Eletroforese Capilar para monitorar Peptide Enxertia em quitosana Films em Tempo real

Electroforese capilar solução livre (CE) é uma técnica que separa os compostos em soluções com base na sua razão de carga ^{de 1,2-para-fricção.} Relação carga-to-size é frequentemente mencionado na literatura, mas essa simplificação não se aplica a polielectr�itos, incluindo polipeptídeos neste trabalho, e também foi mostrado para não ser apropriado para pequenas moléculas orgânicas ^3. CE difere de outras técnicas de separação em que o mesmo não possui uma fase estacionária, apenas uma electrólito fundo (geralmente um tampão). Isso permite que a técnica para ser robusto em sua capacidade de analisar uma grande variedade de amostras com matrizes complexas ^4, tais como fibras de plantas ^5, cervejas de fermentação ⁶ de enxertia em polímeros sintéticos ^7, amostras de alimentos ^8, e peptídeos dificilmente solúveis ⁹ sem preparação da amostra tedioso e purificação. Isto é especialmente significativo para polielectrólitos complexos que têm problemas de dissolução (suito como quitosano ¹⁰ e goma de gelano ¹¹⁾ e, por conseguinte, existir como agregados ou precipitado na solução e foram analisados com sucesso sem a filtração da amostra. Além disso, a análise de açúcares em cereais de pequeno almoço envolveu injetar amostras com partículas de amostras de cereais de pequeno-almoço precipitado em água ^8. Isto também se estende para a análise de polielectrólitos ou copolímeros ramificados ^12,13. Extenso trabalho também foi concluído no desenvolvimento de técnicas de CE especificamente para a análise de proteínas para proteómica ^14, separação quiral de péptidos naturais ou sintéticos ¹⁵ e separações microchip de proteínas e péptidos ^16. Uma vez que a separação e a análise ter lugar em um capilar, apenas pequenos volumes de amostra e são usados solventes que permite CE ter um custo de exploração mais baixa do que outras técnicas de separação, incluindo ^5,6,17 cromatografia. Uma vez que a separação por CE é rápido, que permite que o monitoanel de cinética da reacção. Isto foi demonstrado no caso do processo de enxerto de péptidos sobre os filmes de quitosano para uma melhor adesão da célula ^18.

O quitosano é um polissacárido derivado do -deacetylation N de quitina. Filmes de quitosano pode ser usado para várias aplicações biomédicas, tais como bio-adesivos ¹⁹ e substratos de crescimento de células ^18,20, devido à biocompatibilidade do quitosano ^21. Ligação de células a proteínas de matriz extracelular específicos, tais como fibronectina, laminina e colagénio, está directamente relacionada com a sobrevivência das células ^22. Notavelmente, tipos de células diferentes, muitas vezes exigem apego a diferentes proteínas da matriz extracelular para a sobrevivência e funcionamento correto. A fixação de células de filmes de quitosana foi mostrado para ser melhorada através da enxertia de fibronectina ^23; No entanto, a preparação, purificação e enxertia de tais proteínas grandes não é economicamente viável. Em alternativa uma variedade de pequenos péptidos Have foi mostrado ser capaz de imitar as propriedades de grandes proteínas da matriz extracelular. Por exemplo, péptidos, tais como os miméticos de fibronectina RGD (arginina - glicina - ácido aspártico) e RGDS (arginina - glicina - ácido aspártico - serina) têm sido usadas para facilitar e aumentar a ligação de células ^24. Covalente enxerto de RGDS sobre os filmes de quitosana resultou na fixação das células melhorado para células conhecidas para anexar a fibronectina in vivo ^18. Substituindo proteínas maiores gosta fibronectina com péptidos mais pequenos que têm a mesma funcionalidade proporciona uma significativa redução de custos.

