Surgical Ablation Ensaio para Estudar Eye Regeneração em Planárias

Planárias são um poderoso organismo modelo para o estudo da regeneração mediada por células-tronco adultas. Estes vermes de água doce não-parasitárias possuem a capacidade de regenerar a quaisquer e todos os tecidos em falta, incluindo o sistema nervoso central e do cérebro ^1. Estudado, tanto para trás como os 1700s ^2, avanços tecnológicos no domínio planarian durante os últimos 10-15 anos (tais como um genoma sequenciado, hibridao in situ, imuno-histoquímica, de ARN de interferência (ARNi), e transcriptómica) ter actualizado este organismo modelo histórico . Especificamente, planárias recentemente ganhou popularidade como um modelo emergente de pesquisa olho ^3.

Planárias têm olhos prototípicas com apenas dois tipos de tecido, os neurónios fotorreceptores e células de pigmento; esta permitiu a caracterização da sua população de células-tronco olho e demonstrado que muitos dos mesmos genes regulando vertebrado de olhosenvolvimento são conservados em planarians ^{4, 5.} Os copos óptica estão localizados dorsalmente e composta dos dendritos branco, não pigmentadas dos neurónios fotorreceptores e as células de pigmento preto semi-lunar, e os olhos inervam o cérebro através de um quiasma. Além de ser um modelo para elucidar os processos regenerativos ^6, o olho planarian é bem adequado para o estudo da evolução de mecanismos visuais ^7, as respostas comportamentais a luz (planarians exibir fototaxia negativo) ^8, e a base neurológica de comportamento ^9.

Regeneração olho em planarians tem sido largamente estudada em dois contextos principais: como parte de regeneração da cabeça seguinte decapitação ^{4, 10,} e após a excisão de apenas os tecidos do olho ^{11, 12 13, 14,} embora alguns estudos também realizada amputações apenas por trás dos olhos (decapitação parcial) ^15. No entanto, todos estes métodos envolvem a perda de muitas outras do que apenas o olho tecidos (tais como tumores do cérebro, intestinos, e nefrídios), potencialmente complicar a interpretação dos resultados. O protocolo de ablação olho aqui apresentada restringe a excisão para os tecidos do olho (excluindo especificamente cerebral), resultando em dados que são mais específicos para o olho. Além disso, ao contrário de vermes decapitados que levam 7-14 dias para iniciar a alimentação, olho ablated vermes irá alimentar dentro de 24 h de ablação ^12, permitindo que as experiências de ARNi (onde ARNi é entregue através dos alimentos) para ser performed concorrentemente.

Embora a ablação do olho é tecnicamente mais difícil de executar com êxito do que a decapitação, estudos atuais que envolvem a excisão olho não incluíram instruções detalhadas sobre os seus procedimentos. O objetivo deste artigo vídeo é para permitir aos investigadores para remover consistentemente o copo óptica planarian sem perturbar os tecidos cerebrais subjacentes e removendo como alguns outros tecidos quanto possível. Este método pode ser utilizado para ambos simples e dupla ablação olho e é aplicável a uma vasta gama de investigações. Como a maioria dos ensaios de regeneração, ablação olho é bem adequado para combinação com ambas as telas farmacológicas e genéticas (ARNi), bem como estudos comportamentais. Aqui nós descrevemos métodos para o tratamento de vermes, mantendo uma colônia planarian, ea técnica de ablação de olho em si.

1. Cultura Animal e Manuseamento

NOTA: Este protocolo utiliza mediterranea Schmidtea, uma espécie planarian diplóides com um genoma seqüenciado ^{16, 17} que é comumente usado para a pesquisa de regeneração. No entanto, o ensaio é igualmente bem sucedido com outras espécies, tais como Girardia Tigrina e Girardia dorotocephala (que se encontram comercialmente disponível).

1. Manter vermes em "água verme" feitos a partir de sais / L 0,5 g do mar em ultrapura (ou desionizada filtrada) água. Use de polipropileno ou de vidro recipientes estéreis para segurar a água sem-fim. Ver Documento Suplementar 1 para obter detalhes sobre a preparação de água worm.
   NOTA: Não utilizar sabão para limpar recipientes (ou de outras fontes) como o sabão é tóxica para vermes; em vez limpar com etanol a 70% e deixar secar ao ar. <ol>
2. Usar luvas ao trabalhar com planaria para protegê-los de qualquer contaminação.
   NOTA: Worms são muito sensíveis às toxinas e substâncias químicas ambientais, incluindo sabão, água sanitária, xampu, condicionador e loção de mão.

