteradas em um coração com semelhante disfunção orgânica todo. Além disso, as células da mesma pode isolamentoser utilizado para outros experimentos como listados no protocolo, incluindo a coloração imuno-histoquímica (Figura 4).

Tabela 1 solução livre de cálcio de Tyrode - Reagents para 2 L da solução de Ca 2 + livre de Tyrode.

Tabela de cálcio solução de Tyrode 2. 1,2 mM - Reagentes para 2 L de estoque Ca 2 + 1,2 mMsolução.

Quadro 3 Tampão de Perfusão - reagentes para preparar tampão de perfusão no dia da experiência.

Tabela 4 Tampão A - Reagentes Tampão A para preparar no dia da experiência.

Tabela 5 Tampão B - Os reagentes para preparar tampão B no dia da experiência.

Tabela 6 Transferência de buffer - Reagentes para preparar buffer de transferência no dia do experimento.

Tabela 7 Enzima Digestão buffer - Reagentes para a preparação da enzima digestion tampão no dia da experiência.

Tabela 8 Contractility e cálcio transiente analisa. N = 5.

Figura 2 A) contração Amostralidade rastreamento representado pelo comprimento do sarcômero em função do tempo. transientes B) Amostra de cálcio representados por Fura-2 proporção em função do tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 A) rastreamento Média contratilidade após análise. B) Média de transientes de cálcio após análise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. coloração por imunofluorescência de citoesqueleto de cardiomiócitos (α-actinina).

Não temos nada a divulgar.