Do gânglio espiral Neuron Explant Cultura e Eletrofisiologia em multi-eléctrodos Arrays

De acordo com a Organização Mundial da Saúde, 360 milhões de pessoas em todo o mundo sofrem de perda auditiva com profundas consequências na vida profissional e privada. Os aparelhos auditivos podem restaurar a função sensorial em formas moderadas de perda auditiva; no entanto, para os casos mais graves, a opção de tratamento mais eficaz é um dispositivo protético chamado implante coclear (IC). Os ICs contêm um feixe de eletrodos lineares de até 24 eletrodos, que é inserido cirurgicamente na escala timpânica da cóclea. Os eletrodos estimulam diretamente os neurônios do gânglio espiral, formando o nervo auditivo ¹.

Com mais de 300.000 dispositivos implantados em todo o mundo, os ICs são implantes médicos muito bem-sucedidos e estão entre os procedimentos mais econômicos já relatados. Apesar de seu sucesso, o implante coclear ainda apresenta limitações, como resolução de frequência reduzida em comparação com a audição fisiológica. Isso pode levar a déficits na comunicação eficaz em grupos ou ambientes barulhentos e na capacidade de decifrar sons muito complexos, como música. Essa resolução de frequência reduzida provavelmente se deve à lacuna entre os eletrodos de IC e os neurônios do gânglio espiral, levando à estimulação de grandes grupos de neurônios. Essa lacuna está na faixa de centenas de micrômetros ^2,3. A eliminação dessa lacuna facilitaria a estimulação de grupos menores de neurônios por eletrodo, aumentando assim a resolução de frequência e o desempenho geral do dispositivo ⁴.

Para estudar a influência da lacuna entre o eletrodo e o neurônio e o efeito de vários protocolos de estimulação otimizados, desenvolvemos um bioensaio in vitro baseado em uma caracterização eletrofisiológica não invasiva de SGNs em multi eletrodos arrays (MEAs) ⁵. Além disso, os MEAs podem ser facilmente modificados para variar a forma, o tamanho, o material e a rugosidade da superfície do eletrodo, para otimizar a interface neurônio-eletrodo. O seguinte é um protocolo passo a passo para obter de forma reprodutível gravações de culturas de neurônios do gânglio espiral murino e avaliar a dependência dos parâmetros mencionados acima.

cuidados com os animais e experimentação foi realizada em conformidade com as orientações das autoridades locais suíços (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Berna, Suíça).

1. Prepare Soluções para Experimentos

1. Preparar a solução de revestimento de matriz extracelular (ECM) (ver Tabela Material, ponto 6): mix Thaw ECM no gelo. Dilui-se a mistura 1:10 de ECM em meio de cultura de base (sem factores neurotróficos ou de Soro Fetal Bovino (FBS)) e guardar no gelo.
2. Preparar o meio de cultura (ver Tabela Material, ponto 1): Prepare um estoque de meio Neurobasal não contendo FBS ou cérebro fator neurotrófico derivado (BDNF). Suplementar meios Neurobasal com FBS fresco (10%) e de BDNF (5 ng / ml) imediatamente antes da adição à cultura de células.
3. Preparar a solução extracelular (ver Tabela Material, ponto 2).

2. Lavagem e Esterilização de acordos ambientais multilaterais

(Figura 1E). Cada um dos eléctrodos tem um tamanho de 40 x 40 um ² com um afastamento de 200 um de centro a centro. Os eléctrodos são feitos de platina. Os eléctrodos estão ligados aos contactos correspondentes por um circuito feito de óxido de índio e estanho. Este circuito é isolado por uma camada de 5 mm de SU-8. Veja a tabela de materiais para obter detalhes sobre o provedor. Outras disposições de MEA pode ser adequado para estas experiências.

1. Para os novos acordos ambientais multilaterais: Lave-os por imersão em etanol 70% por 30 segundos e lavar com água destilada por 30 seg. Trabalhar em uma capela de fluxo laminar.
2. Deixe secar MEA por 30 min em uma capela de fluxo laminar.
3. Coloque cada MEA em uma placa de Petri estéril indivíduo (35 mm x 10 mm) e selar com papel alumínio. Os MEAs podem ser armazenados até serem utilizados.
4. Para AAM usados: Incubar as MEAs em uma placa de Petri (35 mm x 10 mm) contendo 1 ml de solut enzimáticaion (veja Materiais Mesa, ponto 6) O / N em agitador orbital à temperatura ambiente para remover o material biológico. Em seguida, continue como no passo 2.1.
   NOTA: Manipular os acordos ambientais multilaterais com cuidado usando uma pinça com pontas cobertas de borracha.

