Este protocolo mostra como para excisar consistentemente olhos planarian (copos óptica), sem perturbar os tecidos circundantes. Utilizando uma agulha de seringa de insulina e, de um ou ambos os olhos pode ser cauterizado para facilitar investigações sobre os mecanismos que regulam a regeneração do olho, a evolução de regeneração visual, e a base neural de comportamento induzida pela luz.
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Artigo de método
Surgical Ablation Ensaio para Estudar Eye Regeneração em Planárias
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
No estudo de células estaminais adultas e os mecanismos regenerativos, vermes planarian são um grampo no sistema modelo in vivo. Isto é devido em grande parte à sua população de células-tronco pluripotentes abundante e capacidade de regenerar todos os tipos de células e tecidos após lesões que seria catastrófico para a maioria dos animais. Recentemente, planárias ganharam popularidade como um modelo para a regeneração olho. A sua capacidade de regenerar todo o olho (composto de dois tipos de tecidos: células pigmentares e fotorreceptores) permite a dissecção dos mecanismos que regulam a regeneração sistema visual. ablação do olho tem diversas vantagens sobre outras técnicas (tais como a decapitação ou furador) para examinar as vias e os mecanismos específicos do olho, o mais importante dos quais é que a regeneração é largamente restringida a tecidos oculares sozinho. A finalidade deste artigo vídeo é para demonstrar como para remover de forma fiável a taça óptica planarian sem perturbar o cérebro ou tecidos circundantes.O tratamento de vermes e manutenção de uma colónia criada também é descrito. Esta técnica utiliza uma 31 L, agulha de insulina 16/05 polegadas para colher cirurgicamente para fora a cúpula óptica de planarians imobilizados numa placa fria. Este método engloba tanto simples e dupla ablação olho, com olhos de regeneração no prazo de 1-2 semanas, para permitir que uma ampla gama de aplicações. Em particular, esta técnica de ablação pode ser facilmente combinado com (interferência de ARN) telas farmacológicas e genéticas para uma melhor compreensão dos mecanismos de regeneração e da sua evolução, células estaminais do olho e a sua manutenção, e respostas comportamentais phototaxic e sua base neurológica.
Introdução
Planárias são um poderoso organismo modelo para o estudo da regeneração mediada por células-tronco adultas. Estes vermes de água doce não-parasitárias possuem a capacidade de regenerar a quaisquer e todos os tecidos em falta, incluindo o sistema nervoso central e do cérebro 1. Estudado, tanto para trás como os 1700s 2, avanços tecnológicos no domínio planarian durante os últimos 10-15 anos (tais como um genoma sequenciado, hibridao in situ, imuno-histoquímica, de ARN de interferência (ARNi), e transcriptómica) ter actualizado este organismo modelo histórico . Especificamente, planárias recentemente ganhou popularidade como um modelo emergente de pesquisa olho 3.
Planárias têm olhos prototípicas com apenas dois tipos de tecido, os neurónios fotorreceptores e células de pigmento; esta permitiu a caracterização da sua população de células-tronco olho e demonstrado que muitos dos mesmos genes regulando vertebrado de olhosenvolvimento são conservados em planarians 4, 5. Os copos óptica estão localizados dorsalmente e composta dos dendritos branco, não pigmentadas dos neurónios fotorreceptores e as células de pigmento preto semi-lunar, e os olhos inervam o cérebro através de um quiasma. Além de ser um modelo para elucidar os processos regenerativos 6, o olho planarian é bem adequado para o estudo da evolução de mecanismos visuais 7, as respostas comportamentais a luz (planarians exibir fototaxia negativo) 8, e a base neurológica de comportamento 9.
Regeneração olho em planarians tem sido largamente estudada em dois contextos principais: como parte de regeneração da cabeça seguinte decapitação 4, 10, e após a excisão de apenas os tecidos do olho 11, 12 . A maioria dos estudos sobre a regeneração planarian olho têm usado o método de decapitação, como é simples e direta. O método de excisão olho planarian mais comum até à data tem sido através de perfuração com um tubo capilar de vidro fino 13, 14, embora alguns estudos também realizada amputações apenas por trás dos olhos (decapitação parcial) 15. No entanto, todos estes métodos envolvem a perda de muitas outras do que apenas o olho tecidos (tais como tumores do cérebro, intestinos, e nefrídios), potencialmente complicar a interpretação dos resultados. O protocolo de ablação olho aqui apresentada restringe a excisão para os tecidos do olho (excluindo especificamente cerebral), resultando em dados que são mais específicos para o olho. Além disso, ao contrário de vermes decapitados que levam 7-14 dias para iniciar a alimentação, olho ablated vermes irá alimentar dentro de 24 h de ablação 12, permitindo que as experiências de ARNi (onde ARNi é entregue através dos alimentos) para ser performed concorrentemente.