2. Preparação

1. Suspender a administração vermes pelo menos uma semana antes das experiências.
   1. Selecione vermes que não foram alimentados durante pelo ≥1 semana e são pelo menos 5-7 mm de comprimento. Transferir os vermes para uma placa de Petri de 2/3 cheio de água sem-fim, e confirmar comprimento sem fim por uma régua de deslizamento debaixo do prato. Meça wORMs enquanto totalmente estendida e em movimento.
      NOTA: Embora menor (5-7 mm) vermes funcionam melhor quando se realiza imunofluorescência posterior e em análises de hibridização in situ, vermes maiores (8-10 mm) são mais fáceis de trabalhar com - especialmente quando aprender a ablação.
   2. Certifique-se de que os vermes são inteiro, intacto, e não recentemente regenerar.
      NOTA: Regeneração vermes terá muito mais leve (ou não) do pigmento na cabeça e / ou a região da cauda, ​​em comparação com vermes normais.
   3. Se realizar ARNi ou tratamentos farmacológicos em vermes, fazê-lo neste momento. Se vermes foram alimentados como parte do tratamento (como por RNAi), esperar, pelo menos, 7 dias após a última alimentação, antes de continuar para o passo 2.2.
2. Limpar a base do microscópio de dissecção e o espaço de trabalho com 70% de etanol e deixar secar completamente. Coloque o prato de vermes selecionados para a esquerda do escopo. Para a direita do âmbito, colocar um par de fórceps # 5, uma agulha 31 G 5 de insulina / 16 polegadas com um 1ml de uma seringa, e uma pipeta de transferência limpa.
   1. Certifique-se de que os instrumentos são mantidos de tocar o banco (o que poderia introduzir contaminantes). Utilizar um produto rígido (tal como um resto pauzinho) para manter a pinça, agulha, pipeta e limpo. Alternativamente, instrumentos lugar na parte superior de um castanho (não branqueada) toalha de papel fresca.
      NOTA: Estas e subsequentes instruções são escritas em que dizem respeito a indivíduos destros. indivíduos canhotos devem reverter as direções Direita / Esquerda.
3. Ao lado do espaço de trabalho, colocar uma caixa de lenços de tecido sem fiapos, uma fonte de água fresca verme, e algumas pipetas de transferência extra (protegidas da bancada). água verme lugar em um frasco de lavagem de plástico para facilitar a distribuição. Também colocar uma placa marcada de 12 poços (ou 100 milímetros placa de Petri) para a direita da margem para recolher animais ablação.
4. Se estiver usando uma placa Peltier feitos sob medida para imobilizar vermes, posicione a placa de Peltier na depressão em tele base do microscópio de dissecação e ajustar a saída da fonte de energia DC até que a superfície de trabalho da placa de Peltier é suficientemente frio (tipicamente ~ 5 V) .Alternatively, fazer uma placa fria por enchimento de uma placa de Petri de 100 mm cheia com água ½ e congelar durante pelo menos 24 h. Descartar a tampa e colocar a parte inferior da placa de 100 mm na base do escopo de dissecação, em seguida, colocar a tampa de um prato de 60 mm Petri de cabeça para baixo directamente sobre a superfície do gelo (Figura 1A).
   1. Depois de congelada a água na placa de 100 mm, de um "vulcão" de gelo pode aparecer no centro da placa. Se isto acontece, utilizar uma lâmina de barbear para raspar o plano de gelo, para remover quaisquer irregularidades da superfície.
      NOTA: Durante cirurgias o gelo vai derreter, fazendo ablações muito mais difícil. Prepare vários pratos de gelo com antecedência, e substituir os congelados para derreter queridos durante o ensaio, logo que a tampa do prato 60 milímetros começa flutuante.
5. Prepare osuperfície cirurgia. Cortar um pedaço de 5 cm x 10 cm de película de plástico de parafina (4 cm ^2, se utilizar a placa de petri placa fria) e colocá-lo sobre o centro do dispositivo de imobilização. Dobre um tecido que não solte fiapos limpar em uma praça a cerca de 2 ^cm2 e colocá-lo no topo do filme. Cortar um pedaço de papel de filtro branco 1,5-2 ^cm2 e colocá-lo em cima da toalhita. Ver Figura 1B-1E.
   1. Segure o dobrado acabar no lugar com um dedo de luva, e usar água worm para umedecer levemente o pano para garantir que ele permaneça dobrado. Utilizar o lado de uma pipeta de transferência para rolar a limpar plana.
      NOTA: temperatura fria ajuda a manter os vermes de se mover. Trabalhando "seco" também ajuda a imobilização. O lenço de papel age de pavio de água através do papel de filtro, mantendo o verme húmido durante a cirurgia sem permitir vermes a secar completamente (que é letal).

