Isolamento e Cultura de rato adulto Cardiomyocytes de sinalização celular e In vitro A hipertrofia cardíaca

Os cardiomiócitos não proliferativa. Existem algumas linhas celulares de cardiomiócitos atriais, como HL-1 e AT-1 de células derivadas de tumores de ratinho atrial; no entanto, não há linhas de células de cardiomiócitos ventriculares adulto disponíveis para pesquisa. Culturas de células primárias de cardiomiócitos adultos rato fornecer um modelo poderoso para a pesquisa do coração nos níveis celulares e moleculares. Até à data, têm sido amplamente utilizados para bioquímicos, fisiológicos e farmacológicos de pesquisa ^1. Além disso, o uso frequente de camundongos geneticamente modificados exigiu métodos eficazes de isolamento de cardiomiócitos. Cultura pura permite condições livres de interação com outros órgãos e da circulação sistêmica, como através de fatores endógenos neuro-hormonais e hormônios como ^2,3. No entanto, isolamento de cardiomiócitos pode ser um desafio.

O protocolo apresentamos aqui é baseada em nossas experiências com cardiomyocyt rato adultoes e o método descrito por O'Connell et al ^4,5. Especialmente em 2007 ^5, descreveram técnicas detalhadas de preparações de buffer para cultura de células e ensaio funcional. Desde miócitos rato são altamente suscetíveis a contratura em comparação com os cardiomiócitos de ratos, os tampões ou mídia usada para a perfusão, a digestão, Ca ^{2 +} tolerância, chapeamento e cultura no protocolo do mouse são complementadas com um inibidor de acoplamento excitação-contração inespecífica, 2, 3-butanodiona monoxime (BDM) para inibir a contracção espontânea, por conseguinte, a viabilidade e produtividade de miócitos em forma de bastonete, melhorar significativamente. No protocolo introduzido aqui, os miócitos são separados num tampão de alto teor de potássio do coração isolado por perfusão de Langendorff modificado com colagenase tipo II. Colagenase II rompe de forma eficaz para baixo da matriz intercelular e as células libera. A solução de perfusão também mantém o metabolismo celular a um nível baixo ^6. Em comum, além, o sistema de coração isolado de Harvard Apparatus usamos aqui é bem projetado para a temperatura precisa e controle de pressão constante ^7. Esta abordagem proporciona preparações altamente reprodutíveis e populações uniformes de tipo de célula única, que pode ser utilizado na cultura de uma noite para a medição de proteínas de sinalização ou de cultura de 2-3 dias para ensaios hipertróficas cardíacas.

Toda a pesquisa em ratos foi feito de acordo com os procedimentos e diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde, e os protocolos foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use, da Universidade de Toledo, da Faculdade de Medicina e Ciências da Vida.

1. Perfusão de preparação do sistema

1. No dia antes do isolamento, preencher todo o sistema de perfusão (incluindo reservatórios) com uma solução de detergente alcalina livre de resíduos rápido. Permitir que a solução para absorver no sistema por algumas horas ou durante a noite.
2. Na manhã seguinte, ajustar a temperatura termociclador a 37 ° C e deixar a solução para aquecer. Remover a solução de detergente e lave o sistema cuidadosamente com água destilada esterilizada. Não se esqueça de todos os ramos laterais.
3. Encha o sistema com tampão de perfusão através de uma bomba peristáltica constante e tirar qualquer bolha de ar para fora da câmara de aorta (bolha armadilha) com uma seringa montado na lateral para protegero coração de oclusão coronária. A taxa de fluxo da bomba peristáltica deve ser verificada rotineiramente.

