Cardiomiócitos individuais de camundongos selvagens e mutantes podem ser isolados do coração para estudar sua contratilidade e transientes de cálcio. Isso permite caracterizar a contribuição da disfunção celular para a disfunção cardíaca por qualquer causa.
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Artigo de método
Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os cardiomiócitos, a célula laboriosa do coração, contêm elementos citoesqueléticos e contráteis primorosamente organizados que geram a força contrátil usada para bombear o sangue. Os cardiomiócitos individuais foram isolados pela primeira vez há mais de 40 anos para melhor estudar a fisiologia e a estrutura do músculo cardíaco. As técnicas melhoraram rapidamente para incluir a digestão enzimática via perfusão coronariana. Mais recentemente, a análise da contratilidade e do fluxo de cálcio de miócitos isolados forneceu uma ferramenta vital na análise celular e subcelular da insuficiência cardíaca. A ecocardiografia e os eletrocardiogramas fornecem informações sobre o coração apenas no nível do órgão. Existem sistemas de cultura de células de cardiomiócitos, mas as células carecem de estruturas fisiologicamente essenciais, como sarcômeros organizados e túbulos T necessários para a função dos miócitos no coração. No protocolo aqui apresentado, os cardiomiócitos são isolados por perfusão de Langendorff. O coração é removido do camundongo, montado através da aorta em uma cânula, perfundido com enzimas de digestão e as células são introduzidas para aumentar as concentrações de cálcio. O software de detecção de bordas e sarcômeros é usado para analisar a contratilidade, e um corante fluorescente de ligação ao cálcio é usado para visualizar transientes de cálcio de cardiomiócitos eletricamente estimulados; aumentar a compreensão do papel que as alterações celulares desempenham na disfunção cardíaca. Tradicionalmente usado para testar os efeitos da droga nos cardiomiócitos, empregamos esse sistema para comparar miócitos de camundongos WT e camundongos com uma mutação que causa cardiomiopatia dilatada. Este protocolo é único em sua comparação de células vivas de camundongos com função cardíaca conhecida e genética conhecida. Muitas condições experimentais são comparadas de forma confiável, incluindo manipulação genética ou ambiental, infecção, tratamento medicamentoso e muito mais. Além dos dados fisiológicos, os cardiomiócitos isolados são facilmente fixados e corados para elementos do citoesqueleto. O isolamento de cardiomiócitos por perfusão é um método extremamente versátil, útil no estudo das alterações celulares que acompanham ou levam à insuficiência cardíaca em uma variedade de condições experimentais.
Introdução
Os cardiomiócitos fornecem a força contrátil para o coração. Cada miócito contém elementos citoesqueléticos e contráteis organizados essenciais para a contração. O coração não contém apenas cardiomiócitos, mas também fibroblastos, tecido conjuntivo e miócitos modificados, como as fibras de Purkinje. Alterações em qualquer um ou em todos esses tipos de células podem ser observadas na insuficiência cardíaca, dificultando a determinação da causa final da disfunção cardíaca. A diminuição da contratilidade ventricular de um coração com insuficiência cardíaca é precedida por graus variados de acúmulo de tecido fibroso e hipertrofia e disfunção dos cardiomiócitos1....
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Protocolo
Certifique-se de todos os procedimentos que envolvem animais são aprovados pelo uso de animais apropriados e cuidados com o corpo.
1 Prepare Banco Buffers em adiantado
- Prepare 2 L estoque de Ca2 + de Tyrode livre (Tabela 1). Ajustar o pH para 7,4 com NaOH.
- Prepare 2 L estoque 1,2 mM de Ca2 + Tyrode (Tabela 2). Ajustar o pH para 7,4 com NaOH.
2 No dia do experimento, Prepare Perfusão, Transferência e Digestão Buffers
- Prepare tampão de perfusão de 150 ml em Ca 2 + de Tyrode livre (Tabela 3) e....
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Resultados
Uma vez que a contratilidade e traçados transitórios são coletados (Figura 2), os dados são facilmente analisadas com o software apropriado. Toda a rastreio, ou respectivas porções, pode ser calculada a média (Figura 3). Contractilidade pode ser analisado de uma variedade de maneiras. Para a função sistólica, pode-se avaliar a magnitude da contração com fração de encurtamento, ou a velocidade de contração com o tempo para atingir o encurtamento, e velocidade de contração. A função diast.......
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Discussão
Isolamento de cardiomiócitos de qualidade requer um certo nível de prática e de otimização. Este protocolo contém passos-chave que podem afetar significativamente o resultado da digestão. Estes devem ser considerados com cuidado na realização e solução de problemas do protocolo. O tempo de remoção do coração de canulação e perfusão deve ser minimizado, de preferência menos do que cinco minutos. Lavar o coração imediatamente em tampão de perfusão gelada após a remoção a partir do rato e dissecando e canulação do coração .......
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Marc Wozniak para o uso do Departamento de celular e Developmental Biology videografia equipamento.
Universidade Vanderbilt imagens de células recurso compartilhado.
Este trabalho é apoiado pela AHA concessão 12PRE10950005 de ERP, AHA concessão 11GRNT7690040 a DMB, NIH concessão R01 HL037675 a DMB. DMB é o Presidente Gladys P. Stahlman no Cardiovascular Research.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| NaCl | RPI | S23020 | |
| KCl | Sigma | P-3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M-8266 | |
| HEPES | EM Science | S320 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2· 2H2O | Fisher | C79 | |
| D-(+)-Glicose | Sigma | G7528 | |
| 2,3-Butanodiona-monóxido (BDM) | Sigma | B-0753 | |
| Taurina | Sigma T-0625 | ||
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma | A-7030 | |
| Colagenase B | Roche Diagnostics | 1-088-823 | |
| Colagenase D | Roche Diagnostics | 1-088-882 | |
| Protease XIV | Sigma | P-5147 | |
| Heparina | APP Pharmaceuticals, LLC | 401586D | |
| Isofluorano | Butler Schein | 11695-6776-2 | |
| Fura-2 AM | Teflabs | 103 | |
| DMSO - Sigma | anidro 276855 | ||
| Estimulação celular IonOptix e sistema de análise fluorescente | IonOptix | ||
| 250 μ m filtro de malha de nylon | Sefar America | Lab Pak 03-250/50 | |
| 23 G Adaptador Luer-stub | Becton Dickinson | 1482619E | |
| PE-50 tubulação | Becton Dickinson | 427410 |
Referências
- Babick, A. P., Dhalla, N. S. Role of Subcellular Remodeling in Cardiac Dysfunction due to Congestive Heart Failure. Medical Principles and Practice. 16, 81-89 (2007).
- Nogami, A. Purkinje-Related Arrhythmias Part I....
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Reimpressões e permissões