3. ablação cirúrgica

1. Use uma pipeta de transferência para colocar emlado e verme dorsal para cima sobre o papel de filtro. Ligue a fonte de luz e dirigir as goosenecks para que a luz é focada no worm. Ajuste o foco escopo dissecar e ampliação para que os olhos são claramente visíveis (todo o worm não precisa ser à vista); 5X é um bom ponto de partida. Orientar o verme ao rodar o filme de parafina de forma que a cabeça é apontada em direcção ao investigador (na direcção da frente do microscópio), em ângulo de 30-40 graus para a direita.
   1. Evitar o uso de luz brilhante para prevenir o excesso de movimento sem-fim. Planárias exibir fototaxia negativos e tentará fugir luz brilhante.
   2. Se o sem-fim está posicionada lado ventral para cima (com faríngea abertura visível), utilizar o lado opaco do fórceps para reposicionar suavemente lado do sem-fim dorsal para cima (com olhos visíveis). Evitar a aproximar-se do animal com a ponta afiada da pinça para minimizar a possibilidade de rasgar através dos tecidos moles, quando o reposicionamento do animal.
2. Realizar uma nova agulha / seringa na mão direita, como se fosse uma caneta (entre o polegar e o dedo indicador). Prepare o polegar esquerda contra a placa de Peltier (ou placa de Petri placa fria), e utilizar o polegar esquerdo como um ponto de apoio sobre a qual a parte inferior da seringa vai descansar (Figura 2A). Olhe através do microscópio, e certifique-se o bisel da agulha é visível.
   NOTA: As agulhas são muito afiadas. Seja cauteloso ao lidar com eles. Vestindo látex ou nitrilo podem oferecer alguma proteção.
   1. Use o polegar esquerdo para ajudar a segurar a agulha / seringa constante durante todo o procedimento e evitar apertando as mãos.
   2. Faça um ângulo de aproximadamente 40 ° com o polegar esquerdo e dedo indicador esquerdo (com o dedo indicador sobre a superfície da cirurgia) para ajudar a segurar o estável superfície cirurgia.
3. Como bisel da agulha voltada para cima (como uma colher), a posição da agulha em ângulos rectos para o olho (Figura 2B). Utilizar a ponta da agulha para penetrar suavemente a fina camada de tecido que cobre o copo óptica (branco, região não pigmentado) do olho, escavando a partir da direita para a esquerda. Muito gentilmente remover qualquer tecido pigmentado localizado dentro do cálice óptico, tomando cuidado para não perfurar a parte inferior ou destruir as fronteiras do cálice óptico.
   1. Se o sem-fim tem sido no papel de filtro durante> 1-2 min a qualquer momento durante o procedimento, adicionar uma gota de água sem-fim de re-hidratar o sem-fim.
      NOTA: A desidratação irá aumentar a susceptibilidade do worm a lesões rasgando.
4. Repetir o passo 3.3 até que todos os tecidos pigmentados de preto (células de pigmento), bem como todos os tecidos brancos do copo óptica (dendritos das células fotorreceptoras), são removidos. Remover tecidos excisados ​​preso à extremidade da agulha, limpando cuidadosamente com um lenço de papel. Se abla dupla olhoção é pretendida, ablação do segundo olho neste ponto.
   NOTA: Para evitar ferimentos, as agulhas podem ser limpos por agarrar a agulha com um tecido limpo toalhete realizada com o polegar e o indicador, em seguida, usando a outra mão para puxar a agulha através da enxugar do polegar e o indicador. Alternativamente, a agulha pode ser varrida sobre a superfície de um tecido de esfregão húmido e examinados para limpeza.
5. Quando terminou, utilizar uma pipeta de transferência para mover o sem-fim a um prato marcado contendo água fresca sem-fim. Se a análise de dados de grupo, coloque até 20 vermes em um único 100 milímetros placa de Petri. Se rastreamento de regeneração nos mesmos indivíduos ao longo do tempo, coloque 1 verme em cada poço de uma placa de 12 poços. Uma vez que todos os vermes são transferidos, enxaguar vermes, removendo toda a água sem-fim dos pratos / poços e substituindo com mais água fresca sem-fim.
   1. Para remover vermes do filtro, protelar a pipeta com uma pequena quantidade de água sem-fim e libertar a água para o sem-fim. Isso deve levantar tele verme fora do papel de filtro, para ser imediatamente sugado para dentro da pipeta para transferência.
6. Incubar experiências a ~ 20 ° C (temperatura ambiente) protegidas da luz e acompanhar o processo regenerativo.
   NOTA: Worms pode ser armazenado em uma incubadora com temperatura controlada para manter uma temperatura constante, mas isso não é estritamente necessário. A maioria das temperaturas ambientes variam apenas por 5 ° C, o que não irá afectar a capacidade do sem-fim de regenerar.
7. Se desejado, corrigir vermes para imuno-histoquica (ver Figuras 3-4) e / ou em análises de hibridação in situ da expressão do gene. Existem diferentes métodos de fixação para imuno-histoquímica planarian ^{18, 19, 20} e a hibridização in situ ^{21, 22, 23} protocolos.
8. Na celebração dos experimentos, sacrifice viver vermes através da remoção de água sem-fim do prato e substituindo com etanol a 70%. Incubar vermes para 3-5 min, a verificação de vermes para lisar e transformar acinzentada.
9. Coloque vermes não tratados no fluxo de resíduos normal uma vez que sacrificado. Evitar a introdução de vermes vivos no ambiente, particularmente espécies não-nativas.