2. Preparação de Amortecedores, Meios de Cultura, e pratos

1. Perfusão Tampão: Fazer 500 ml de tampão de perfusão 1x antes de usar. Este tampão isento de cálcio contém NaCl 113 mM, KCl 4,7 mM, 0,6 mM, KH ₂ PO _4, 0,6 mM de Na ₂ HPO _4, 1,2 mM _MgSO4, 10 mM de Na-HEPES, 12 mM de NaHCO _3, 10 mM KHCO _3, 0,032 mM, vermelho de fenol, 30 mM de taurina, BDM 10 mM, e glucose 5,5 mM. Ajustar o pH para 7,0 com HCl 2 M e filtrar através de um filtro de 0,2 mM, armazenar a 4 ° C.
   Nota: a) A solução de perfusão devem ser preparadas no mesmo dia em que é usado. Em alguns casos, é aceitável para conservar a solução em menos de 3 dias a 4 ° C. b) Este tampão tem uma concentração de potássio de alta até 15,3 mm, o que pode manter os cardiomiócitos quiescente, reduzir ATP consumo e aumentar a capacidade de Ca ^{2 +-tolerante.}
2. Digestão Buffer (300 U / mL, 25-50 mL / coração): preparar imediatamente antes da perfusão. Pesar 15.000 U de atividade total de colagenase tipo II, dissolver em 50 ml de tampão de perfusão na capa cultura. Adicionar 25 ul de 100 mM CaCl ₂ (solução de estoque, filtro esterilizado) para que a concentração final de cálcio 50 uM. Aquecer o tampão a 37 ° C, quando pronto para isolamento. Ao contrário de tripsina, colagenase funciona melhor na presença de 50-100 uM de Ca ^{2 +.}
3. Parar Buffer (50 ml / coração): Operar em capa de cultura. Misturar 45 ml de tampão de perfusão com 5 ml de FBS estéril.
   1. Ca ^{2 +} solução de I (12,5 uM de Ca ^{2 +):} Adicionar 2,5 mL de 100 mM de CaCl ₂ a 20 ml de tampão de paragem e misturar.
   2. Ca ^{2 +} solução II (100 uM de Ca ^{2 +):} Adicionam-se 10 ul de 100 mM _de CaCl2 a 10 ml de tampão de paragem e misturar.
   3. Ca ^{2 +} solução de III (400 ^ M de Ca ^{2 +}): Adicionar 40 ul de 100 mM _de CaCl2 a 10 ml de tampão de paragem e misturar.
   4. Ca ^{2 +} solução de IV (900 ^ M de Ca ^{2 +):} Adicionar 90 ul de 100 mM _de CaCl2 a 10 ml de tampão de paragem e misturar.
4. Galvanização meio (50 ml / coração): Transferência 43 ml de MEM contendo 2 mM L-glutamina e 1,26 mM CaCl ₂ em um tubo cônico de 50 ml estéril na capa de cultura e adicionar 5 ml de FBS, 1 ml da solução de BDM ( 500 mM, esterilizado por filtração), e 0,5 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml). Misture e equilibrar durante 2-3 horas antes do isolamento dos miócitos em 2% de CO _2, 37 ° C incubadora com as tampas soltas. Logo antes dos miócitos chapeamento, adicionar 0,5 mL de ATP 200 mM (pH 7,2, solução de estoque, filtro esterilizado) para o meio.
5. O meio de cultura (50 ml / coração): Transferência de 48 ml de MEM contendo 2 mM de L-glutamina e 1,26 mM de _CaCl2 para um tubo cónico de 50 ml estéreis em capa de cultura e adicionar 1 ml de uma solução de estoque de BDM (500 mM, filter esterilizada), e 0,5 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml). Misture e equilibrar em 2% de CO _2, 37 ° C incubadora antes do isolamento dos miócitos. Antes de usar, adicionar 0,5 mL de 100 mg / ml de BSA (esterilizado por filtração) para o meio.
   Nota: O uso de 2% de CO ₂ incubadora facilita a manutenção do meio de cultura de pH 6,9-7,0, o que ajuda a manter as myoctyes sua morfologia em forma de haste até 24 horas.
6. Laminin (1-2 mg / cm ²⁾ pratos ou placas revestidas de transferência: 200 ul de 1 mg / ml de laminina rato natural para 20 ml de PBS esterilizado (w / o cálcio e magnésio) e misturar. Adicionar 1 ml de pratos de 35 mm, 2,5 ml para pratos de 60 mm, ou 5 ml para pratos de 100 mm, agite para cobrir uniformemente a superfície, e coloque em 2% de CO _2, 37 ° C incubadora até miócitos chapeamento.
   Nota: Se os pratos ou placas não são utilizados no dia revestido, que pode ser selado com Parafilm e armazenado a 4 ° C durante a noite (Revestimento lenta). Vedação é required para impedir evaporação ou contaminação. Placas revestidas podem ser mantidas a 4 ° C durante até 1 semana.

