Summary
एक साधारण अभी तक प्रभावी तरीका है कि पता लगाने और कार्यात्मक और प्ररूपी विश्लेषण के लिए प्रतिजन प्रतिक्रियाशील बी कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए चुंबकीय नैनोकणों को रोजगार में वर्णित है।
Introduction
सीमित कमजोर पड़ने एंटीबॉडी स्रावित सेल अग्रदूत आवृत्ति का विश्लेषण करती सुझाव दिया है कि बी एक विशेष प्रतिजन के लिए प्रतिक्रियाशील कोशिकाओं को आमतौर पर सामान्य श्रेणी में प्रदर्शनों की सूची में 0.05 0.005% की एक आवृत्ति पर होते टीकाकरण की स्थिति और प्रतिजन पर उपस्थित epitopes के आकार / संख्या पर निर्भर करता है। इन कोशिकाओं के कम आवृत्ति यह मुश्किल ऐसे निम्नलिखित टीकाकरण या जोखिम एक विदेशी प्रतिजन के लिए, या autoimmunity के विकास के दौरान के रूप में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, के विकास के दौरान उनकी स्थिति में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए बनाया गया है। सक्रिय प्रतिदीप्ति सेल 1, 2, 3, 4, 5, 6 छँटाई इससे पहले, शोधकर्ताओं प्रतिजन प्रतिक्रियाशील बी प्रतिजन लेपित प्लेट या स्तंभ Adsorbents, प्रतिजन लेपित लाल रक्त कोशिका रीसेट करने से लेकर तकनीक का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं के अलगाव किए गए हैं। thougज इन तकनीकों की पहचान करने और प्रतिजन प्रतिक्रियाशील बी कोशिकाओं को अलग-थलग करने में सफल रहे हैं, परिणाम निकलेगा, पवित्रता और scalability के मामले में अलग है। हाल ही में हम दोनों का पता लगाने और चुंबकीय नैनोकणों का उपयोग दुर्लभ बी लिम्फोसाइट उप-जनसंख्या संतुष्ट करने के लिए एक उपन्यास विधि विकसित की है। विधि अपेक्षाकृत उच्च उपज और बड़े शुरुआती आबादी से पवित्रता के साथ संवर्धन के लिए सक्षम बनाता है, और प्रतिजन के लिए प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के साथ संगत है। निलंबन में कोशिकाओं की आबादी से समृद्ध बनाने के द्वारा, विधि बाधाओं कि प्रतिजन में लिपटे प्लेटों या स्तंभों, और सीमा throughput की ज्यामिति के साथ जुड़े रहे समाप्त। अंत में, के बाद से समृद्ध कोशिकाओं प्रतिजन और एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ जुड़े रहते हैं, वे आगे FACS छँटाई द्वारा शुद्ध किया जा सकता है। के रूप में वर्णित हम परिधीय रक्त टिटनेस toxoid प्रतिक्रियाशील बी से पहले कोशिकाओं के अध्ययन और मानव विषयों के निम्नलिखित टीकाकरण के लिए इस दृष्टिकोण, साथ ही विभिन्न autoi के साथ विषयों से स्वप्रतिजन प्रतिक्रियाशील बी कोशिकाओं का इस्तेमाल किया हैmmune विकारों, सहित टाइप 1 मधुमेह, 'कब्र रोग, और Hashimoto रोग 7। विधि माउस और मानव में समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है, और ऊतकों की एक किस्म (तैयारी में पांडुलिपि) से प्रतिजन प्रतिक्रियाशील बी कोशिकाओं के विश्लेषण के साथ संगत है।
अपने मूल स्वरूप में, परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear पहली सतह प्ररूपी विश्लेषण के लिए आवश्यक एंटीजन सेल एंटीबॉडी के साथ-साथ biotinylated प्रतिजन के साथ incubated हैं। यह लेबलिंग कदम धोने और निर्धारण, और (चित्रा 1) biotinylated प्रतिजन बाध्यकारी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए दूर-लाल-फ्लोरोसेंट डाई करने के लिए मिलकर streptavidin के अलावा द्वारा पीछा किया जाता है। पिछले अध्ययनों से एक समान तरीके से विशिष्ट प्रतिजन बी कोशिकाओं की पहचान की है लेकिन एंटीजन का उपयोग कर सीधे एक fluorochrome 8, 9, 10, 11 संयुग्मित। हालांकि यह एक योग्य हैदृष्टिकोण, streptavidin के साथ संयोजन के रूप में biotinylated एंटीजन का उपयोग अधिक से अधिक संकेत प्रवर्धन (बाध्यकारी और गैर-बाध्यकारी कोशिकाओं की इसलिए बेहतर भेदभाव) के लिए सक्षम बनाता है, खासकर जब एंटीजन छोटे 12, 13, 14 हैं। एक अतिरिक्त विचार के बजाय streptavidin avidin क्योंकि streptavidin deglycosylated है, गैर विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए इस्तेमाल होता है। इसके अलावा, हम अपने photostability, क्वांटम उपज (चमक), और अपने छोटे आकार (~ 1.3 केडी) की वजह से fluorochrome के रूप में दूर-लाल-फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करें। क्योंकि वे संभावित कई प्रतिजनी epitopes शामिल ऐसे phycoerythrin के रूप में प्रोटीन fluorochromes (~ 250 केडी) और allophycocyanin (~ 105 केडी) 15 इष्टतम नहीं कर रहे हैं। ऐसे में दूर-लाल-फ्लोरोसेंट रंजक के रूप में, एक एकल मिलान से बना एक छोटा सा कार्बनिक फ्लोरोसेंट डाई का प्रयोग करें, पृथक सेल की आबादी की जटिलता कम कर देता है।