Embora a ablação do olho é tecnicamente mais difícil de executar com êxito do que a decapitação, estudos atuais que envolvem a excisão olho não incluíram instruções detalhadas sobre os seus procedimentos. O objetivo deste artigo vídeo é para permitir aos investigadores para remover consistentemente o copo óptica planarian sem perturbar os tecidos cerebrais subjacentes e removendo como alguns outros tecidos quanto possível. Este método pode ser utilizado para ambos simples e dupla ablação olho e é aplicável a uma vasta gama de investigações. Como a maioria dos ensaios de regeneração, ablação olho é bem adequado para combinação com ambas as telas farmacológicas e genéticas (ARNi), bem como estudos comportamentais. Aqui nós descrevemos métodos para o tratamento de vermes, mantendo uma colônia planarian, ea técnica de ablação de olho em si.
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Protocolo
1. Cultura Animal e Manuseamento
NOTA: Este protocolo utiliza mediterranea Schmidtea, uma espécie planarian diplóides com um genoma seqüenciado 16, 17 que é comumente usado para a pesquisa de regeneração. No entanto, o ensaio é igualmente bem sucedido com outras espécies, tais como Girardia Tigrina e Girardia dorotocephala (que se encontram comercialmente disponível).
- Manter vermes em "água verme" feitos a partir de sais / L 0,5 g do mar em ultrapura (ou desionizada filtrada) água. Use de polipropileno ou de vidro recipientes estéreis para segurar a água sem-fim. Ver Documento Suplementar 1 para obter detalhes sobre a preparação de água worm.
NOTA: Não utilizar sabão para limpar recipientes (ou de outras fontes) como o sabão é tóxica para vermes; em vez limpar com etanol a 70% e deixar secar ao ar.- Usar luvas ao trabalhar com planaria para protegê-los de qualquer contaminação.
NOTA: Worms são muito sensíveis às toxinas e substâncias químicas ambientais, incluindo sabão, água sanitária, xampu, condicionador e loção de mão.
- Usar luvas ao trabalhar com planaria para protegê-los de qualquer contaminação.
- colónias de casas em recipientes de alimentos de polipropileno, com a tampa parcialmente aberta esquerda para a troca de ar a ~ 20 ° C (temperatura ambiente). Loja sem-fins experimentais, nem em placas de petri (20 vermes por placa de 100 mm) ou placas não-tratados de cultura de tecidos (um sem-fim por po, para placas de 12 poços). Para reduzir o estresse, manter ambas as colônias e experiências no escuro.
NOTA: Colonies não deve ter mais do que 500-1.000 vermes por litro de água worm. Para experiências, deixe tampas plenamente em vigor, uma vez que o fluxo de ar é projetado para esses pratos. - Alimentar vermes não experimentais, uma vez por semana com puré carne orgânica ou fígado de galinha, largando puré de uma pipeta de transferência, colocando gotas de alimentos ao longo do recipiente. Permitir vermes 2 h para consumir alimentos naescuro antes de limpar o recipiente (ver passo 1.4). Antes de usar, puré de armazenar a -20 ° C durante curto prazo (semanas) ou -80 ° C durante a longo termo (em meses); não recongelar puré para re-utilização (como bactérias podem florescer e prejudicar os vermes).
NOTA: Fígado não deve conter hormonas ou antibióticos e de preferência não ser previamente congelados. Centrífuga puré antes da congelação (ou antes da alimentação) para remover o ar e impedir que o alimento flutuante. Os alimentos devem desviar para o fundo do recipiente. 1 mL de puré é suficiente para 500-1.000 vermes. - água troca uma vez por semana com água verme fresco para ambas as colônias e experimentos. recipientes de colónias também deve ser limpo com uma toalha de papel não branqueada (para remover os resíduos de muco que os resíduos trap) uma vez por semana para fome vermes, ou duas vezes por semana para os vermes alimentam (2 h após a alimentação e outra vez de 2 dias mais tarde). A fim de reter o biofilme, não limpe mais do que 80% do recipiente.