3. Remoção Rato Coração e Canulação

1. Mergulhe as tesouras e pinças em etanol 70% por 30 minutos e deixe-os secar.
2. Pesar o mouse para a 0,1 grama mais próximo. Grave o seu peso corporal, tensão, sexo e data de nascimento.
3. Injectar 200 ul de heparina (100 IU / ratinho) ip 10 minutos antes da anestesia para impedir a coagulação do sangue nas artérias coronárias. Anestesiar o rato com 200 mg / kg de peso corporal de cetamina e 10 mg / kg de peso corporal de xilazina por injecção ip e esperar por 5-10 min, até que o rato deixa de responder a beliscões cauda / toe.
4. Fixe o rato na posição supina, fixando suavemente as patas dianteiras e patas traseiras para uma superfície de trabalho pinnable (ou seja, isopor) em uma bandeja de cirurgia animal ou banco mesa perto do sistema de perfusão.
5. Limpe o peito e abdômen com etanol 70%. Faça uma pele i linha médiancision a partir de meados do abdômen para o diafragma com uma tesoura cirúrgica.
6. Corte o diafragma com uma outra tesoura cirúrgica e mantenha o esterno com uma pinça serrilhadas curvas. Corte bilateralmente e retroflect caixa torácica para expor o coração.
7. Levante o coração um pouco com a pinça serrilhada e atraumáticas curvas finas e dissecar o coração para fora da cavidade torácica, o mais próximo possível para dorsal da parede do tórax.
8. Transferir o coração para uma placa de 100 mm, contendo tampão de perfusão a frio. Corte com cuidado fora os tecidos conjuntivos, como pulmões, timo e brônquios.
9. Identificar a aorta e seus ramos cranianos, que geralmente são escondidos por timo e gordura abdominal. Corte a aorta abaixo de sua primeira filial ^13, segure a parede da aorta, levante o coração, e um pouco colocá-lo para a cânula aórtica cheio de líquido de perfusão (1,0 mm de diâmetro externo da cânula de aço inoxidável com ponta romba / plano e entalhes 1 e 2 mm acima a ponta, ou um G agulha de alimentação reutilizável 22) usando dois ultra-fina com ponta forceps.
   Nota: a) O fluido de perfusão deve ser gotejamento durante punção cardíaca para evitar que as bolhas de gás de entrar nas artérias coronárias; b) manter a ponta da cânula imediatamente acima da válvula da aorta.
10. Prender a aorta para a cânula e ligar a aorta para a cânula com seda 6-0 cirúrgico. Toda a punção deve levar menos de 120 segundos.

4. Coração de perfusão e Digestão

1. Perfundir o coração com tampão de perfusão isenta de cálcio no caudal de 4 ml / min 4-5 min até que os efluentes se claro, em seguida, mudar para tampão de digestão contendo 50 mM de _CaCl2 e perfuse para 3,5-20 min dependendo do mouse tensão, pressão de perfusão e atividade da colagenase. Se for o caso, aumentar a pressão para 70-80 mmHg aorta quando digerir. Quando necessário, perfusato enzima pode ser recirculado para a digestão. Tipicamente, o tampão U / ml de enzima 300 irá digerir um coração em 10-12 min a um caudal de 4 ml / min;Se aplicar pressão diastólica em 70 mmHg, 300 U / ml terá apenas 3,5-5,5 min, a um caudal de 4 ml / min.
2. Pare de digestão quando o coração se torna um pouco pálido e flácido. Deve ser esponjoso quando beliscou suavemente.