एक बार जब कोशिकाओं रहे हैं biotinylated-एकntigen और दूर लाल फ्लोरोसेंट डाई streptavidin adsorbed, वे विरोधी दूर लाल फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित चुंबकीय नैनोकणों का उपयोग कर समृद्ध कर रहे हैं। एकल नैनोकणों सबसे प्रवाह cytometers से नहीं पाया जाता है और इसलिए छँटाई FACS और नीचे की ओर assays 16 से शुद्धि करने से पहले हटाया जा जरूरत नहीं है। विशिष्ट प्रतिजन बी कोशिकाओं के लिए चुंबकीय चयन ब्याज की आबादी को समृद्ध करती है, समय और एक प्रवाह कोशिकामापी का उपयोग कर दुर्लभ घटनाओं छँटाई की लागत को नष्ट करने।
नीचे हम एक विषय से पहले और सात दिन टिटनेस toxoid बूस्टर टीकाकरण के बाद से टिटनेस-toxoid-विशिष्ट बी कोशिकाओं के संवर्धन से प्रतिनिधि के परिणाम बताते हैं। हम आदेश विशिष्ट प्रतिजन बी विवो उत्तेजना में तीव्र निम्नलिखित कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए इस विधि की क्षमता को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में यह विशेष रूप से आवेदन चुना है। जब से फ्लो के साथ मिलकर, इस विधि समृद्ध और फर्क विशिष्ट प्रतिजन भोले, स्मृति में सक्षम है, औरplasmablast बी कोशिकाओं और शोधकर्ता समय के साथ उनकी आवृत्ति में परिवर्तन का पालन करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, हम एक और संभव नीचे की ओर परख, उदाहरण के लिए एक ELISPOT परख है, जो यह दर्शाता है कि कोशिकाओं संवर्धन निम्नलिखित एंटीबॉडी स्रावित करने की क्षमता को बनाए रखने में शामिल हैं। इस पद्धति का एक अन्य आवेदन में एक मेजबान के समृद्ध कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण शामिल कर सकता है। हम पहले से पता चला है कोशिकाओं प्रतिजन अलगाव और स्थानांतरण के बाद प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं पेश के रूप में कार्य करने की क्षमता को बनाए रखने के (डेटा) नहीं दिखाया। इसलिए, वहाँ संभव बहाव assays कि विधि है, जो एक साथ विशिष्ट प्रतिजन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की समझ को सूचित करने के लिए मिलकर किया जा सकता है की एक संख्या हैं। हम नीचे वर्णित विधि है, कुल उपज, पवित्रता, सेल विशिष्टता का निर्धारण, और गुना-संवर्धन के लिए नियंत्रण भी शामिल है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. मानव PBMCs का अलगाव
- heparinized रक्त संग्रह ट्यूब का उपयोग रक्त के 30-50 मिलीलीटर लीजिए।
नोट: इस्तेमाल किया रक्त की मात्रा विशेष रूप से प्रयोगात्मक सवाल और ब्याज की विशिष्ट प्रतिजन बी कोशिकाओं के रक्त में आवृत्ति पर निर्भर करता है। Heparinized रक्त तुरंत कार्रवाई की जा सकती है या अगले दिन के प्रसंस्करण के लिए कमरे के तापमान पर धीरे रात भर को हिलाकर रख दिया। प्रसंस्करण में देरी संवर्धन की क्षमता पर बहुत कम प्रभाव पड़ता है और व्यवहार्यता का कम से कम नुकसान के साथ जुड़ा हुआ है। - बाँझ, कमरे के तापमान मैग्नीशियम और कैल्शियम मुक्त फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ 1: मिक्स पूरे रक्त 1।
- एक 50 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में, कमरे के तापमान घनत्व ढाल समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में खोला घनत्व ढाल बोतल की दुकान है, लेकिन उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान को गर्म है।
- यदि संभव हो तो धीमी गति से स्थापित करने के लिए पिपेट बंदूक सेट और / या धीरे-धीरे करने के लिए बहुत कम है, फिर भी संगत, ट्रिगर दबाव लागूघनत्व ढाल के शीर्ष पर पतला रक्त का 30-35 मिलीलीटर परत, दो मिश्रण करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा।
नोट: 50 मिलीलीटर के किनारे के खिलाफ पिपेट की नोक रखकर शंक्वाकार जबकि पतला खून जोड़ने में मदद मिलेगी एक सुसंगत सतत प्रवाह किया जाता है। - ब्रेक के साथ 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र बंद कर दिया।