Aqui, o péptido de enxertia para a quitosana foi realizada como publicado anteriormente ^18. Como demonstrado previamente, esta abordagem fornece enxerto simples e eficiente, utilizando os agentes de acoplamento de EDC-HCl (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) e NHS (N-hidroxissuccinimida) para funcionalizar o ácido carboxílico da RGDS ser enxertado nafilme de quitosana. Duas vantagens deste método são que o enxerto não exige qualquer modificação do quitosano ou do péptido, e é realizada em meio aquoso, para maximizar a compatibilidade com as aplicações de cultura de células futuras ^18,20. Como os agentes de acoplamento e o péptido pode ser cobrado, CE é um método adequado para a análise da cinética de reacção. Mais importante, a análise da cinética da reacção por meio de CE permite a monitorização em tempo real da reacção de enxerto, e, portanto, permite a optimização tanto e quantificar o grau de enxertamento.

Embora não seja necessário rotineiramente, os resultados da análise de CE pode ser validado off-line por uma medição directa do péptido enxertando sobre os filmes de quitosano usando espectroscopia de ^25,26-RMN de estado sólido (ressonância magnética nuclear) para demonstrar o enxerto covalente do péptido sobre a película ^18. No entanto, em comparação com a do estado sólido espectroscopia de RMN, a análise em tempo real fornecida pelaCE permite a quantificação do consumo de péptido em tempo real e, assim, a capacidade de avaliar a cinética da reacção.

O método acima mencionado é simples e permite a análise em tempo real de péptido enxertia em filmes de quitosana com quantificação indirecta da extensão da enxertia. O método demonstrado pode ser estendido para a avaliação quantitativa em tempo real de diferentes reacções químicas, desde que os reagentes ou os produtos a serem analisados ​​pode ser carregada.

1. Preparação de quitosano Films

1. Pesar 2 g de ácido acético glacial, completa a 100 ml com água ultrapura.
2. Pesar 1,7 g de pó de quitosano, juntar 100 ml de solução a 2% m / m de ácido acético aquoso. Agita-se durante 5 dias, com uma barra de agitação e placa de agitação magnética à temperatura ambiente, quer coberto com folha de alumínio ou, no escuro.
3. Centrifugar a dispersão de quitosano a 1076 xg a 23 ° C durante 1 h. Recolhe-se o sobrenadante com uma seringa e descartar o precipitado.
4. Para cada película, uma alíquota de 10 ml da suspensão de quitosana em plástico de 9 cm de caixa de Petri à temperatura ambiente. Deixar os filmes cobertos para secar por pelo menos 7 dias.
5. Usando uma tesoura cortar os filmes secos em 1 x 1 cm quadrados. Nota: O experimento pode ser pausado nesta fase.

2. Preparação de solução salina tamponada com fosfato (PBS)

1. Pesar 8 g de cloreto de sódio, 0,2 g de cloreto de potássio, 1,44 g de hidrogenofosfato dissódico PhosPhate e 0,24 g de di-hidrogenofosfato de potássio.
2. Dissolve-se estes produtos químicos pesados ​​em 800 ml de água ultrapura e titula-se a solução com ácido clorídrico concentrado para pH 7,4.
   Nota: O experimento pode ser pausado nesta fase.

3. Preparação de tampão de borato de sódio 75 mM a pH 9,2

1. Pesar 3,0915 g de ácido bórico. Dissolve-lo em 75 ml de água ultrapura.
2. Titula-se a solução de ácido bórico a um pH de 9,2 com uma solução de hidróxido de sódio a uma concentração de 10 M ou superior.
   Atenção: soluções concentradas de hidróxido de sódio são corrosivos e devem ser manuseados com luvas.
3. Completar com água ultrapura para se obter 100 ml de solução. Obteve-se um tampão de borato de sódio 500 mM a pH 9,2.
4. Diluir o tampão de borato de sódio 500 mM com água ultrapura com tampão de borato de sódio 75 mM. Nota: O experimento pode ser pausado nesta fase.

