Este relatório descreve um método para medir a atividade larval de Drosophila usando o TriKinetics Drosophila Activity Monitor. O dispositivo emprega feixes infravermelhos para detectar movimentos de até 16 animais individuais. Os dados podem ser analisados para representar parâmetros de movimento, incluindo taxas e posições dos animais dentro das câmaras de ensaio.
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Medição da Actividade larval no
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Resumo
Resumo
As larvas de Drosophila são usadas em muitos estudos comportamentais, mas um dispositivo simples para medir os parâmetros básicos da atividade larval não está disponível. Este protocolo reaproveita um instrumento frequentemente usado para medir a atividade adulta, o monitor de atividade TriKinetics Drosophila (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) para estudar a atividade larval. O instrumento pode monitorar os movimentos dos animais em 16 tubos de ensaio de vidro individuais de 8 cm, usando 17 feixes de detecção infravermelhos por tubo. O software de registro salva automaticamente os dados em um computador, registrando parâmetros como número de movimentos, horários em que os sensores foram acionados e as posições dos animais dentro dos tubos. Os dados podem então ser analisados para representar a locomoção geral e/ou preferência de posição, bem como outras medições. Todos os dados são facilmente acessíveis e compatíveis com o software básico de gráficos e manipulação de dados. Este protocolo discutirá como usar o aparelho, como operar o software e como executar um ensaio de atividade larval do início ao fim.
Introdução
O uso de Drosophila como ferramenta genética transformou o conhecimento científico dos sistemas biológicos. As larvas de Drosophila têm sido usadas em uma variedade de estudos, incluindo nocicepção1, desenvolvimento2 e como modelo para o estudo de genes de doenças humanas3. A atividade da Drosophila abrange uma variedade de comportamentos que variam sob diferentes condições, incluindo temperaturas2, exposição a drogas4 e entre diferentes genótipos. No entanto, apesar do uso significativo da larva como organismo modelo, um método simples e padronizado para analisar a atividade larval não está disponível. Atualmente, muitos estudos de locomoção larval empregam softwares sofisticados de análise de vídeo5. Embora poderosa, a complexidade de tais ferramentas automatizadas pode desencorajar os laboratórios que ainda não estão equipados para estudar a locomoção de incluir a análise de parâmetros de atividade informativa em seus estudos. Em outros métodos atuais não automatizados, como a análise de rastreamento em grade, o movimento é pontuado por um observador humano, o que introduz a possibilidade de subjetividade e limita o rendimento a um animal de cada vez6-7. Um estudo semelhante usou um ensaio de rastreamento de 5 pistas, que mediu o tempo que as larvas levavam para percorrer uma certa distância linear8. Nesses ensaios não automatizados, o deslocamento é medido, mas isso não leva em conta o deslocamento não linear entre os pontos inicial e final. Conforme discutido abaixo, o método descrito aqui é responsável por mais do movimento larval real, é objetivo, fácil de operar e oferece um rendimento robusto.
Para estudar facilmente o comportamento da atividade larval sem comprometer a precisão, eficiência ou custo, este método emprega o TriKinetics Drosophila Activity Monitor (DAM), um dispositivo frequentemente usado para estudar a atividade adulta. O uso de um dispositivo para estudar a atividade adulta e larval é econômico e permite a comparação direta do movimento dos animais nesses dois estágios da vida. O sistema, com o mais alto nível de resolução do fabricante, faz uso de 17 feixes de detecção infravermelhos por tubo de ensaio, que registram a atividade larval quando os feixes do sensor são interrompidos dentro dos 16 tubos individuais. O sistema salva automaticamente as informações gravadas em um computador, disponibilizando-as para manipulação com software gráfico básico. Os dados obtidos representam os feixes que foram quebrados por larvas individuais (que podem ser convertidas em uma taxa), o movimento quando uma larva permanece dentro de um feixe detector e a posição dos animais dentro das câmaras de ensaio durante um período de registro (permitindo calcular a preferência de posição). O sistema é eficiente e relativamente simples de operar, e traz uma análise de atividade básica altamente reprodutível ao alcance de qualquer laboratório que estude larvas de Drosophila.
Para demonstrar o poder desse ensaio, são apresentados dados que mostram seu uso para verificar diferenças de atividade resultantes da variação da temperatura ambiente, bem como por meio da comparação de um mutante previamente descrito como hipoativo (iav1)9 com um controle amplamente analisado (w1118).
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Protocolo
1. Preparação de larvas
- Para analisar uma larva desejado para locomoção ou posição preferência, crescer larvas sob condições padrão para a idade desejada para ensaiar 10 utilizando alimentos mosca padrão 11.
- Faça um filtro de malha esticando silk-screen grau de nylon da malha ao longo de um funil. Fixe a malha no pescoço funil com elástico. Colocar o funil num copo.