- Mover vermes entre os recipientes (ou setu cirurgiap) usando uma pipeta de transferência. Para vermes livres aderidas às superfícies do recipiente, esguichar água sobre / por trás do sem-fim de libertá-lo da superfície. Em seguida, aspirar o sem-fim para a pipeta, ao tentar manter o sem-fim no interior da parte inferior polegada (mais fina) da pipeta.
- pipetas protelar com uma pequena quantidade de água verme antes de sugar-los.
- Tente mover a água ao redor do worm, ao invés do próprio verme, para ajudar a prevenir rasgando vermes de corpo mole por tocá-los com a pipeta.
- Manter pratos cobertos experimentais, a menos que a transferência de vermes ou substituir a água.
2. Preparação
- Suspender a administração vermes pelo menos uma semana antes das experiências.
- Selecione vermes que não foram alimentados durante pelo ≥1 semana e são pelo menos 5-7 mm de comprimento. Transferir os vermes para uma placa de Petri de 2/3 cheio de água sem-fim, e confirmar comprimento sem fim por uma régua de deslizamento debaixo do prato. Meça wORMs enquanto totalmente estendida e em movimento.
NOTA: Embora menor (5-7 mm) vermes funcionam melhor quando se realiza imunofluorescência posterior e em análises de hibridização in situ, vermes maiores (8-10 mm) são mais fáceis de trabalhar com - especialmente quando aprender a ablação. - Certifique-se de que os vermes são inteiro, intacto, e não recentemente regenerar.
NOTA: Regeneração vermes terá muito mais leve (ou não) do pigmento na cabeça e / ou a região da cauda, em comparação com vermes normais. - Se realizar ARNi ou tratamentos farmacológicos em vermes, fazê-lo neste momento. Se vermes foram alimentados como parte do tratamento (como por RNAi), esperar, pelo menos, 7 dias após a última alimentação, antes de continuar para o passo 2.2.
- Selecione vermes que não foram alimentados durante pelo ≥1 semana e são pelo menos 5-7 mm de comprimento. Transferir os vermes para uma placa de Petri de 2/3 cheio de água sem-fim, e confirmar comprimento sem fim por uma régua de deslizamento debaixo do prato. Meça wORMs enquanto totalmente estendida e em movimento.
- Limpar a base do microscópio de dissecção e o espaço de trabalho com 70% de etanol e deixar secar completamente. Coloque o prato de vermes selecionados para a esquerda do escopo. Para a direita do âmbito, colocar um par de fórceps # 5, uma agulha 31 G 5 de insulina / 16 polegadas com um 1ml de uma seringa, e uma pipeta de transferência limpa.
- Certifique-se de que os instrumentos são mantidos de tocar o banco (o que poderia introduzir contaminantes). Utilizar um produto rígido (tal como um resto pauzinho) para manter a pinça, agulha, pipeta e limpo. Alternativamente, instrumentos lugar na parte superior de um castanho (não branqueada) toalha de papel fresca.
NOTA: Estas e subsequentes instruções são escritas em que dizem respeito a indivíduos destros. indivíduos canhotos devem reverter as direções Direita / Esquerda.
- Certifique-se de que os instrumentos são mantidos de tocar o banco (o que poderia introduzir contaminantes). Utilizar um produto rígido (tal como um resto pauzinho) para manter a pinça, agulha, pipeta e limpo. Alternativamente, instrumentos lugar na parte superior de um castanho (não branqueada) toalha de papel fresca.
- Ao lado do espaço de trabalho, colocar uma caixa de lenços de tecido sem fiapos, uma fonte de água fresca verme, e algumas pipetas de transferência extra (protegidas da bancada). água verme lugar em um frasco de lavagem de plástico para facilitar a distribuição. Também colocar uma placa marcada de 12 poços (ou 100 milímetros placa de Petri) para a direita da margem para recolher animais ablação.
- Se estiver usando uma placa Peltier feitos sob medida para imobilizar vermes, posicione a placa de Peltier na depressão em tele base do microscópio de dissecação e ajustar a saída da fonte de energia DC até que a superfície de trabalho da placa de Peltier é suficientemente frio (tipicamente ~ 5 V) .Alternatively, fazer uma placa fria por enchimento de uma placa de Petri de 100 mm cheia com água ½ e congelar durante pelo menos 24 h. Descartar a tampa e colocar a parte inferior da placa de 100 mm na base do escopo de dissecação, em seguida, colocar a tampa de um prato de 60 mm Petri de cabeça para baixo directamente sobre a superfície do gelo (Figura 1A).