4. Preparação de quitosano Films para a reacção de enxerto

1. Lavagem de 10 filmes de quitosana quadrados (1 x 1 cm) em 5 ml de PBS durante 2 h em placas de Petri à temperatura ambiente.
2. Durante este tempo, preparar e validar o instrumento de electroforese capilar (passo 5).

5. Preparação e validação do Instrumento de Eletroforese Capilar

1. Prepara-se uma de 43,5 cm nua capilar de sílica fundida, com um diâmetro interno de 50 mm (43,5 centímetros é o comprimento total, o comprimento efectivo para a janela de detecção é normalmente 35 cm), enfraquecendo o revestimento exterior de polímero do capilar com o comprimento conjunto com um utensílio contundente, em seguida, encaixe o capilar.
   1. Criar uma janela para o capilar usando um isqueiro para queimar o revestimento de polímero de 8,5 cm da entrada e depois que esfria limpe-o com etanol. Queimar o revestimento do capilar em cada extremidade por alguns milímetros, com um isqueiro, e depois que esfria limpe-o com etanol.
   2. insi capilar lugarjanela de detecção e instalá-lo na cassete capilar, colocando-o em distâncias iguais na entrada e na saída e enrolando-a em torno dos eixos da cassete. Em seguida, instale a cassete no instrumento eletroforese capilar.
2. Definir os parâmetros do método para cada separação. No menu do software selecione "método" e depois "editar o método inteiro". Ajustar a temperatura, o tempo, a tensão, e os frascos utilizados para a separação (por exemplo 25 ° C, 10 min, 30 kV).
   1. Na secção de pré-condicionamento, definir os rubores consecutivos: 10 minutos com hidróxido de sódio a 1 M (em água), 5 min com hidróxido de sódio 0,1 M (em água), 5 min com água ultrapura e 5 min com tampão de borato de sódio 75 mM a pH 9,2 para o primeiro método de uma série de análises.
   2. Para os métodos subsequentes, definir o conjunto das ondas consecutivas na secção de pré-condicionamento: 1 min com hidróxido de sódio a 1 M (em água), 5 min com tampão de borato de sódio 75 mM a pH 9.2.
   3. Na secção de injecção, para definir os parâmetros de uma injecção com pressão hidrodinâmico 30 mbar durante 10 segundos para todos os métodos. Na secção de separação, definir as condições de separação a 30 kV, a 25 ° C durante 9 min para todos os métodos.
      NOTA: Consulte o manual do usuário do instrumento específico CE como procedimento para operar o instrumento CE pode variar entre os fabricantes. Preparar a solução de hidróxido de sódio 1 M no dia.
3. Injectar e separar um padrão interno de neutro (10 ul de 10% v / v de sulfóxido de dimetilo (DMSO), em água diluída em 450 ul de tampão de borato de sódio 75 mM). Injetar e separar da mesma forma um padrão oligoacrylate (dissolvido em água ultrapura em 10 g ∙ L ^-1; veja Lista de Materiais) para verificar a validade do capilar. Pausar a sequência aqui até a reacção de enxerto está pronto para começar.

6. Alongamento das RGDS Onto Quitosana Film

1. Pesar o péptido (1 mg RGDS)e os agentes de acoplamento (3 mg de EDC-HCl e 2 mg de NHS).
2. 2 horas após o início da imersão filme de quitosano em PBS, dissolve-se o péptido e os agentes de acoplamento em 5 ml de PBS.
   1. Tomar uma aliquota de 50 ul desta solução. Adicionar 2 mL de 10% v / v de DMSO em água, como um padrão interno neutro à alíquota. Analisar a alíquota com CE (veja o passo 7).
3. Remover os 5 ml de PBS utilizada para enxaguar os filmes de quitosana da placa de Petri. Adicionar a solução de 5 ml de agentes de acoplamento de péptidos e para a placa de Petri contendo os filmes de quitosana.
4. Cubra o prato de Petri com filme de parafina e colocá-lo em um agitador orbital à temperatura ambiente. Tome 50 mL alíquotas de meios de reacção em tempos do jogo.
   NOTA: O tempo total de análise de CE é de 15 minutos, assim, uma alíquota pode ser feita a cada 15 minutos (ou a cada 30 min se duas reacções são monitorizadas em paralelo, etc).
   1. Adicionar 2 mL de 10% v / v de DMSO em água, como um padrão interno para cada ponto morto aiIQUOT.
      NOTA: As aliquotas devem ser analisadas com CE, logo que eles são levados (ver passo 7).
5. Após 4 horas de agitação e remoção de alíquotas, remova a placa de Petri do shaker. Remover o meio de reacção a partir da placa de Petri. Adicionar 5 ml de PBS para lavar os filmes de quitosana.
6. Remover o PBS a partir da placa de Petri, lavar o filme quitosana com água ultrapura e permitir-lhes a secar durante a noite. Remover a água ultrapura e armazenar as películas à temperatura de -20 ° C em uma placa de Petri de plástico.