- ऊपरी परत है, जो प्लाज्मा और प्लेटलेट्स होते हैं, नीचे mononuclear सेल परत को परेशान करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा निकालें।
- एक बाँझ पिपेट का उपयोग करना, mononuclear सेल परत (बफी कोट) इकट्ठा करने और एक अलग बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जगह है।
- 50 मिलीलीटर की एक मात्रा के लिए सेल निलंबन के लिए पीबीएस जोड़ें। ब्रेक के साथ 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
- तैरनेवाला निकालें और पीबीएस के 10 मिलीलीटर में pelleted कोशिकाओं resuspend। कोशिकाओं की गणना और एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग व्यवहार्यता का निर्धारण।
- आगे की प्रक्रिया के लिए तैयार है जब तक 10 7 कोशिकाओं / एमएल और बर्फ पर जगह पर Resuspend कोशिकाओं।
2. कोशिकाओं का धुंधला
- प्रत्येक प्रतिदीप्ति मुआवजा / FMO नियंत्रण की जरूरत है, यदि लागू लिए 1-2 एक्स 10 6 कोशिकाओं निकालें। ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं के अपकेंद्रित्र शेष।
- 3-6 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल पर बाँझ फ़िल्टर, ठंड FACS बफर (पीबीएस + 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) + 0.01% सोडियम azide) में Resuspend कोशिकाओं (एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में निकालने के लिए)। सुनिश्चित करें कि FACS बफर ठंडा है और धुंधला प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रहते हैं।
- चौथाई में सेल की आबादी (एडी) फूट डालो जब परख के अनुकूलन। संवर्धन / धुंधला की विशिष्टता यह निर्धारित करने के लिए ब्याज, उपयोग अंशों बी और सी विशिष्ट प्रतिजन बी कोशिकाओं को समृद्ध करने के अंश का प्रयोग करें, और उपयोग अंश डी (2.5 और 2.6 नीचे देखें) में आवृत्ति और विशिष्ट प्रतिजन कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए unenriched आबादी उपज की गणना के लिए सक्षम और गुना-संवर्धन के लिए।
- मानव FcγR अवरुद्ध पुन जोड़ेएफसी रिसेप्टर्स के लिए एंटीबॉडी के बंधन को रोकने के लिए बर्फ पर अंशों ई एजेंट।
ध्यान दें: उपयुक्त परिस्थितियों के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें। - fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी अंधेरे में बर्फ पर 30 मिनट के लिए अंशों ईस्वी के लिए ब्याज की सतह एंटीजन सेल, fluorochromes पार विरोधी दूर लाल फ्लोरोसेंट डाई चुंबकीय नैनोकणों के लिए युग्मित एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं कि शामिल करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा जोड़ें।
नोट: ये पास आईआर फ्लोरोसेंट रंजक, Cy5, Cy5.5, और Cy7 के लिए एंटीबॉडी conjugates शामिल हैं। किसी भी व्यवहार्यता दाग जुड़ जाते हैं कि एक लगानेवाला के उपयोग के साथ संगत होना चाहिए। एक उदाहरण के लिए, FACS का उपयोग कोशिकाओं का विश्लेषण, लेकिन एंटीबॉडी स्रावित आवृत्ति निर्धारित करने के लिए ELISPOT द्वारा इरादा नहीं है, तो एंटीबॉडी के साथ सतह धुंधला अनावश्यक है। - परख की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए, बर्फ पर 30 मिनट के लिए लेबल हटाया गया प्रतिजन के लिए पर्याप्त राशि के साथ अंश बी सेते हैं कि इस तरह के एक आत्मीयता के साथ रिसेप्टर्स के बहुमत के लिए कम से कम10 -6 एम अवरुद्ध कर रहे हैं।
नोट: आमतौर पर, एक अच्छा प्रारंभिक एकाग्रता प्रतिजन की राशि का एक 50-100 गुना अधिक नीचे (जैसे 50-100 माइक्रोन) के 2.6 में पर्याप्त माना जाता है। यह एक उच्च आत्मीयता के साथ किसी भी बी कोशिकाओं लेबल हटाया गया प्रतिजन biotinylated प्रतिजन, जो नीचे 2.6 चरण में जोड़ा जाता है, इस प्रकार की कोशिकाओं को समृद्ध की विशिष्टता की पुष्टि की इजाजत देने के लिए बाध्य करने के लिए ब्लॉक करना चाहिए। इस कदम से ऊपर 2.4 कदम के साथ संयोजन के रूप में पूरा किया जा सकता है। - 30 मिनट के लिए बर्फ पर भागों ए, बी, डी और सेते biotinylated प्रतिजन जोड़ें।
नोट: biotinylated प्रतिजन की एकाग्रता पर्याप्त पता लगाने और गैर विशिष्ट दर्शक कोशिकाओं से कोशिकाओं बाध्यकारी की जुदाई सुनिश्चित करने की जरूरत अधिकतम राशि निर्धारित करने के लिए titrated किया जाना चाहिए। आम तौर पर परीक्षण करने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक एकाग्रता 1-5 माइक्रोन है।
