Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

O câncer é uma doença muito complexa, que tem sido objeto de estudos há mais de séculos. O câncer de mama é o tipo de câncer mais comum; ela ocorre predominantemente em mulheres, mas esporadicamente também pode ocorrer em homens ^27. A doença é provocada, principalmente, pela perda de divisão celular governar mecanismo de controlo que por sua vez leva a um crescimento infinito de células no corpo. Estas avarias podem ser causados ​​por vários mecanismos: primeiro, as células saudáveis ​​necessitam de sinais de crescimento das células vizinhas, de modo a proliferar enquanto que as células do cancro tornam os seus próprios factores de crescimento e aumentar a expressão de receptores do factor de crescimento obtendo-se assim uma taxa de proliferação mais elevada ^1; segundo, as células cancerosas são menos suscetíveis aos sinais anti-proliferativa ^8; em terceiro lugar, para equilibrar o número de células no processo de morte celular do corpo é também necessário; no entanto, as células cancerosas escapar da morte celular programada, designada apoptose ^14; em quarto lugar, as células aderem à matriz extracelulara fim de sobreviver, mas as células tumorais podem crescer sem a necessidade de fixação e apresentam resistência a anoikis ^19; em quinto lugar, a activação da telomerase contorna o encurtamento dos telómeros e evita a senescência replicativa ^21; por último, mas não menos importante, saltando de DNA controle de qualidade após os resultados de mitose no conteúdo genético alterado ^15,16. A fim de identificar os oncogenes ou supressores de tumor, que desempenham um papel neste proliferação desregulada, experiências de crescimento tumoral em ratinhos são cruciais.

Crescimento do tumor primário geralmente não é o principal motivo da morte. A migração de células de cancro do local primário para um local secundário, denominado metástase, é a principal causa de morte na maioria dos doentes com cancro ^22. Metástase implica invasão das células tumorais, intravasation, viajando através da circulação, evitando ataque imunológico, o extravasamento e crescimento no site secundário. Epitelial para mesenquimal (EMT) é um processo chave nametástase e envolve uma mudança no perfil de expressão produzindo células com maior mobilidade e capacidade de invasão, que são pré-requisitos para a célula metastasizing ^12. Como o processo canceroso é o resultante de uma combinação de várias acções, incluindo as interacções recíprocas entre as células cancerosas, células estromais e células pró e anti-inflamatórios, uma abordagem in vitro para o cancro, muitas vezes não fornecer uma visão completa do o processo cancerígeno. Da mesma forma, os tratamentos anti-cancerígenos que afectam a vasculatura do tumor muitas vezes não pode ser estudado in vitro, assim, a utilização de abordagens in vivo é inevitável.

Para estudar a progressão do câncer de mama, foram desenvolvidos diferentes métodos experimentais. O modelo mais largamente utilizado é a injecção subcutânea de células de cancro da mama em ratinhos ^5. Nesta montagem experimental, o investigador pode apresentar uma ampla gama de alterações a uma linha celular de escolha in vitro (isto é,supra-regulação, a regulação negativa de proteínas) e injectar as células sob a pele. Embora este método seja simples e o processo de injecção é simples, sem qualquer necessidade de se realizar a cirurgia em ratos, o local em que o tumor é injectado não representa o ambiente do tumor mamário local e a ausência desse ambiente pode resultar no desenvolvimento de cancro da mama que difere da observada em patologia humana. Em segundo lugar, ratos geneticamente modificados são usados ​​com freqüência como uma ferramenta in vivo para estudar a progressão do câncer de mama. Neste modelo, oncogene (ou seja, PyMT, Neu) a expressão é conduzida por um promotor específico de tecido mamário que conduz à formação espontânea de tumores da mama s. Esta configuração experimental é útil para estudar o aspecto do tratamento da doença pelo uso de drogas injetáveis ​​ou anticorpos ao verificar o tamanho do tumor em tempo ^3. No entanto, a criação destes ratos com outras linhagens de camundongos deficientes ou mutantes em um gene de interesse pode também dar-insights para o papel de proteínas diferentes no crescimento do tumor da mama ^24. A desvantagem deste modelo é que ele está propenso a variação no tamanho do tumor e número. Além disso, o nível de expressão do transgene depende do local de integração no genoma e pode mudar de uma estirpe de ratinho para outro ^4. Neste modelo, a expressão do transgene pode ser conseguida por todas as células com origem epitelial enquanto que na doença humana, só uma subpopulação de células expressam o oncogene ou infra-regular os níveis de supressão tumoral ^26. Para estudar a metástase, células de cancro da mama também pode ser injectado por via intravenosa (um modelo denominado metástase experimental) ^25. No entanto, esta abordagem apenas recapitula o processo metastático parcialmente; isto evita a necessidade de células tumorais para invadir e intravasate, e começa a partir do ponto em que as células tumorais são prontamente presentes na circulação.