3. Preparação de AAM para experimentos de cultura

1. Remover a película de selagem e deixar a MEA na caixa de Petri (35 mm x 10 mm) para todo o experimento.
2. Revestir as MEAs com a solução preparada de 1,1: Usar uma solução fria de 200 ul ponta da pipeta (armazenada a -20 ° C) para Pipetar 50 ul de solução de revestimento, para cada MEA, cobrindo a área do eléctrodo todo.
3. Permitir meas para revestimento durante 30 min a 1 h à TA.
4. Remover a solução de revestimento usando uma pipeta. Adicionar 100 ul de meio de cultura suplementado com 10% de FBS e 5 ng / ml de BDNF e deixá-lo à temperatura ambiente até o tecido do plaqueamento.
5. Coloque 2 placas de Petri contendo os AAM revestidos em uma grande placa de Petri (94 mm x 16 mm) e adicionar uma terceira pequena placa de Petri contendo 1,5ml de tampão fosfato salino (PBS) para a humidificação.
   NOTA: A adição de uma pequena placa de Petri (passo 3.5) contendo PBS é crucial para minimizar significativamente a evaporação do meio de cultura.

4. gânglio espiral Dissection

NOTA: dissecção Gross pode ser feito fora da capela de fluxo laminar (Passo 4.1 a 4.4). Para condições estéreis fina dissecção (capela de fluxo laminar) são de preenchimento obrigatório (a partir do passo 4.5).

1. Euthanize animais (ratinhos de 5-7 dias de idade) por decapitação sem anestesia prévia.
2. Esterilizar a cabeça por pulverização com 70% de etanol.
3. Segurando a cabeça, cortar a ligação entre a pele eo crânio com uma tesoura afiada / afiada ao longo da linha sagital.
4. Corte o crânio sagital e remover o cérebro usando uma tesoura afiada / sem corte.
5. Cortar os ossos temporais do crânio e colocar aqueles em uma placa de Petri contendo gelo estéril de Hanks frio "Solução Salina Equilibrada (SSHE).
6. Utilizando uma dissecçãomicroscópio ção, dissecar a bula timpânica usando uma pinça fina e isolar o ouvido interno.
7. Retirar o osso da cóclea, usando uma pinça fina.
8. Remova o ligamento espiral e estria vascular (SV), em conjunto, segurando com uma pinça a porção basal do gânglio espiral (SG) eo SV e lentamente desenrolando a SV da base -para-apex
9. Isolar o órgão de Corti (OC), o SG eo modíolo (Figura 1A - C)
10. Separe o OC do SG e modíolo, segurando com uma pinça a porção basal da SG e do OC e lentamente desenrolando a OC da base-a-ponta.
11. Explantes laterais de corte (200 a 500 um de diâmetro) do gânglio espiral ainda ligado ao modiolus (Figura 1D), utilizando um fórceps e uma micro bisturi.

5. espiral Cultura Ganglion Explant em MEAs

1. Coloque dois explantes do gânglio espiral próximos aos eléctrodos na MEA previamente preparado com 100 ul de meio de cultura.
2. Coloque o órgão de Corti, aproximadamente, 5 mm de distância de área de eléctrodo.
3. Use fórceps para fixar os explantes e o órgão de Corti para o MEA evitando ao mesmo tempo danificar o tecido.
4. Coloque as MEAs cuidadosamente na incubadora e cultura a 37 ° C e 5% de CO _2. No dia seguinte, inspeccionar visualmente que os explantes foram ligados ao MEA.
   NOTA: Se explantes não ter anexado O / N, eles raramente vai fazê-lo nos próximos dias. O OC é colocado adjacente à cultura para suporte trófico / neurotrófico.
5. Adicionar 100 ul de meio de cultura contendo 10% de FBS e o BDNF por dia durante 5 dias consecutivos.
6. No dia 6, adiciona-se 2 ml de meio de cultura contendo 10% de FBS e 5 ng / ml de BDNF e cultura do tecido durante um período adicional de 13 dias.

6. eletrofisiológicos Gravações para investigar a atividade Dependente espontânea e eletrodo de estimulação

1. Lava-se a cultura com MEA extracelular tãolução, preparado no passo 1.3, à TA.
2. Seque os contactos com um lenço de papel e montar o MEA na configuração MEA.
   NOTA: Para manter a cultura úmido durante a montagem, adicionar uma pequena gota de solução extracelular para a cultura.
3. Adicionar 300 ul de solução extracelular e esperar durante 10 min antes da gravação, para permitir que o sistema se estabilize.
4. atividade espontânea recorde de 2 min de todos os pólos, pressionando sobre o registro botão do software / adquirir e identificar eletrodos de registro.
5. Estimulação dos eletrodos MEA: Selecione a amplitude / duração / forma do estímulo sobre o software apropriado e aplicam-se a vários eletrodos consecutivamente como descrito ^13. Selecione os eletrodos com base em os que apresentaram atividade espontânea (como no passo 6.4). Registro de todos os eletrodos restantes.
6. Para excluir a estimulação artefato, estimulam a partir do mesmo eletrodo 10 vezes. Se a cultura responde, pelo menos, 8 de 10 vezes, pode-se assumir como umresposta positiva com a estimulação do eletrodo induzido.
7. Para identificar o ruído de fundo, aplica A tetrodotoxina (TTX) a cultureat uma concentração de 1 | iM, para bloquear os canais de sódio dependentes da voltagem e registo durante 2 min. Use isto para realizar a detecção de pico (7.1 e 7.2).