नोट: भिन्न एक और डी के लिए, इस कदम समवर्ती ऊपर 2.4 कदम के साथ किया जा सकता है। अंश बी के लिए, इस कदम के बाद 2.5 कदम (betw में धोने के लिए किया जाना चाहिएeen कदम अनावश्यक है)। - आदेश में इस तरह streptavidin- दूर लाल फ्लोरोसेंट डाई और चुंबकीय मोती के रूप में प्रोटोकॉल में अन्य अभिकर्मकों, बी कोशिकाओं के किसी भी बाध्यकारी निर्धारित करने के अंश सेल्सियस से biotinylated प्रतिजन न आना।
- कोशिकाओं कोशिकाओं को दो बार के निलंबन से 5 एक्स 10 7 कोशिकाओं प्रति ठंड FACS बफर और centrifugation के 1 मिलीलीटर में 400 XG पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धो लें।
- अंतिम धोने के बाद, 5 एक्स 10 7 कोशिकाओं प्रति 1 मिलीलीटर 2% formaldehyde में केंद्रित सेल निलंबन पतला और 5 मिनट के लिए बर्फ पर अंधेरे में बैठते हैं।
नोट: इस बिंदु पर कोशिकाओं का निर्धारण कि biotinylated प्रतिजन प्रक्रिया के शेष के लिए बीसीआर के लिए बाध्य बनी हुई है। व्यवहार्य कोशिकाओं के लिए - ऐसे ELISPOTs या दत्तक स्थानान्तरण के रूप में नीचे की ओर विश्लेषण के लिए, निर्धारण कदम न आना। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर दो बार 5 एक्स 10 7 कोशिकाओं प्रति ठंड FACS बफर और सेंट्रीफ्यूज के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें। 1 मिलीलीटर में Resuspend ठंड FACS प्रति 5 एक्स 10 बफर7 कोशिकाओं।
- 1-2 माइक्रोग्राम streptavidin-दूर लाल फ्लोरोसेंट डाई / मिलीलीटर जोड़ें और अंधेरे में 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। प्रत्येक आवेदन के लिए streptavidin की राशि titrate।
- कोशिकाओं में दो बार 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर 5 10 x 7 कोशिकाओं प्रति 1 मिलीलीटर ठंड FACS बफर और सेंट्रीफ्यूज के साथ धोएं। अंश डी तैयारी इस बिंदु पर पूरा हो गया है के रूप में यह चुंबकीय मोतियों का उपयोग संवर्धन नहीं गुजरना होगा।
ध्यान दें: यह नमूना आवृत्ति और नमूने में विशिष्ट प्रतिजन बी कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। यह उपज का निर्धारण और संवर्धन गुना संवर्धन के द्वारा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
3. चुंबकीय nanoparticle आधारित संवर्धन
- ठंड जुदाई बफर (पीबीएस + 0.5% बीएसए + 2 मिमी EDTA) 5 10 x 7 कोशिकाओं प्रति और पास के 1 मिलीलीटर में नमूने एसी से Resuspend कोशिकाओं एक 40 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से किसी भी झुरमुटों कि स्तंभ रोकना सकता समाप्त करने के लिए।
- एंटी Cy5 / विरोधी दूर लाल फ्लोरोसेंट डाई नैनोकणों जोड़ें। एफओइष्टतम परिणाम r, नैनोकणों की एकाग्रता प्रत्येक उपयोग के लिए titrated किया जाना चाहिए, लेकिन एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु प्रति 5 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल 50 μl निलंबन है। 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में घुमाएं।
- दो बार 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर 1 मिलीलीटर ठंड जुदाई बफर के साथ धोएं। 5 एक्स 10 7 कोशिकाओं प्रति ठंड जुदाई बफर के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend।
4. चुंबकीय संवर्धन लोकसभा या एलडी स्तंभों का उपयोग
- तीन लोकसभा या एलडी कॉलम एक चुंबकीय विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में जगह और स्तंभों गीला करने के लिए जुदाई बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ने (जो निर्धारित करने के स्तंभ के प्रकार के लिए सबसे उपयुक्त है उत्पाद विवरण देखें)। सभी 3 मिलीग्राम कॉलम के माध्यम से गुजरती हैं और संग्रह के बाद त्यागने के लिए अनुमति दें।
नोट: हालांकि चुंबकीय nanoparticle लेबल की कोशिकाओं की जुदाई चुंबकीय जुदाई उपकरणों है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं में से किसी एक का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है, प्रयोगशाला लोकसभा स्तंभों के उपयोग के साथ सबसे अधिक सफलता, ते में पड़ा हैउपज, पवित्रता, और संवर्धन की क्षमता के आरएमएस। - तीन 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों लेबल "अंश एक / (बी) / (सी) नकारात्मक", नकारात्मक चयनित कक्षों के लिए प्लेस, स्तंभ के अंतर्गत। उनके संबंधित स्तंभ के लिए चुंबकीय कण लेबल की कोशिकाओं जोड़ें और पूरी मात्रा के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देते हैं।