- Depois de congelada a água na placa de 100 mm, de um "vulcão" de gelo pode aparecer no centro da placa. Se isto acontece, utilizar uma lâmina de barbear para raspar o plano de gelo, para remover quaisquer irregularidades da superfície.
NOTA: Durante cirurgias o gelo vai derreter, fazendo ablações muito mais difícil. Prepare vários pratos de gelo com antecedência, e substituir os congelados para derreter queridos durante o ensaio, logo que a tampa do prato 60 milímetros começa flutuante.
- Depois de congelada a água na placa de 100 mm, de um "vulcão" de gelo pode aparecer no centro da placa. Se isto acontece, utilizar uma lâmina de barbear para raspar o plano de gelo, para remover quaisquer irregularidades da superfície.
- Prepare osuperfície cirurgia. Cortar um pedaço de 5 cm x 10 cm de película de plástico de parafina (4 cm 2, se utilizar a placa de petri placa fria) e colocá-lo sobre o centro do dispositivo de imobilização. Dobre um tecido que não solte fiapos limpar em uma praça a cerca de 2 cm2 e colocá-lo no topo do filme. Cortar um pedaço de papel de filtro branco 1,5-2 cm2 e colocá-lo em cima da toalhita. Ver Figura 1B-1E.
- Segure o dobrado acabar no lugar com um dedo de luva, e usar água worm para umedecer levemente o pano para garantir que ele permaneça dobrado. Utilizar o lado de uma pipeta de transferência para rolar a limpar plana.
NOTA: temperatura fria ajuda a manter os vermes de se mover. Trabalhando "seco" também ajuda a imobilização. O lenço de papel age de pavio de água através do papel de filtro, mantendo o verme húmido durante a cirurgia sem permitir vermes a secar completamente (que é letal).
- Segure o dobrado acabar no lugar com um dedo de luva, e usar água worm para umedecer levemente o pano para garantir que ele permaneça dobrado. Utilizar o lado de uma pipeta de transferência para rolar a limpar plana.
3. ablação cirúrgica
- Use uma pipeta de transferência para colocar emlado e verme dorsal para cima sobre o papel de filtro. Ligue a fonte de luz e dirigir as goosenecks para que a luz é focada no worm. Ajuste o foco escopo dissecar e ampliação para que os olhos são claramente visíveis (todo o worm não precisa ser à vista); 5X é um bom ponto de partida. Orientar o verme ao rodar o filme de parafina de forma que a cabeça é apontada em direcção ao investigador (na direcção da frente do microscópio), em ângulo de 30-40 graus para a direita.
- Evitar o uso de luz brilhante para prevenir o excesso de movimento sem-fim. Planárias exibir fototaxia negativos e tentará fugir luz brilhante.
- Se o sem-fim está posicionada lado ventral para cima (com faríngea abertura visível), utilizar o lado opaco do fórceps para reposicionar suavemente lado do sem-fim dorsal para cima (com olhos visíveis). Evitar a aproximar-se do animal com a ponta afiada da pinça para minimizar a possibilidade de rasgar através dos tecidos moles, quando o reposicionamento do animal.
- Ajuste o foco do microscópio para que os olhos são claramente em foco. Também garantir que ambos os olhos e tecidos circundantes cabeça estão à vista.
- Realizar uma nova agulha / seringa na mão direita, como se fosse uma caneta (entre o polegar e o dedo indicador). Prepare o polegar esquerda contra a placa de Peltier (ou placa de Petri placa fria), e utilizar o polegar esquerdo como um ponto de apoio sobre a qual a parte inferior da seringa vai descansar (Figura 2A). Olhe através do microscópio, e certifique-se o bisel da agulha é visível.
NOTA: As agulhas são muito afiadas. Seja cauteloso ao lidar com eles. Vestindo látex ou nitrilo podem oferecer alguma proteção.- Use o polegar esquerdo para ajudar a segurar a agulha / seringa constante durante todo o procedimento e evitar apertando as mãos.