7. Monitoramento de Reação Enxerto Usando CE

1. Injectar e alíquotas separadas de meio de reacção imediatamente após a remoção da placa de Petri utilizando as condições de análise como na secção 5.2.
2. Após a conclusão das separações enxaguar o capilar com água ultrapura durante 10 min. Seque-o através de um flush com um frasco vazio (ar) durante 10 min.
   NOTA: O experimento pode ser pausado nesta fase.

8. Dados Trea tamento para CE

1. Verificar a validade de cada separação, por verificar que tanto a corrente durante a separação e o tempo de migração do marcador mobilidade electro-osmótico (DMSO neste caso) são semelhantes aos observados para a separação padrão oligoacrylate.
   NOTA: até 10-15% de variação é aceitável do valor atual esperado de cerca de 50 mA e valor tempo de migração de 1,3 min (valores de mobilidade eletroforética deve ser usado em vez de tempos de migração se um repetibilidade superior é exigido).
2. Para cada separação bem-sucedida, exportar os dados brutos do software eletroforese capilar, selecionando um conjunto de dados específico, clique direito sobre a exportação e selecionar um sinal apropriado.
3. Converter os dados em bruto gravados pela CE (apresentada como absorvância de UV em função do tempo de migração). Converter o eixo X (tempo de migração T _m) para uma mobilidade electroforética μ seguinte equação 1:
   n 1 "src =" / files / ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg "/> (1)
   em que L é o comprimento _d ao detector, G _t é o comprimento total do tubo capilar, V é a tensão, e t _EO é o tempo de migração de uma espécie neutra (padrão interno DMSO neste caso) ^27.
   Converter o eixo Y dos dados em bruto (absorvância em AU) para uma distribuição de mobilidades electrof W (μ) seguinte equação 2: ²⁸
   (2)

9. Caracterização Adicional dos enxertado com Peptídeo ¹⁸ Films

1. Insira filmes de quitosana enxertado com peptídicos, laminados em torno de si, em um solid-state rotor NMR 4 mm. Encher o rotor com solução salina tamponada com fosfato a inchar dos filmes, e fechar o rotor. Espere por algumas horas.
2. Analisar o filme com ^{13 <}/ sup> C espectroscopia de RMN ^18.

CE está bem adaptado para monitorar a enxertia de péptidos (por exemplo, RGDS) sobre os filmes de quitosano. Os agentes de acoplamento adequados incluem EDC-HCl e NHS que activam o péptido a ser enxertado na quitosano (Figura 1). CE é capaz de separar os diferentes moléculas de interesse a partir do meio de reacção. Para designar os picos no electroferograma, RGDS puros, EDC-HCl e NHS foram dissolvidos, injectados separadamente e separada. Após a atribuição de pico, o meio de reacção foi injectada e os vários reagentes foram identificados (Figura 2). De EDC-HCl reagiram para um produto secundário EDH-HCl (3 - (((etilamino) (hidroxi) metileno) amino) - N, N -dimethylpropan-1-amina). Dimetil sulfóxido (DMSO) é utilizado como padrão interno para as separações CE. O quitosano está presente no experimento de enxerto na forma de filmes insolúveis e, portanto, não é injectado ou observados em CE. Note-se que para todos os dados em bruto, tgravou eixo do tempo de migração é convertido num eixo mobilidade electroforética (Equação 1) e o eixo de absorção de UV para uma distribuição de mobilidades electrof W (μ) (equação 2).