- शीर्ष पर ठंड जुदाई बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें, और इस कॉलम के माध्यम से गुजरती हैं और 2 मिलीलीटर के साथ दोहराने के लिए अनुमति देते हैं। नकारात्मक चयनित कक्षों लीजिए और बर्फ पर अलग निर्धारित करें।
- चुंबकीय क्षेत्र से स्तंभ निकालें और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार सकारात्मक चयनित कक्षों के लिए लेबल "अंश एक / (बी) / (सी) सकारात्मक", ट्यूब के शीर्ष पर जगह है।
- जुदाई बफर के लगभग 6 मिलीलीटर के साथ शीर्ष पर कॉलम भरने और तुरंत कॉलम के माध्यम से इस मात्रा उतर कोशिकाओं है कि उपलब्ध कराई गई सवार का उपयोग कर चुंबकीय क्षेत्र के लिए बाध्य किया था इकट्ठा करने के लिए।
- शुद्धता बढ़ाने के लिए, सकारात्मक चयनित कक्षों आगे एक दूसरे को साफ स्तंभ का उपयोग कर समृद्ध बनाया जा सकता, संस दोहराDure।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर दोनों नकारात्मक और सकारात्मक का चयन किया अंशों स्पिन और वांछित अंतिम मात्रा में निलंबित। ऐसे FACS, ELISPOT या दत्तक हस्तांतरण के रूप में नीचे की ओर विश्लेषण, के साथ आगे बढ़ें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
पवित्रता, उपज का विश्लेषण, और गुना संवर्धन से फ्लो का उपयोग कर
के रूप में वर्णित उपरोक्त अनिवार्य रूप से दूषित कोशिकाओं है कि streptavidin- दूर लाल फ्लोरोसेंट डाई के लिए बाध्य नहीं है, लेकिन मैट्रिक्स में फंस रहे हैं शामिल समृद्ध आबादी। इन अशुद्धियों FACS छँटाई से समृद्ध आबादी से हटाया जा सकता है। समृद्ध आबादी की पवित्रता का अनुमान है, जीवित कोशिकाओं पर फाटक आगे के आधार पर और पक्ष बिखराव और / या जी / मृत दाग और दूर लाल फ्लोरोसेंट डाई + सेल आवृत्ति विश्लेषण। इस बाद फाटक के भीतर प्रतिशत शुद्धता का संकेत है। इन कोशिकाओं की विशिष्टता और प्रतिजन समानता के आगे विश्लेषण एकल कक्षों की FACS छँटाई, क्लोनिंग और व्यक्त इम्युनोग्लोबुलिन जीन का अनुक्रमण और पुनः संयोजक एंटीबॉडी के उत्पादन और विश्लेषण के बाद की आवश्यकता है।
उपज पृथक antige की संख्या दर्शाता हैएन-बाध्यकारी बी कोशिकाओं अंश में बरामद शुरुआती आबादी (अंश डी) में नंबर करने के लिए एक रिश्तेदार। चूंकि कोशिकाओं की संख्या में एक ही अंश के रूप में अंश डी में थे, एक सीधे उपज (अंश में प्रतिजन बाध्यकारी बी कोशिकाओं अंश डी में प्रतिजन बाध्यकारी बी कोशिकाओं का एक ÷ # के #) निर्धारित कर सकते हैं।
गुना-संवर्धन (ई) "सकारात्मक" समृद्ध अंश में दूर-लाल-फ्लोरोसेंट रंजक + बी कोशिकाओं का प्रतिशत अंश डी में है कि एक रिश्तेदार यह मान विशिष्ट प्रतिजन बी द्वारा हासिल की कोशिकाओं में आनुपातिक वृद्धि इंगित करता है से परिलक्षित होता है nanoparticle संवर्धन। मान निम्न समीकरण का उपयोग कर पाया जा सकता है:
इस तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए, हम एक मॉडल के रूप में टिटनेस-toxoid (TET-Tox) का उपयोग कर प्राप्त प्रतिनिधि के परिणाम बताते हैंप्रतिजन का पता लगाने और विषयों, जो अलग-अलग समय बिंदुओं पर टिटनेस के खिलाफ टीका लगाया गया है के परिधीय रक्त में Tet-Tox प्रतिक्रियाशील बी कोशिकाओं के लिए समृद्ध है। चित्रा 1 विधि और प्रतिजन पी लेनेवाला के एक योजनाबद्ध है। चित्रा 2A एक व्यक्ति जो पिछले एक दशक पहले की तुलना में अधिक टिटनेस के खिलाफ टीका लगाया था से Tet-Tox प्रतिक्रियाशील बी कोशिकाओं की आवृत्ति से पता चलता है। दिखाया समृद्ध ( "सकारात्मक") और समाप्त ( "नकारात्मक") अंश एक और इसलिए अंश डी से Tet-Tox-विशिष्ट बी कोशिकाओं की आधारभूत आवृत्ति से आबादी, इस उदाहरण में हम चारों ओर से बाध्यकारी कोशिकाओं को समृद्ध करने में सक्षम हो रहे हैं 7 गुना और समृद्ध अंश में 4% की पवित्रता हासिल की।