- Faça um ângulo de aproximadamente 40 ° com o polegar esquerdo e dedo indicador esquerdo (com o dedo indicador sobre a superfície da cirurgia) para ajudar a segurar o estável superfície cirurgia.
- Como bisel da agulha voltada para cima (como uma colher), a posição da agulha em ângulos rectos para o olho (Figura 2B). Utilizar a ponta da agulha para penetrar suavemente a fina camada de tecido que cobre o copo óptica (branco, região não pigmentado) do olho, escavando a partir da direita para a esquerda. Muito gentilmente remover qualquer tecido pigmentado localizado dentro do cálice óptico, tomando cuidado para não perfurar a parte inferior ou destruir as fronteiras do cálice óptico.
- Se o sem-fim tem sido no papel de filtro durante> 1-2 min a qualquer momento durante o procedimento, adicionar uma gota de água sem-fim de re-hidratar o sem-fim.
NOTA: A desidratação irá aumentar a susceptibilidade do worm a lesões rasgando.
- Se o sem-fim tem sido no papel de filtro durante> 1-2 min a qualquer momento durante o procedimento, adicionar uma gota de água sem-fim de re-hidratar o sem-fim.
- Repetir o passo 3.3 até que todos os tecidos pigmentados de preto (células de pigmento), bem como todos os tecidos brancos do copo óptica (dendritos das células fotorreceptoras), são removidos. Remover tecidos excisados preso à extremidade da agulha, limpando cuidadosamente com um lenço de papel. Se abla dupla olhoção é pretendida, ablação do segundo olho neste ponto.
NOTA: Para evitar ferimentos, as agulhas podem ser limpos por agarrar a agulha com um tecido limpo toalhete realizada com o polegar e o indicador, em seguida, usando a outra mão para puxar a agulha através da enxugar do polegar e o indicador. Alternativamente, a agulha pode ser varrida sobre a superfície de um tecido de esfregão húmido e examinados para limpeza. - Quando terminou, utilizar uma pipeta de transferência para mover o sem-fim a um prato marcado contendo água fresca sem-fim. Se a análise de dados de grupo, coloque até 20 vermes em um único 100 milímetros placa de Petri. Se rastreamento de regeneração nos mesmos indivíduos ao longo do tempo, coloque 1 verme em cada poço de uma placa de 12 poços. Uma vez que todos os vermes são transferidos, enxaguar vermes, removendo toda a água sem-fim dos pratos / poços e substituindo com mais água fresca sem-fim.
- Para remover vermes do filtro, protelar a pipeta com uma pequena quantidade de água sem-fim e libertar a água para o sem-fim. Isso deve levantar tele verme fora do papel de filtro, para ser imediatamente sugado para dentro da pipeta para transferência.
- Incubar experiências a ~ 20 ° C (temperatura ambiente) protegidas da luz e acompanhar o processo regenerativo.
NOTA: Worms pode ser armazenado em uma incubadora com temperatura controlada para manter uma temperatura constante, mas isso não é estritamente necessário. A maioria das temperaturas ambientes variam apenas por 5 ° C, o que não irá afectar a capacidade do sem-fim de regenerar. - Se desejado, corrigir vermes para imuno-histoquica (ver Figuras 3-4) e / ou em análises de hibridação in situ da expressão do gene. Existem diferentes métodos de fixação para imuno-histoquímica planarian 18, 19, 20 e a hibridização in situ 21, 22, 23 protocolos.
- Na celebração dos experimentos, sacrifice viver vermes através da remoção de água sem-fim do prato e substituindo com etanol a 70%. Incubar vermes para 3-5 min, a verificação de vermes para lisar e transformar acinzentada.
- Coloque vermes não tratados no fluxo de resíduos normal uma vez que sacrificado. Evitar a introdução de vermes vivos no ambiente, particularmente espécies não-nativas.
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Resultados
Para o primeiro 1-2 h após a cirurgia, os animais podem apresentar movimento diminuiu em comparação com vermes intactos (no entanto, eles ainda se move). Se desejado, vermes vai comer dentro de 24 horas após a cirurgia (por exemplo, para a alimentação de RNAi). Ao seguir a regeneração olho nos mesmos indivíduos ao longo do tempo, certifique-se para tirar uma fotografia de cada verme tanto antes da cirurgia (intacto) e em 1 h após ablação (HPA). Ao fim de 4 dias após a ablação (DPA) regen...