Em nosso trabalho, nós usamos uma injeção orthotopicion modelo para estudar o envolvimento de genes de interesse na progressão do cancro da mama ^13. Nós overexpress a proteína em células de câncer de mama humano e injecta-se na almofada de gordura mamária de NOD / SCID gamma (NSG) camundongos. Este método é vantajoso em muitos aspectos: ela permite que as mudanças genéticas muito rápidos e diversificados na linha de células injetadas, que abrange todo o processo de progressão do cancro da mama de crescimento do tumor primário à metástase em locais patologicamente relevantes, e também fornece um bom modelo experimental para estudar o impacto de tratamentos terapêuticos em estágios precoces ou tardias da doença. Além disso, a utilização deste modelo pode-se investigar o papel do estroma contra proteínas derivadas de células de cancro na progressão da doença, utilizando ratos ou células geneticamente modificadas. Embora injecções subcutâneas são mais fáceis de executar, os modelos ortotópicos dar origem a uma população de células de cancro mais tumorigénico e mais metastático. Assim, os resultados obtidos por meio da injecção subcutâneas pode ser falso-negativos ou falso-positivo ^6,17 incentivando o uso de modelos ortotópicos para estudar o crescimento do tumor.

Experimentos em animais foram aprovados pelo comitê de bem-estar dos animais do Centro Médico da Universidade de Leiden (LUMC).

1. Preparação de células, instrumentos e Ratos

1. Um dia antes da operação, raspar a / SCID gamma (NSG) camundongos NOD a partir do quarto mamilo até a linha média e pesar os ratinhos para verificar se todos os ratos têm pesos mais ou menos comparáveis.
2. Autoclave uma tesoura, duas pinças e duas pinças de mosquito retas (Figura 1A).
3. No dia da operação, lavar o adenocarcinoma da mama humano (MDA-MB-231), as células que irão ser injectados uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4 e as células trypsinize. Extingue-se a tripsina por adição de 10 mL contendo soro de meio DMEM por cima das células. Centrifuga-se as células a 1.200 rpm durante 7 minutos à temperatura ambiente para remover o soro por ressuspensão das células quer em PBS ou em meios sem soro. Centrifuga-se de novo para remover vestígios de soro completamente. Ressuspender as células em PBS oumídia.
4. Contar as células com um hemocitómetro e calcular a quantidade de células. Use 500.000 células / rato em não mais de 150 mL. Facultativo à PBS ou mídia, voltar a suspender as células em matrigel.
   NOTA: Determinar a quantidade de células, dependendo do tipo de células utilizado.
5. Coloque as células em uma estéreis microtubos e mantê-los no gelo.
6. Encher um tubo de centrífuga de 50 mL cónico com 35 ml de PBS pH 7,4 e um outro tubo de centrífuga cónico de 50 mL com etanol a 70%. Mergulhe cotonetes para cada tubo.