Análise 7. Os dados

NOTA: A análise dos dados foi previamente descrito em detalhe em ⁶ e ^5. Para detalhes sobre software utilizados neste estudo ver Materiais Mesa, ponto 7.

1. Utilizando o software apropriado detectar atividade espontânea para cada eletrodo empregando um detector baseado em desvios-padrão e um discriminador subsequente. Este procedimento é descrito em ^6. Atividade aparece transientes de tensão mais rápido (<5 ms).
2. Escolha um limite que resulta em nenhuma atividade quando se analisa a TTX tratada samples.Adapt o valor limite para cada experimento para discriminar entre falso positive e detecções de falsos negativos.
3. Utilizando o software apropriado observar a actividade neuronal detectada de cada eléctrodo como uma trama de varredura de acordo com procedimentos padrão (ver Figura 2A - C).
4. Determinar e exibir a atividade total da rede somando-se todos os eventos detectados dentro de uma janela deslizante de 10 ms, desviado por passos de 1 ms.
5. Detectar a atividade induzida por estimulação por exibir os dados brutos usando software de análise apropriado. Identificar os pontos individuais desligada manualmente. Picos individuais aparecem transientes mais rápido de tensão, que ocorreu após o artefacto de estimulação (cabeça de seta na Figura 2E). Um exemplo é mostrado na Figura 2E.
6. Dependendo da experiência, analisar o número de eléctrodos que respondem, o limiar necessária para alcançar uma resposta, número de potenciais de acção por eléctrodos e de outros parâmetros de interesse ^5.

8. Tissue Fixação e Immunohistochemistry

NOTA: O processo de coloração irá destruir o MEA. Veja a Tabela de materiais (ponto 4) para os reagentes.

1. Logo após a gravação lavar as culturas com 37 ° C quentes PBS três vezes. Descartar o PBS e aplicam-se 4% de paraformaldeído (PFA) (em PBS), pré-aquecido a 37 ° C durante 10 min.
   CUIDADO: PFA é tóxico. Trabalho em uma capa química com uma protecção adequada e uma solução de descarte de acordo com as orientações.
2. Lavam-se as culturas três vezes com PBS e bloquear com 2% de Albumina de Soro Bovino (BSA) em PBS (0,01% de Triton-X100) durante 2 h.
3. Adicione o primeiro anticorpo (anti-tubulina βIII, anticorpo Tuj) diluída em PBS (2% de BSA e 0,01% de Triton-X100) e deixar O / N a 4 ° C. Lava-se a cultura por três vezes com PBS.
   NOTA: A partir de agora manter a amostra no escuro o mais rápido possível para minimizar o branqueamento do anticorpo marcado com fluorescência secundária.
4. Adicionar o anticorpo secundário, diluiu-se em PBS (2% de BSA umad 0,01% de Triton-X100) e incubar durante 1 a 2 horas à temperatura ambiente. Para corar núcleos adicionar 1: 10.000 DAPI (1 mg / ml) durante 10 min.
5. Lavar três vezes com PBS e montar as amostras para trás a lamelas finas (24 x 50 mm ^2), utilizando o meio de montagem (ver Materiais Tabela, ponto 4). Imagem usando um microscópio de fluorescência com 5X e 20X de ampliação.

A Figura 1 resume o procedimento para o isolamento de tecido, e a preparação da cultura em MEA. Mostramos os passos consecutivos de dissecção de tecidos para isolar o gânglio espiral (SG) a partir do epitélio sensorial do órgão de Corti (OC) e estria vascular (SV) e anexa o ligamento espiral (Figura 1 A - C). Explantes do gânglio da espiral (3-4 em número) são cortados com micro-tesouras do gânglio como esquematicamente ilustrado na Figura 1D e colocado no MEA (Figura 1E), ao longo do eléctrodo de área de ocupado (2,2 mm2). A OC é colocado em proximidade, fora da superfície do eletrodo. O crescimento da cultura pode ser monitorizada ao longo do tempo (Figura 1G). Um diagrama esquemático do protocolo é demonstrado na Figura 1F. actividade electrofisiológica pode ser detectado após 6 dias de cultura, o que aumenta com o tempo a cultura prolongada. Nós somosecommend avaliação de 18 dias as culturas que produzem números significativamente maiores de eléctrodos de registo, em comparação com pontos de tempo anteriores 5.