चित्रा 2 बी रक्त का उपयोग प्रतिक्रिया एक विषय है जो 3 साल पहले ~ टीका लगाया गया था से की विशिष्टता से पता चलता है। जब हम addit पहले कोशिकाओं को लेबल हटाया गया टिटनेस-toxoid की एक 50 गुना अधिक (50 माइक्रोन) के लिए जोड़ाbiotinylated प्रतिजन (अंश बी) के आयन हम 83% से बाध्यकारी ब्लॉक करने के लिए, बंधन प्रतिजन की विशिष्टता का प्रदर्शन कर रहे हैं। जब हम प्रक्रिया (अंश सी) से biotinylated प्रतिजन, बी कोशिकाओं को अभी भी बंधे की एक छोटी संख्या (~ 0.2%) छोड़े गए; बी कोशिकाओं के इस छोटे से अंश शायद ऐसे streptavidin-दूर लाल-फ्लोरोसेंट रंजक, विरोधी दूर लाल फ्लोरोसेंट डाई एंटीबॉडी या चुंबकीय मोती के रूप में adsorbant में कुछ गैर प्रतिजन के लिए बाध्य, को दर्शाता है।
विधि के प्रयोग का प्रदर्शन करने के लिए और बूस्टर के बाद प्रतिजन बाध्यकारी सेल phenotype के बाद टीकाकरण में परिवर्तन हम चित्रा 3 भोले, स्मृति में Tet-Tox-विशिष्ट बी कोशिकाओं की आवृत्ति में दिखाने के लिए, और रक्त में plasmablast आबादी से पहले तैयार की गई 7 दिन विश्लेषण करने के लिए एक स्वस्थ विषय के टीकाकरण। कुल Tet-Tox बाध्यकारी बी कोशिकाओं के बीच भोले बी कोशिकाओं का प्रतिशत को बढ़ावा देने के बाद 64% से 84% से कम है, वहीं memor का प्रतिशतकुल Tet Tox प्रतिक्रियाशील कोशिकाओं के बीच Y और plasmablast आबादी, 40% से 36% और 0% से 16% से बढ़ाकर क्रमशः। चित्रा 3 बी 7 दिनों के बाद बढ़ावा देने के स्वस्थ विषय से परिधीय रक्त से प्रतिनिधि ELISPOT आंकड़ों से पता चलता। Tet-Tox बाध्यकारी बी कोशिकाओं के अलगाव टिटनेस toxoid एंटीबॉडी स्रावित सेल आवृत्ति में 4 गुना संवर्धन के लिए नेतृत्व किया।
चित्रा 1: का पता लगाने और टिटनेस toxoid (TET Tox) बी कोशिकाओं -binding के संवर्धन के लिए विधि। (ए) संवर्धन और Tet-Tox बाध्यकारी बी कोशिकाओं के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल। (बी) Tet-Tox बाध्यकारी बी कोशिकाओं की पहचान करने और समृद्ध करने के लिए कार्यरत पी लेनेवाला का आरेख। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
एन पेज = "1"> 
चित्रा 2: प्रतिनिधि cytograms Tet मानव परिधीय रक्त से बी कोशिकाओं Tox बाध्यकारी के संवर्धन का प्रदर्शन है। (ए) समृद्ध Cytograms और अंश एक और एक सामान्य विषय पिछले टीका लगाया> 10 साल पहले से भिन्न विकास से कुल Tet-Tox प्रतिक्रियाशील बी कोशिकाओं से समाप्त Tet Tox प्रतिक्रियाशील बी कोशिकाओं। (बी) के एक विषय 3 साल पहले से टीका लगाया ~ और ए (अंश) के रूप में समृद्ध से "सकारात्मक" आबादी, 50 उम के अतिरिक्त के साथ पूर्व ऊष्मायन के बाद से PBMCs के Cytograms लेबल नहीं किया गया Tet-Tox (अंश बी), या समृद्ध Tet-Tox बायोटिन प्रक्रिया (अंश सी) के दौरान छोड़े गए हैं। सभी विश्लेषण CD19 + लिम्फोसाइटों पर gated थे। प्रतिशत अंतिम अंश में सभी बी कोशिकाओं (CD19 +) के Tet-Tox बाध्यकारी कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं।ANK "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: प्रतिजन बाध्यकारी कोशिकाओं के पद-संवर्धन के विश्लेषण के उदाहरण हैं। (ए) प्रतिनिधि प्रवाह cytometric Tet-Tox बाध्यकारी बी कोशिकाओं के संवर्धन के बाद सेल phenotype का विश्लेषण। Cytograms पहचान और Tet-Tox प्रतिक्रियाशील भोले के विश्लेषण को दर्शाती (CD27 -), स्मृति (CD27 +), और 7 दिनों टिटनेस के खिलाफ बूस्टर टीकाकरण के बाद से पहले एक विषय के बी सेल उप-जनसंख्या और plasmablasts (CD27 ++ CD38 ++)। सभी कोशिकाओं को समृद्ध "सकारात्मक" आबादी से CD19 + लिम्फोसाइटों पर gated थे। (बी) एंटीबॉडी एक स्वस्थ विषय के परिधीय रक्त बो 7 दिनों के बाद से समृद्ध, समाप्त हो गया है, और कुल unenriched बी सेल भागों में कोशिकाओं स्रावित के प्रतिनिधि ELISPOT विश्लेषणOst। ELISPOT परख के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं पहले टिटनेस-toxoid की एक 10 माइक्रोग्राम / एमएल समाधान के साथ लेपित रहे थे। सेल निलंबन की दो गुना धारावाहिक dilutions, समृद्ध समाप्त हो, और कुल unenriched अंशों से बराबर एकाग्रता में कुओं में किए गए थे (थाली भर में) कोशिकाओं के साथ शुरू। एंटी टिटनेस प्रतिरक्षी कोशिकाओं स्रावित biotinylated विरोधी मानव आईजीजी (एल एंड एच), streptavidin-एपी के द्वारा पीछा के साथ पाया गया। प्लेट ELISPOT विकास बफर के साथ विकसित किया गया था और