2. Injecção ortotópico

1. Realizar a cirurgia num hote estéril para manter um ambiente estéril. Anestesiar o rato por injecção subcutânea mistura xilazina / cetamina na dose de 10 mg / kg, 100 mg / kg de peso corporal, respectivamente. Corrigir o mouse sobre uma almofada de aquecimento. Confirme o sucesso da anestesia com a falta de reação aos pés pinch.
   NOTA: Se a pessoa não está muito familiarizado com os procedimentos cirúrgicos, a cirurgia pode demorar mais tempo. Organizaras doses de acordo com a anestesia.
2. Aplicar pomada oftálmica nos olhos de ratos, para evitar que os olhos sequem.
3. Limpe a área raspada, usando o cotonete embebido em álcool preparado no passo 1.6. Alternando esfrega usando betadine e álcool três vezes em uma forma circular rotativo para longe do local da incisão prevista deve ser realizada. Alternativamente, usar ionóforo como um desinfectante.
4. Faça uma pequena incisão entre o quarto mamilo e da linha média com uma tesoura e fazer um bolso, inserindo o cotonete umedecido com PBS pH 7,4.
5. Utilize uma pinça para expor a almofada de gordura mamaria. Observe a almofada de gordura por sua cor branca.
6. Aperte a almofada de gordura com a outra pinça de sua base; ao fazer isso, expor totalmente a almofada de gordura (Figura 1B) para realizar injecções facilmente.
7. Homogeneizar a mistura de células por pipetagem cima e para baixo. Suavemente aspirar 50 ul de suspensão de células para uma seringa de insulina e injectara almofada de gordura mamaria, mantendo a agulha horizontalmente. Confirme injeção bem-sucedida verificando para o inchaço da camada de gordura.
8. Solte suavemente a almofada de gordura.
9. Suturar a incisão utilizando um controlador de agulha. Faça três lances girando a sutura ao redor do motorista agulha no sentido horário, anti-horário e sentido horário. Dois nós por a sutura deve ser usado.
   NOTA: Certifique-se os nós estão apertados em contrário camundongos pode abrir as suturas.
10. Após a cirurgia, injectar um analgésico, tal como a Temgesic 0,05-0,1 mg / kg de peso corporal, por via subcutânea, a fim de aliviar a dor.
11. Não deixar os animais sozinhos até que ganhem consciência e manter decúbito externo. Coloque todos os animais em gaiolas diferentes, até que sejam totalmente recuperado.
12. Para manter a esterilidade, utilize gaiolas autoclavados e água. Altere as gaiolas cada três dias para manter o ambiente limpo.

3. Extraindo Órgãos para Análise

1. Nodia da colheita, 8 semanas após a implantação das células, preencher 15 ml tubos de centrifugação cónicos com 3 ml de solução de Bouin para cada rato. Além disso, usar dois tubos de 15 ml contendo 5 ml de solução de formol por mouse.
2. Anestesiar os animais por injecção de xilazina / cetamina, a uma dose de 10 mg / kg 100 mg / kg de peso corporal por via subcutânea. Aguarde até que o animal perde toe retirada pitada reflexo.
3. Corrigir o animal com agulhas em uma base. Faça, uma incisão na linha média longo vertical com uma tesoura. Faça duas incisões horizontais logo abaixo da perna da frente e acima da perna de trás. Expor o tumor fixando a pele para a base. Medir o volume do tumor, utilizando um compasso de calibre.
4. Dissociar o tumor da pele com uma tesoura. Encaixe congelar uma parte do tumor em azoto líquido para o isolamento de ARN. Coloque a outra parte, para o tubo de centrífuga cónico preenchidos com formol para realizar imunohistoquímica seguinte inclusão em parafina.
5. Gentilmente tirar os pulmões. Coloque apulmão esquerdo em solução de Bouin. Manter o pulmão em solução durante 3 dias. Observe focos metastáticos superficial claramente a olho nu. Opcionalmente, coloque o pulmão direito em formol para verificar micrometastasis usando hematoxilina e eosina (H & E) coloração.
   NOTA: Embora, metástase pulmonar observado com freqüência em câncer de mama, a pessoa também pode querer recolher ossos, fígado, cérebro e do baço para analisar metástase. As células na área metastático são mais densas e morfologicamente diferentes e, portanto, pode ser facilmente distinguida do tecido do pulmão.
6. Um dia após a colheita, aspirar a solução de formol a partir de tubos de 15 ml e substituir com etanol 70%. Incorporar os tecidos em parafina e realizar estudos de imuno-histoquímica.
7. Para a análise de sangue, abrir a cavidade torácica com uma tesoura. Retirar 450 sangue ul via punção cardíaca. Coloque amostra de sangue num tubo de microcentrífuga contendo 50 ul de citrato de sódio a 3,2%. Após coletar o sangue, girá-lo a 2.000 xg por 10 min. Armazenar as amostras de plasma a -20 ° C até à sua utilização.
   NOTA: Existem várias outras técnicas de coleta de sangue geralmente utilizados na prática ^{de 20} ea técnica que precisa ser usado depende de configuração experimental e escolha do cientista. Se a amostra de sangue não é necessário, sacrificar o animal de acordo com o protocolo do animal ou de acordo com as orientações da instituição.