5. Células dissociação e reintrodução de cálcio

1. Puxe a aorta da cânula com 70% fórceps encharcada de álcool e colocar o coração em uma estéril prato de 60 mm contendo 2,5 ml tampão de digestão. Mover para a capa de cultura de uso de suprimentos estéreis, permanecendo consciente de técnicas estéreis para esta e as etapas de acompanhamento.
2. Remover aorta, átrios e grandes vasos com tesouras cirúrgicas finas. Gentilmente provocar o ventrículo em 10-12 pedaços pequenos com duas pinças de ponta fina.
3. Pipeta suavemente os pedaços do coração e células cima e para baixo ~ 10x com uma pipeta de 10 ml e depois transferir para um tubo cônico de polipropileno de 15 ml. Lave o prato com a solução de 7,5 ml de cálcio I contendo 12,5 mM _CaCl2 e transferênciaeste para dentro do tubo, resultando num volume final de 10 ml.
4. Pipeta suavemente a suspensão de células para cima e para baixo, usando uma pipeta de transferência de ponta fina para dispersar os grandes pedaços de tecido do coração.
5. Em seguida, centrifuga-se durante 3 min a 20 x g para separar as células não-miócitos pequenas tais como as células endoteliais e fibroblastos.
6. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de miócitos em 10 ml de solução de cálcio I, com um suplemento de 100 ul de ATP 200 mM (pH 7,2, solução de estoque, filtro esterilizado). Deixe o tubo na capa para 3-5 min.
7. Transferência duplicar 10 mL alíquotas a um hemocitômetro para contar miócitos e volta em forma de bastonete. Calcule o número total de miócitos e calcular a percentagem de miócitos em forma de bastonete.
8. Centrifugar os miócitos durante 3 min a 20 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender as pastilhas em 10 mL de cálcio II solução contendo 100 mM de CaCl _2. Dispersar os miócitos com a transferência pipeta de ponta fina pipetandocima e para baixo.
9. Repetir o passo acima (5,8), utilizando uma solução de cálcio III (400 ^ M de _CaCl2) e IV (900 uM de CaCl _2), respectivamente.
10. Para rato miócitos cultura primária, ressuspender o sedimento miócitos final em 5 ml de chapeamento médio. Contar o número total de miócitos e calcular a percentagem de miócitos em forma de bastonete.

6. Cultura celular

1. Ajustar a concentração de miócitos em forma de bastonete de 25.000 em forma de bastonete miócitos / ml para um tubo de 50 ml. Pipeta suavemente os miócitos com uma pipeta de 10 ml para suspendê-las bem. Evite sedimentação celular na pipeta e tubo para garantir a densidade de células iguais para cada prato ou prato.
2. Após aspiração fora da solução de revestimento laminina, placa miócitos para os pratos ou placas. Deslize suavemente os pratos ou placas frente e para trás e de lado a lado em um padrão de cross-como três a quatro vezes na superfície do capô cultura.
3. Coloque os pratos ou placas de CO 2%₂ incubadora a 37 ° C. Incubar durante 1-3 horas para permitir a ligação de miócitos, a uma taxa de cerca de 80%.
4. Depois de penhora, aspirar cuidadosamente fora do meio contendo miócitos solto e restos celulares. Adicionar cuidadosamente o meio de cultura para os lados dos pratos ou placas. Realize esta uma mudança meio por um. Retornar imediatamente os pratos ou placas para a incubadora.
5. Após a cultura D / O, os miócitos pode ser alterado para o mesmo meio, sem BDM antes dos estudos de sinalização de células de curto prazo. Mantenha o BDM na cultura de longo prazo para os ensaios hipertróficas ou apoptose.
   Nota: BDM (2,3-butanodiona monoxime) pode inibir a miosina-ATPase e prevenir a contração. A sua inibição da contração à base de miosina é prontamente reversível. É relatado que BDM pode ter alguns efeitos colaterais, tais como agir como uma fosfatase não específica, aumentando a liberação de cálcio do RS, e alteração da concentração de cálcio livre e prope elétrica celularrties, portanto, antes do tratamento, a BDM deve ser removido. Além disso, em alguns casos, uma miosina II Blebbistatin inibidor específico pode ser uma alternativa para inibir a contracção dos cardiomiócitos ^8,9. No entanto, em nossos casos, BDM é melhor do que Blebbistatin por causa da qualidade e quantidade dos cardiomiócitos.