प्रतिक्रिया प्लेट डबल आसुत एच 2 ओ रेखीय श्रृंखला में एक सेल कमजोर पड़ने पर स्पॉट की संख्या निर्धारित किया गया था के साथ तीन बार धोने से बंद कर दिया गया था, और ASCs की संख्या की गणना की गई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ हम अलगाव और मानव परिधीय रक्त से प्रतिजन बाध्यकारी बी कोशिकाओं के संवर्धन को पूरा करने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन है। विधि चूहों के लिए और इस तरह के प्लीहा और लिम्फ नोड्स के रूप में अन्य ऊतकों, के लिए आसानी से लागू है, और सेल phenotype और समारोह (तैयारी में पांडुलिपि) के पद-संवर्धन के विश्लेषण के साथ संगत है।
उपयोगकर्ता चर है कि इस प्रक्रिया की सफलता को प्रभावित कर सकते हैं की एक संख्या का जानकार होना चाहिए। अनुभव से मृत कोशिकाओं को गैर विशिष्ट वृद्धि की पृष्ठभूमि के लिए अग्रणी, चुंबकीय मोतियों से चिपके रहते हैं और इस तरह के streptavidin-दूर लाल फ्लोरोसेंट रंजक के रूप में फ्लोरोसेंट रंजक, "ऊपर" ले जाते हैं। यह इस प्रक्रिया की शुरुआत से पहले संभव के रूप में नमूने के रूप में कई मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है। दाग है कि गेट बाहर विश्लेषण से मृत कोशिकाओं को लाइव / मृत भेदभाव सक्षम के उपयोग के लिए सहायक हो सकता है, लेकिन मृत कोशिकाओं की उपस्थिति सेल आवृत्ति स्रावित एंटीबॉडी के परीक्षणों की व्याख्या समझौता हो सकता है औरसमारोह दत्तक हस्तांतरण के बाद।
इसके अलावा, हमने पाया है कि biotinylated प्रतिजन जोड़ा सावधान अनुमापन विशिष्ट प्रतिजन और गैर विशिष्ट बंधन भेद करने के लिए आवश्यक है। बहुत कम प्रतिजन का प्रयोग करें, प्रतिजन बाध्यकारी कोशिकाओं की आवृत्ति के मूल्यवान समझना के लिए नेतृत्व करते हुए बहुत ज्यादा प्रतिजन झूठी सकारात्मक पता लगाने / संवर्धन का कारण बन सकता है। प्रतिजन सांद्रता है कि बहुत अधिक हो सकता है का प्रयोग स्पष्ट नमूनों में गैर-बी कोशिकाओं के बंधन से संकेत दिया जा सकता है। इसके अलावा, एक अत्यधिक उच्च आवृत्ति प्रतिजन की (> 1%) के स्पष्ट पता लगाने प्रतिक्रियाशील कोशिकाओं विशिष्टता मुद्दे बाध्यकारी का एक संकेत हो सकता है। अंतिम लक्ष्य जब प्रतिजन का उपयोग करने की अधिकतम राशि का निर्धारण करने के लिए थोड़ा और अधिक प्रतिजन की तुलना में शारीरिक सांद्रता में मौजूद है, ऐसे जोड़ने के लिए है कि उदाहरण के लिए, के लिए, <10 -6 एम के एक आत्मीयता के साथ बी सेल रिसेप्टर्स के बहुमत प्रतिजन संतृप्त कर रहे हैं। यह सुनिश्चित करता है कि विशिष्ट प्रतिजन बी कोशिकाओं ख रहे हैंएक आकर्षण रोगजनक क्षमता है के साथ पाया eing। बहुत कम प्रतिजन, पर या शारीरिक सांद्रता नीचे यानी के अलावा, बहुत कुछ विशिष्ट प्रतिजन बी की वजह से कोशिकाओं का पता लगाने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं BCRs के प्रतिजन कब्जे में कमी आई है। दूसरी ओर, बहुत ज्यादा प्रतिजन, अब तक शारीरिक सांद्रता से अधिक के अलावा, वृद्धि गैर विशिष्ट बंधन का कारण बन सकता है जो प्रतिजन (> 10 -6 एम) के लिए एक कम आत्मीयता के साथ बी कोशिकाओं में शामिल हैं और वास्तव में प्रतिजन से अनभिज्ञ हैं होगा विवो में। इसलिए, यह पहली बार में कुछ लॉग भर biotinylated प्रतिजन titrate करने के क्रम में पूरा विश्वास है कि केवल सच प्रतिजन प्रतिक्रियाशील बी कोशिकाओं का पता चला जा रहा है होना करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसी तरह, हम बहुत ज्यादा streptavidin-दूर लाल फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करें कि पाया है पृष्ठभूमि में वृद्धि कर सकते हैं।
यह भी ध्यान दें कि प्रतिजन की biotinylation प्रतिजनी epitopes की उपलब्धता को प्रभावित कर सकते हैं महत्वपूर्ण है। इसलिए, विभिन्न biotinylation का उपयोग कर अनुकूलन से मुलाकात कीविभागाध्यक्षों महत्वपूर्ण हो सकता है। वैकल्पिक रूप से बायोटिन प्राथमिक amines, तृतीयक amines, sulfhydryls, या carboxyl समूहों को मिलकर किया जा सकता है। विस्तारित स्पेसर हाथ लंबाई के उपयोग steric बाधा को कम करने से मिलान उपलब्धता में सुधार कर सकते हैं।