À medida que as aliquotas são retiradas do meio de reacção que são colocadas dentro do instrumento CE e injectado. A extensão da reacção é monitorizado por meio da diminuição do pico relacionado com RGDS (Figura 3). Também pode ser visto que o pico de EDC-HCl diminui enquanto o EDH-HCl pico aumenta ao longo do tempo. É importante notar que não existe um sinal que pode ser atribuído a um produto de uma reacção secundária do péptido, assim, presume-se que os RGDS ser removido do meio de reacção está a ser enxertado na película de quitosano. Eletroferogramas sobrepostas (Figura 3A) permitem que a quantificação do consumo de péptido a partir do início até ao fim da reacção. É de notar queembora a cinética foi inicialmente medido durante 18 horas (Figura 3B), 4 h foi considerada suficiente para que a reacção prossiga a sua extensão máxima. Para permitir a quantificação de um volume de injecção óptimo é necessário para assegurar a relação sinal-ruído é suficientemente elevado, evitando a sobrecarga (Figura 4A) e no caso de RGDS, injecções foram obrigados a ser completado em tempo real para impedir policondensação (Figura 4B ).

A técnica baseia-CE descrito aqui para analisar peptídeo enxerto para filmes de quitosana é rápido e simples; No entanto, ele não quantificar o processo de enxerto directamente. espectroscopia de RMN é usado para demonstrar o enxerto; esta medida não pode ser feito em tempo real (que normalmente leva várias horas) e deve ser concluído pós-reação. A comparação qualitativa dos filmes de quitosano antes e após enxerto mostra o enxerto bem sucedido dos péptidos throurg o aparecimento de um sinal a 70 ppm nos filmes enxertados correspondentes à ligação amida entre o quitosano e o péptido (Figura 5).

Figura 1. Esquema da reacção de enxerto. Esquema de reacção química que mostra a activação por EDC-HCl e NHS do grupo funcional ácido carboxílico de RGDS seguido por seu enxerto na superfície de cinema do quitosano. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .

Figura 2. atribuição de pico das espécies presentes no meio de reacção. A. Separação e atribuição de pico para soluções de EDC parcialmente hidrolisada HCI (rosa), RGDS (vermelho), NHS (azul), bem como para a PBS (roxo) e o meio de reacção (preto). B. electroferogramas dos meios de reacção (preto) apresentado como uma função do tempo de migração (electroforética mobilidade deve ser usado para superar má capacidade de repetição em tempos de migração). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura monitoramento 3. CE do consumo RGDS. (A) Sobrepor picos de Peptídeos em tempo de reação de 30 min (linha sólida roxo), 60 minutos (linha do traço magenta), 90 min (linha azul sólida), 120 min (linha do traço verde), 150 min (linha sólida vermelha) e (B) cinética de enxertia completou mais de 18 horas em repetições (quadrado e um círculo).pload / 54549 / 54549fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. picos peptídicos sobreposta em meios de reacção mostrando resultados sub-óptimos (A) Variável (hidrodinâmico) tempos de injeção:. 5 seg (linha azul), 10 seg (linha preta), 20 seg (linha vermelha) e 30 segundos (linha magenta) . Mídia (B) reacção foi deixada em um frasco CE por um período prolongado de tempo antes da injecção:. 30 min (linha vermelha) e 90 min (linha azul) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. 13C espectros de RMN inchada-estado de filmes de quitosana. Comparação dos filmes antes (linha preta) e depois (linha azul) enxertia peptídeo. Sinais presentes apenas no espectro registrado após a enxertia são indicadas por asteriscos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.