1. Quantificação de isolamento bem sucedido

Dois critérios são utilizados para quantificar o sucesso do isolamento: em primeiro lugar, o número total de cardiomiócitos isolados, e em segundo lugar, a proporção de cálcio-tolerante para arredondar miócitos não tolerantes em forma de bastonete. Geralmente este protocolo leva em torno de 75-90 min de remoção coração para chapeamento de miócitos e os rendimentos em torno de 1 milhão de cardiomiócitos em forma de bastonete (70-90% de miócitos total colhida) de um coração adulto mouse. Isso pode variar de acordo com o peso corporal do rato e tensão. Normalmente, 0,7-1,0 milhões de miócitos em forma de bastão pode ser recolhida a partir de um 25 g ~ rato C57BL/6J, 1,2-1600000 miócitos em forma de bastonete de um ~ 35 g preto rato suíço, e 0,7-1.200.000 miócitos em forma de bastonete pode ser recolhidos a partir de um g Na / K-ATPase heterozigotos ~ 30 (α1 S / R) 10 ou 22 g ~ cardíaca específica NCX-KO rato 11. Miócitos isolados normalmente têm uma haste em forma distinta, com extremidades retangulares e claras transversais estrias,mostrado na Figura 1.

2. Identificação Função celular

Os dados anteriores mostraram claramente que, em culturas de cardiomiócitos de ratos neonatais, 100 uM de ouabaína pode activar Akt fosforilação PI 3 K-dependente e induzir a hipertrofia 12. Para confirmar ainda mais esses resultados em cardiomiócitos de ratinho adulto, os cardiomiócitos de rato adulto C57BL/6J foram cultivadas e tratadas com ouabaína. Figuras 2 e 3 mostram claramente que a ouabaína pode aumentar a fosforilação de Akt de uma maneira dose-dependente e induzir a [3H]-leucina incorporação durante a síntese de proteínas.

Figura 1. Cardiomiócitos em forma de bastonete normais de Black rato Swiss depois durante a noitecultura. Miócitos foram fotografados sob microscopia de contraste de fase utilizando o software de fotografia.

Figura 2. Activação de Akt por ouabaína em cardiomiócitos cultivados C57BL/6J adulto rato. Miócitos foram expostos a 0-50 ^ M de ouabaína para 5 minutos, e os lisados ​​foram ensaiados para fosforilada (Ser 473) Akt (p-Akt) e Akt por western borrões. A activação foi quantificada como a proporção de Akt fosforilada total de (n = 5-10). * P <0,05 vs controlo, ** P <0,01 vs controlo.

Figura 3. Ouabain estimula a síntese de proteína em cultura de cardiomiócitos de rato adulto C57BL/6J Após a privação de soro de 4 horas, os miócitos foram tratados com as condições indicadas, na presença ou ausência de ouabaína ou 100 nM de ET-1 (controlo positivo) em conjunto com [3H]. - leucina (1 uCi / ml) durante 12 horas. Os lisados ​​celulares foram precipitados com TCA a 5% e novamente suspensas em 0,2 M NaOH/0.1% SDS e a radioactividade foi contada num contador de cintilação. A síntese de proteína por cada amostra foi calculada de cpm / mg de proteína e normalizado em relação ao controlo.

Tabela 1. Soluções / buffers para cardiomiócitos de rato adulto isolamento.

Tabela 2. Banco de preparação e armazenamento de solução para adulto rato cardiomiócitos isolamento e cultura.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.