इस तकनीक को सीमाओं में से एक ताजा कोशिकाओं की तुलना में cryopreserved से प्रतिजन बाध्यकारी बी कोशिकाओं के संवर्धन के लिए अपनी कम प्रभाव है। यह अधिक से अधिक कोशिका मृत्यु और संबद्ध "चिपचिपा" जमे हुए नमूनों में से संबंधित हो सकता है। बहरहाल, विधि जमे हुए नमूने के लिए लागू किया जा सकता है लेकिन यह सीधे संवर्धन और ताजा और जमे हुए कोशिकाओं के विश्लेषण से परिणाम नहीं तुलना करने के लिए शायद महत्वपूर्ण है। एक और सीमा समृद्ध नमूने में विशिष्ट प्रतिजन बी कोशिकाओं की पवित्रता है। अनुभव से, वहाँ हमेशा कुछ कोशिकाओं रहे हैं कि "के साथ टैग" है, जो दोनों गैर विशिष्ट बी कोशिकाओं और टी कोशिकाओं भी शामिल है। यह उम्मीद की सेल की आबादी की दुर्लभता दिए जाने पर संतुष्ट करने के लिए कोशिश कर रहा है। हालांकि, टी की शुद्धतावह कोशिकाओं सुनिश्चित करने, या विशिष्ट प्रतिजन बी कोशिकाओं छँटाई FACS द्वारा कि एक एकल कक्ष निलंबन स्तंभ के लिए कोशिकाओं को जोड़ने, एक नया स्तंभ पर एक दूसरी बार समृद्ध बनाने से पहले प्राप्त की है से वृद्धि हो सकती है। अध्ययन के प्रकार पर निर्भर करता है, शोधकर्ता तय कर सकते हैं जो सबसे अच्छा विकल्प है और क्या यह आवश्यक है।
हम इस तकनीक को अनुकूलित के रूप में हम कल्पना की है कि यह कम आत्मीयता के प्रतिजन प्रतिक्रियाशील प्रतिजन अनुमापन या धुंधला तीव्रता के आधार पर कोशिकाओं की तुलना में उच्च आत्मीयता के भेदभाव के लिए उत्तरदायी होगा। हालांकि, पिछले एक अध्ययन में, हम प्रतिजन प्रतिक्रियाशील बी कोशिकाओं से पता चला है के साथ उनके प्रतिजन के लिए आकर्षण में 1,000 गुना अंतर करने के लिए समान रूप से इस पद्धति का उपयोग करते हुए 7 समृद्ध थे। इसलिए, व्यक्त पुनः संयोजक प्रतिजन रिसेप्टर्स की सतह plasmon अनुनाद विश्लेषण का उपयोग कर समृद्ध कोशिकाओं की आत्मीयता की औपचारिक माप यदि अपनत्व का ज्ञान अध्ययन के लिए प्रासंगिक है की आवश्यकता है।
इस तकनीक में निहित है lनकली कि biotinylated प्रतिजन और streptavidin के अलावा के पार से जोड़ने बीसीआर द्वारा कोशिकाओं को सक्रिय कर सकते हैं। इस तरह उन है कि एक आराम कर नियंत्रण करने के लिए प्रेरित कोशिकाओं की तुलना करने की तलाश के रूप में विशेष रूप से नीचे की ओर कार्यात्मक assays, के लिए एक समस्या बन सकता है। यह समस्या संकेतों के पारगमन को रोकने के लिए ठंड नियंत्रण नमूने रख कर कम किया जा सकता है। यह भी संभव है कि बीसीआर संकेतों चल रहे एक जैविक प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता है। अनुभव से प्रतिजन समृद्ध कोशिकाओं के रूप में ELISPOT विश्लेषण (चित्रा 3 बी) और प्रतिजन कोशिकाओं पेश विट्रो में टी कोशिकाओं के रूप में और चूहों में दत्तक हस्तांतरण के बाद समारोह ने संकेत दिया, एंटीबॉडी स्रावित करने की क्षमता को बनाए रखने के (नहीं दिखाया डेटा)। इस तकनीक के लिए एक अंतिम सीमा प्रतिजन adsorbed कोशिकाओं के लिए बाध्य nanoparticle पूरा करने के लिए विरोधी fluorochome एंटीबॉडी का इस्तेमाल होता है। विरोधी दूर लाल फ्लोरोसेंट डाई Cy7 और Cy5.5 सहित कुछ संरचनात्मक रूप से संबंधित fluorochromes, साथ पार प्रतिक्रिया करते हैं। इस विकल्प को सीमित कर सकते हेएफ एंटीबॉडी प्ररूपी मार्कर की माप के लिए उपलब्ध conjugates। बहरहाल, नए fluorochromes की वृद्धि की उपलब्धता के साथ, इस एक मुद्दे के कम होता जा रहा है।
इस का पता लगाने और संवर्धन विधि का प्रयोग, यह आसानी से पूर्व vivo परिधीय रक्त, तिल्ली, या अन्य ऊतकों में प्रतिजन बाध्यकारी बी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए संभव है। इस विधि के टीकाकरण या विदेशी एंटीजन को और autoimmune रोग की सेटिंग में प्रदर्शन के बाद प्रतिजन प्रतिक्रियाशील कोशिकाओं की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अध्ययन में विशेष रूप से उपयोगी है। हालांकि प्रतिजन प्रतिक्रियाशील बी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए कोई विधि अपनी गलतियों के बिना साबित हो गया है, इस विधि तेज, सरल है, और एक अपेक्षाकृत उच्च शुद्धता, उपज, और संवर्धन प्रतिजन प्रतिक्रियाशील कोशिकाओं की है कि नीचे की ओर की एक किस्म के लिए मिलकर किया जा सकता है उत्पादन assays। इसके अलावा, विधि के बुनियादी सिद्धांतों के कारण, इस प्रक्रिया को आसानी से प्रयोगात्मक जरूरतों की एक किस्म के अनुरूप किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