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Discussão
Esta técnica de ablação olho melhora sobre os métodos correntes (tais como furador) por excluindo os tecidos cerebrais e restringindo excisão principalmente para os tecidos do olho. Com a prática, esta técnica pode ser realizada pela maioria dos indivíduos, de técnicos experientes em microcirurgias para estudantes de graduação inexperientes, mas de consciência. Recomenda-se que esta técnica ser praticadas muitas vezes antes de usar ablações em experimentos, incluindo (quando possível) confirmação de remoção completa de ...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de obrigado Michelle Deochand para aperfeiçoar esta técnica de ablação olho, Taylor Birkholz para assistência com o ensaio funcional, Michael Levin para o anticorpo anti-arrestina, e Junji Morokuma para obter informações sobre as placas de Peltier. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa SFSA da Western Michigan University para WSB.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sais marinhos instantâneos do oceano | Spectrum Brands | SS15-10 | "10 Galões" caixa (peso líquido 3 libras) |
| Kimwipes EX-L limpeza de lenços de papel sem fiapos | Kimberly-Clark | 34155 | 4.5 x 8.5 in |
| Whatman #2 papel de filtro | Sigma | WHA1002125 | Círculos, 125 mm de diâmetro, branco |
| Seringa de insulina Easy Touch (com agulha) | Pet Health Market | 17175-04 | Seringa U-100 de 1 cc, 31 G 5/16 in agulha |
| 100 mm Placa de Petri | VWR | 25384-342 | 100 mm x 15 mm |
| 60 mm Placa de Petri | VWR | 25384-092 | 60 mm x 15 mm |
| Dumont #5 pinça | Fine Science Tools | 11254-20 | Inox, ponta reta, pipetas de transferência de 11 cm |
| Samco Scientific | 225 | Graduado, lâmpada grande, 7.5 mL, não estéril | |
| Parafilm M filme de parafina | Marca | 701606 | Rolo de 4 in x 125 ft |
| Placa de cultura de tecidos não tratada de 12 poços | VWR | 15705-059 | Não tratada, fundo plano, estéril, marca Falcon |
| Recipientes de plástico para alimentos (para colônia) | Ziploc | Grande retângulo | 2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16" |
| Planaria (Girardia tigrina) | Carolina Biological | 132954 | Vendida como Planaria "Marrom"; na maioria das vezes são G. tigrina (também conhecido como Dugesia tigrina), mas às vezes são G. dorotocephala (também conhecido como Dugesia dorotocephala); qualquer um funcionará. |
| Planaria (Schmidtea mediterranea) | n/a | n/a | S. mediterranea não estão disponíveis comercialmente. No momento, os animais só podem ser obtidos em laboratórios que os utilizam e têm animais extras. |
| Toalhas de papel marrom | Grainger | 2U229 | 9-3/16 x 9-3/8", garrafa de lavagem NÃO BRÍQUEADA |
| (para água de verme), | VWR | 16650-275 | , polietileno de baixa densidade, boca larga, 500 mL |
| de anticorpo anti-sinapsina, opcional | Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma | 3C11 | Sobrenadante |
| anticorpo anti-arrestina, opcional | n/a | n/a | Não disponível comercialmente. Presente gentil de Michael Levin, Tufts University |
| Nalgene Lowboy garrafão com torneira (para armazenar água de minhoca), opcional | Nalge Nunc International Corporation | 2324-0015 | 15 L, polipropileno, perfil baixo facilita o enchimento de recipientes plásticos de colônias |
| Placa Peltier personalizada, máquina Williams opcional | , Foxboro, MA | n/a | Especificações do design cortesia de Junji Morokuma, Tufts University: A placa Peltier é construída com uma bomba de calor termoelétrica padrão (por exemplo, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2). A bomba de calor quadrada é coberta com uma fina superfície espelhada e, em seguida, colocada dentro de um orifício quadrado de 30 mm2 em forma circular de plexiglass (~50 mm de diâmetro). Esta forma é de espessura semelhante à bomba de calor e se encaixa em um poço trabalhado no centro de um dissipador de calor redondo (~ 115 mm de diâmetro). A forma/bomba de calor é "ancorado" ao dissipador com composto do dissipador de calor da base do silicone. Os cabos são enfiados através de orifícios perfurados na forma e no dissipador de calor. A metade inferior do dissipador de calor é trabalhada em um "pé" que se encaixa na abertura da placa de base do seu microscópio. |
| Fonte de alimentação DC (para placa Peltier), opcional | B & K Precision | 1665 | Fonte de alimentação CC de baixa tensão regulada, 1-18 V (DC), 1-10 amperes. |
| Outros suprimentos | |||
| Luvas | |||
| Lâmina de barbear | |||
| Tesoura | |||
| Dissecando o escopo com iluminação | |||
| O pauzinho descansa, opcional |
Referências
- Gentile, L., Cebria, F., Bartscherer, K. The planarian flatworm: an in vivo model for stem cell biology and nervous system regeneration. Dis Model Mech. 4 (1), 12-19 (2011).