- Para a coleta de larvas para análise, colher uma espátula cheia de alimentos que contenham larvas de forrageamento do frasco de cultura e lavar com água da torneira RT sobre o filtro de malha, coletando larvas indivíduo diretamente da malha com um pincel 10.
2. Preparação de tubos de ensaio de
- Para se preparar para tapar os tubos de ensaio, ferva cuidadosamente um gel de agar 4% e despeje em uma placa de Petri a uma profundidade de 1,5 cm. Isto irá fornecer uma tomada para um ou outro lado do tubo quando animal é fechado. A solução a 4% é suficientemente denso para evitar larvas a partir de penetrating as fichas.
- Certifique-se de que os tubos são limpos e claros antes da inserção de larva. Se não estiverem, isto pode bloquear movimentos de ser gravada.
- Para garantir larvas tem umidade suficiente para o movimento, prepare um frasco contendo uma pequena quantidade de água quente. Inverta a garrafa, cuidadosamente orientar a tomada em direção a uma pia e aperte suavemente para expulsar a água do tubo de coleta.
- Insira a saída da garrafa no tubo de ensaio. Espremer o frasco para fornecer vapor de água dentro do tubo de ensaio até uma fina camada de condensação aparece na parede do tubo. Vídeo 1 mostra uma larva movendo-se em um tubo com uma quantidade apropriada de humidade.
- Para selar a larva no tubo, remover o gel de 1,5 centímetros de espessura de agar de placa de Petri e colocar sobre uma superfície de rede para permitir o fluxo de ar sob o ágar de modo que um tampão de agar pode ser inserido dentro do tubo. Pressionar uma das extremidades do tubo de ensaio para o gel duas vezes, para inserir dois tampões de gel em uma extremidade.
- Com um paintbRush, colocar uma larva no interior do tubo, aproximadamente, 1,5 polegadas de profundidade e selar o tubo ao pressionar a extremidade mais próxima da larva no gel de agar. A pressão resultante irá forçar para fora o segundo bujão de gel de agar a partir da extremidade oposta e selar o animal dentro do tubo.
- Colocar os tubos no dispositivo MB5 multi-Beam Drosophila Activity Monitor (DAM), e ajustar as posições das câmaras de ar de modo a que os animais não pode mover-se para além do alcance dos sensores.
- Para garantir que os tubos de ensaio não deslizar para fora da grelha de leitura de infravermelho do dispositivo durante o transporte, mantenha o tubo no lugar fixando um anel de massa de vidraceiro em torno de cada tubo onde contacta o dispositivo de gravação.
3. Medição Atividade
- Atividade recorde em uma incubadora para evitar leituras imprecisas que possam ocorrer devido a sombras, luzes fluorescentes ou a variações de temperatura no laboratório. Ver Figura 5 para uma disposição sugerida do sistema.
- Situado numa incubadora a 20 ° C (ver Figura 1). Para evitar falsos gravações devido a interferência de fontes de luz incandescentes durante a gravação, desligar as luzes fluorescentes incubadora e usar uma fonte de luz LED separado durante a gravação na incubadora. Realizar um julgamento sem quaisquer animais para assegurar que as condições de luz não aberrante acionar sensores. Não deve haver dados de movimento gravados após este teste.
- Permitir que as larvas se adapte à as definições incubadora a 20 ° C durante 5 minutos antes do início do ensaio.
- Para definir o sistema de DAM para intervalos de gravação desejados (por exemplo, 1 min), garantir DAM software de gravação do sistema é baixado para sediar computador 12 e abra o arquivo DAM sistema antes de conectar a câmara de gravação para a interface PSIU.
- Para definir a freqüência de gravação desejada na qual os dados serão salvos, selecione Preferências e, em seguida, clique em acima ou abaixo da opção de intervalo de leitura para selecionar diferentes intervalos de tempo em que os dadosvai ser armazenado. Por exemplo, seleccionar os intervalos de tempo de leitura 1 segundo a 1 hora.
- Para selecionar parâmetro variável para gravação de dados, escolha preferências e selecione as caixas correspondentes em tipo de dados de saída (contagens, movimentos, posições e habitar, ver Tabela 1). Cada parâmetro proporciona uma única análise da actividade das larvas no interior do tubo.
- Para iniciar a gravação, conecte o monitor a Unidade de Alimentação Interface (PSIU) usando um cabo de telefone CAB6. Conecte o PSIU a uma tomada eléctrica. Uma luz verde indica conexão apropriada.
- Conecte o PSIU através de um cabo Universal Serial Bus (USB) a um Macintosh ou PC com Windows para a gravação de dados. Abra o programa DAM SystemMB1v6x no computador para iniciar automaticamente a gravação de dados.