Figura 1. preparação de cultura celular. (A) recentemente dissecados rato ouvido interno. Branco linha a tracejado que indica a localização da cóclea, linha a tracejado preto indica a região vestibular. Ouvido interno (B) do rato após a remoção da parede óssea da cóclea. giros cocleares são indicadas por linhas tracejadas brancos. (C) O gânglio espiral (SG) e modíolo, o órgão de Corti (OC) e os estria vascular (SV) e ligamento espiral são mostrados após a dissecação. (D) Esquema de SG e dissecção OC e preparação SG explante {figure adaptado de 5 com a aprovação da editora}. (E) Ilustração da matriz multi eléctrodo utilizado no presente estudo. recodificaçãoeléctrodos são organizados em uma grade retangular no centro e ocupam uma área de 2,2 mm2. eléctrodos 4 Terra e contatos secundários são ilustrados. (F) esquemática do protocolo de cultura. As gravações são realizadas no dia 18. (G) imagens representativas (imagens de campo claro) e esquemas de explantes SG sobre MEA monitorados em cultura no dia 1, 6 e 18. As barras de escala = 400 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

actividade espontânea pode ser detectado no MEA e mostrado como um gráfico de quadriculação, onde cada linha do gráfico representa um pico detectado. Um exemplo representativo que mostra a actividade espontânea detectada a partir de vários eléctrodos (cores diferentes nos gráficos) é mostrado (Figura 2A, 2B, e 2C).

(Figura 2D), 5 eléctrodos de responder (traços vermelho) e eléctrodos não responder (traços azul) é mostrado na Figura 2E. Para estas experiências foi um eléctrodo utilizado para a estimulação e todos os outros eléctrodos para gravação. potenciais de ação individuais apareceu 1 ms após o artefato estimulação (cabeça de seta preta). O CME pode ser imunocoradas no final do processo, a fim de avaliar a cobertura dos processos neuronais sobre a área do eléctrodo. O eletrodo indicado em verde na Figura 2F foi usado para a estimulação, e os eletrodos indicados em vermelho foram usadas para registrar as respostas (Figura 2E).

Figura 2. gravações de dados sobre MEA. (A </ Strong>) Traços de gravações originais de seis em cada 63 eletrodos que mostram a atividade espontânea. Plot (B) Raster dos seis eletrodos de Figura 2A após a detecção de pico. Cada barra representa um potencial de ação. (C) enredo Raster incluindo todos os eletrodos (como em A e B) A atividade é gravado a partir de 63 eletrodos (canais de número 0-63) para 2 min. (D) Um estímulo bifásica com duração total de 80 ms e a amplitude de 80 mA foi usada para a estimulação da cultura a partir de um eléctrodo (E58 na Figura 2F). (E) Exemplo representativo de vestígios de dados brutos obtidos após a estimulação do eletrodo 58 mostrando os potenciais de ação (traços vermelhos) ou sem respostas (traços azuis) após a estimulação (seta-cabeça preta). (F) a cultura do gânglio da espiral no MEA imunocoradas para o marcador neuronal Tuj (verde) no final da experiência para visualizar neuro cobertura nal da área do eléctrodo {figure adaptado de 5 com a aprovação da editora}. Eletrodo 58 usado para a estimulação é indicado em verde, eléctrodos que respondem são indicados em vermelho. Barra de escala = 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Finalmente, a configuração MEA permite estudar possível modificação da superfície do eletrodo que podem aumentar a sensibilidade de gravação. Dois eléctrodos MEA disponíveis comercialmente foram utilizados neste estudo, com duas superfícies de platina diferentes: Cinzento platina (cinzento Pt), consistindo de um 150 camada de Pt nm de espessura (impedância: 400 KQ / 1 KHz) e platina negra, (preto, Pt), obtida por deposição electroquimica de Pt no final do processo de fabricação de micro-(impedância: 20 KQ / 1 KHz). Veja a Tabela de Materiais (ponto 6) para obter detalhes.

Figura 3. Comparação de Cinza vs eletrodos Preto PT. Dois tipos de eletrodos (cinzento e preto Pt) foram comparados lado a lado com 12 culturas MEA independentes, 6 em cada tipo MEA. (A) O número total de reeletrodos corres- por experimento é mostrado. (B) limiar de amplitude para induzir uma resposta, medida utilizando 30-35 pares de eléctrodos independentes em 6 experiências independentes MEA é mostrado. Os dados são apresentados como média +/- DP. (Teste t de Student p <0,001) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a divulgar.