- Elliott, S. A., Sanchez Alvarado, A. The history and enduring contributions of planarians to the study of animal regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (3), 301-326 (2013).
- Emili Saló, R. B. Chapter 3. Animal Models in Eye Research. Tsonis, P. A. , Academic Press. 15-26 (2008).
- Lapan, S. W., Reddien, P. W. dlx and sp6-9 Control optic cup regeneration in a prototypic eye. PLoS Genet. 7 (8), e1002226(2011).
- Lapan, S. W., Reddien, P. W. Transcriptome analysis of the planarian eye identifies ovo as a specific regulator of eye regeneration. Cell Rep. 2 (2), 294-307 (2012).
- Inoue, T., et al. Morphological and functional recovery of the planarian photosensing system during head regeneration. Zoolog Sci. 21 (3), 275-283 (2004).
- Pineda, D., et al. The genetic network of prototypic planarian eye regeneration is Pax6 independent. Development. 129 (6), 1423-1434 (2002).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9 (12), e114708(2014).
- Raffa, R. B., Martley, A. F. Amphetamine-induced increase in planarian locomotor activity and block by UV light. Brain Res. 1031 (1), 138-140 (2005).
- Sandmann, T., Vogg, M. C., Owlarn, S., Boutros, M., Bartscherer, K. The head-regeneration transcriptome of the planarian Schmidtea mediterranea. Genome Biol. 12 (8), R76(2011).
- Vasquez-Doorman, C., Petersen, C. P. The NuRD complex component p66 suppresses photoreceptor neuron regeneration in planarians. Regeneration (Oxf). 3 (3), 168-178 (2016).
- Deochand, M. E., Birkholz, T. R., Beane, W. S. Temporal regulation of planarian eye regeneration. Regeneration. 3 (4), 209-221 (2016).
- Sakai, F., Agata, K., Orii, H., Watanabe, K. Organization and regeneration ability of spontaneous supernumerary eyes in planarians -eye regeneration field and pathway selection by optic nerves. Zoolog Sci. 17 (3), 375-381 (2000).
- Asano, Y., Nakamura, S., Ishida, S., Azuma, K., Shinozawa, T. Rhodopsin-like proteins in planarian eye and auricle: detection and functional analysis. J Exp Biol. 201 (Pt 9), 1263-1271 (1998).
- Cross, S. D., et al. Control of Maintenance and Regeneration of Planarian Eyes by ovo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7604-7610 (2015).
- Robb, S. M., Gotting, K., Ross, E., Sanchez Alvarado, A. SmedGD 2.0: The Schmidtea mediterranea genome database. Genesis. 53 (8), 535-546 (2015).
- Robb, S. M., Ross, E., Sanchez Alvarado,, A, SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database. Nucleic Acids Res. 36, D599-D606 (2008).
- Beane, W. S., Tseng, A. S., Morokuma, J., Lemire, J. M., Levin, M. Inhibition of planar cell polarity extends neural growth during regeneration, homeostasis, and development. Stem Cells Dev. 21 (12), 2085-2094 (2012).
- Forsthoefel, D. J., Waters, F. A., Newmark, P. A. Generation of cell type-specific monoclonal antibodies for the planarian and optimization of sample processing for immunolabeling. BMC Dev Biol. 14, 45(2014).
- Ross, K. G., et al. Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians. BMC Dev Biol. 15, 2(2015).
- Cardona, A., Fernandez, J., Solana, J., Romero, R. An in situ hybridization protocol for planarian embryos: monitoring myosin heavy chain gene expression. Dev Genes Evol. 215 (9), 482-488 (2005).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev Biol. 13, 8(2013).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev Dyn. 238 (2), 443-450 (2009).
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Reimpressões e permissões