- Após o tempo de coleta desejado estiver completo, selecione Sair e, em seguida Sair agora na tela da atividade DAM; dados serão salvos automaticamente sob DAM de dados do sistema. Tome este arquivo de dados (por exemplo, monitorar 1) e arraste em uma pasta separada. Isto irá armazenar os dados em bruto a partir do software DAM de modo que eles podem ser posteriormente processados.
4. Preparação de dados para Processing (DAM FileScan)
- Para processar os dados brutos em um formato compreensível abrir o aplicativo DAM FileScan e escolha Selecionar pasta de dados de entrada. Em seguida, escolha a pasta de dados eo arquivo desejado e selecione a opção de digitalização. Por fim, selecione o comprimento bin para o período de leitura desejada. Isto irá organizar os dados brutos em parâmetros definidos pelo operador eo programa irá reportar os dados coletados nesse intervalo particular.
- Selecione o tipo de dados de saída para analisar a definição de movimento desejado (monitor de contagem, movimentos, habitar). De acordo com o menu leituras adicionais, select sum em bin (isto é, se o comprimento do compartimento é maior do que o intervalo de leitura de sistema seleccionado).
- Nomeie o arquivo de forma apropriada e salve. O arquivo será armazenado no mesmo local que a pasta a partir do passo 3.9.
- A fim de recolher movimentos médios, processar os dados brutos gerados a partir do passo 4. Para gerar uma tabela em um programa de planilha, abra o arquivo que foi salvo anteriormente (passo 4.3), e quando a janela Assistente de importação de texto exibida, selecione acabamento para abrir os arquivos de dados em um formato de planilha.
Nota: Dependendo do tipo de dados analisados, a planilha será lido de forma diferente. Tipicamente para medir movimentos do monitor ou contagens, o período de tempo de estudo serão gravados numericamente, enquanto cada tubo leitura individual receberão uma carta designada. Ao visualizar os dados na planilha, colunas KZ representam os slots para tubos de ensaio 16/01, respectivamente. As linhas representam os pontos de dados coletados. - Por exemplo, se move foram recolhidos durante 20 min em intervalos de 1 minuto, em média, as linhas 20 para calcular um número médio de movimentos / minuto e outras medições.
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Resultados
A Figura 1 mostra os resultados de um estudo de resposta à temperatura de controlo de larvas de terceiro instar, W 1118, utilizando o dispositivo de monitorização, para detectar diferenças na locomoção das larvas em sete diferentes temperaturas. As larvas foram lavadas e colocadas no dispositivo de actividade DAM como descrito acima, e colocado numa incubadora à temperatura desejada. O aparelho foi então deixados a aclimatar ao ambiente durante 5 min antes da gravação começou. Cada larva foi ...
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Discussão
Actividade de larvas de Drosophila é influenciada por uma variedade de factores, incluindo o genótipo 8, 13 anos de idade e 2 temperatura ambiente. Embora os métodos videográficos poderosos, capazes de análise altamente detalhadas foram desenvolvidas por aqueles que estudam locomoção 5, este nível de detalhe pode ser supérflua para aqueles que desejam para determinar os parâmetros básicos da atividade. O método descrito aqui utiliza um dispositivo que está disponível ...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo NIH P20GM103643 a I. Meng.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Monitor de Atividade Drosophila, Multifeixe, 16 tubos, incluindo fios | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| para Monitor de Atividade | TriKinetics Inc. | Tubos de vidro PSIU24 | |
| 80 x 5 mm para Monitor de Atividade (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x para Macintonsh OSX (Intel | )www.trikinetics.com | download gratuito | |
| do software DAMFileScan 108x para Macintosh | www.trikinetics.com | download gratuito | |
| do software USB (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | download grátis | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | download grátis | |
| Zeiss Stemi 2000C- Microscópio Estéreo | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Dióxido de Carbono | Maine Oxy | anestesia | |
| Fly Pad | Genesee | 59-114 | superfície para classificação de moscas anestesiadas |
| Pincel pequeno | Winsor & Newton | # 2 REDONDO | ou similar, usado para classificar moscas anestesiadas |
| Malha de serigrafia (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | poro tamanho usado neste protocolo foi ~ 0,1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | conservante |
| Etanol (190proof) | Pharmco | 111000190 | usado para dissolver Tegosept |
| 6 oz Garrafa de fundo quadrado (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Flugs" para garrafas plásticas Genesee | 49-100 | ||
| Frascos de Drosophila, largos (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Flugs para frascos de plástico largos | Genesee | 49-101 | |
| de ouro | farinha de milho degerminada amarela | ||
| Drosophila agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Levedura de Padeiro - Farinha Red Star | King Arthur | 1270 | |
| Açúcar Granulado - Dominó |
Referências
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Reimpressões e permissões