A aplicação bem sucedida do "modelo ortotópico de cancro da mama" é baseado na injecção de células adequada na almofada de gordura mamaria. Erros experimentais, tais como a inoculação de células imprecisa ou vazamento pode conduzir a variações no tamanho do tumor ou mesmo a ausência de um tumor o que leva à formação de uma estrutura semelhante à procura de uma almofada de gordura mamária injectado com um tampão de controlo (Figura 2A). A taxa de crescimento do tumor é dependente da natureza da linha de células injectadas e, em geral, pode ser observado através da pele dos ratinhos (Figura 2B). Ao contrário de experiências in vitro, a taxa de crescimento das células tumorais pode não ser constante em tempo in vivo (Figura 2C). Devido à hipoxia e à falta de nutrientes, as áreas necróticas podem formar e estes domínios irão afectar a taxa de crescimento do tumor (Figura 2D). Além disso, o gene de interesse pode impactar uma certa fasede progressão do câncer (cedo ou tarde), dependendo, portanto, a configuração experimental, o crescimento do tumor pode começar rápido, mas desacelerar no final ou vice-versa.

Cuidados devem ser tomados durante o processo de remoção do tumor; manuseamento rigoroso podem afectar a estrutura do tumor e leva a problemas na análise imuno-histoquímica. A área ao redor do tumor pode apresentar grandes vasos que surgem a partir de remodelação vascular. Estes vasos desempenham um papel crucial na remoção de resíduos e fornecer o tecido do tumor com nutrientes e oxigénio, e facilitando assim o crescimento do tumor (Figura 2B). A formação de neovasos (angiogénese) pode ser investigada por coloração do tumor para os marcadores neovessel (isto é, CD31, CD34).

Recolha dos pulmões em solução de Bouin ajuda a visualizar superficial focos metastáticos nos pulmões (Figura 3A). Os focos podem ser distinguidas a partir de tecido pulmonar por meio da uma cor pálidad são fáceis de detectar 18. A metástase pode ser expressa como o número de focos formados na superfície do pulmão. No entanto, a formação de focos é dependente linha de células; células não agressivas dar origem a micrometastasis só ou nenhuma metástase em tudo. Micro metástase pode ser facilmente identificadas com uma coloração de hematoxilina / eosina em tecido pulmonar embebidos em parafina (Figura 3C).

Figura 1: Materiais e Métodos. (A) equipamentos cirúrgicos necessários para a injecção de células de cancro da mama na almofada de gordura mamaria (B) imagem representativa mostrando a exposição de almofada de gordura mamaria..

Figura 2:. Controle (A) de mídia Visão geral do orthotopic o crescimento do tumor de mama em ratos ou (C) O volume do tumor foi medido com um compasso de calibre, usando a seguinte fórmula:.. O volume do tumor = 0,5 x Comprimento x Largura x Largura (D) morfologia geral do tumor é analisada com HE. I representa as células infiltradas, T indica células tumorais e N significa a área necrótica. (Barra de escala = 200 pm)

Figura 3: O tumor metástases para os pulmões (A) Os pulmões de ratinhos que foram injectados com ortotopicamente células tumorais (MDA-MB-231).. A incubação dos pulmões em solução de Bouin expõe a focos metastáticos no pulmão. (B) Os pulmões de ratinhos de controloque foram submetidos à injeção orthotopic de mídia de controle. Como pode ser visto claramente, esses pulmões de controlo não apresentam metástases macroscópicas. (C) coloração de H & E mostra a região metastático no tecido pulmonar. A inserção mostra uma vista geral de baixa ampliação do tecido pulmonar que contém o foco metastático. O rectângulo tracejado preto no inserto representado na grande painel. As células tumorais são indicados pela linha tracejada branco; observar os núcleos maiores e mais densas. (Barra de escala Preto = 100 mm, barra de escala branco = 20 mm)

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.