Para o primeiro 1-2 h após a cirurgia, os animais podem apresentar movimento diminuiu em comparação com vermes intactos (no entanto, eles ainda se move). Se desejado, vermes vai comer dentro de 24 horas após a cirurgia (por exemplo, para a alimentação de RNAi). Ao seguir a regeneração olho nos mesmos indivíduos ao longo do tempo, certifique-se para tirar uma fotografia de cada verme tanto antes da cirurgia (intacto) e em 1 h após ablação (HPA). Ao fim de 4 dias após a ablação (DPA) regeneração de células de pigmento deveria ser visível, e por 14 DPA todo o olho terão totalmente regenerada (Figura 3A-B). Isto inclui os neurónios fotorreceptores e sua inervação para o cérebro (Figura 3C), bem como a recuperação funcional do sistema visual (Figura 4A-C). Ablações bem sucedidos não vai perturbar os tecidos subjacentes do cérebro (Figura 4D-E), nem introduzir outros ferimentos para o animal (Figura 5A). ablações mal sucedidasincluem animais com: um excessivamente grande excisão que liga os dois olhos (Figura 5B), rasgos para a margem lateral do animal (Figura 5C), locais e / ou de feridas que picam através da epiderme ventral (Figura 5D). Além disso, as ablações mal sucedidas incluem a remoção incompleta de todo o copo óptica, composto de ambos os tecidos não pigmentadas brancas e as células de pigmento preto (Figura 5E-F).

Figura 1: preparação da cirurgia. (A) Diagrama de construção da placa a frio, usando a parte inferior de uma placa de Petri de 100 mm (cheio com gelo) e a tampa de uma placa de Petri de 60 mm (colocado de cabeça para baixo sobre a superfície de gelo). (B) Diagrama da superfície da cirurgia, feita a partir de uma pilha de (de cima para baixo) de papel de filtro branco, um tecido dobrado húmido limpar, e uma peça de película de parafina.(C) A cirurgia configurar (para a mão direita). A: escopo de dissecação, B: iluminação de pescoço de ganso, C: superfície cirurgia, D: Placa de Peltier, E: prato de vermes 5-7 mm pronto para ablação, F: frasco de lavagem de água sem-fim, L: resto pauzinho segurando pipeta de transferência limpa, H: resto pauzinho reteno da agulha / seringa, I: resto pauzinho que prende o fórceps, J: recipiente de pipetas de transferência adicionais. Configuração placa (D) personalizado Peltier. Configuração placa fria prato (E) Petri. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Posição das mãos e da agulha / seringa durante a ablação. (A) A colocação de mãos (para a mão direita). Note-se que o polegar esquerdo é usado para suportar a seringa (realizadana mão direita) para minimizar o movimento. (B) colocação da agulha em relação ao olho do sem-fim. Note-se que a superfície biselada da agulha virada para cima. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: ablated olhos planarian regenerar. Morfologia do Schmidtea mediterranea planarians renováveis olhos seguinte (A) ablação dupla olho e (B) único ablação olho. (C) A imuno-histoquímica mostra a regeneração dos neurónios fotorreceptores (anti-arrestina) após a ablação do olho único. vermes intactas são mostradas antes da cirurgia, e regenera são mostrados nos dias 4 e 14 após a ablação. Para ablações único olho, o olho esquerdo era umblated e o olho direito serve como um controlo interno (não lesionado). setas vermelhas: olhos ablação. Barras de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: A recuperação funcional do sistema visual após a ablação. (A - C) Ensaio funcional para testar fotofobia planarian. (A) vermes intactas evitar viajar através de áreas de luz, tal como uma mancha a partir de um ponteiro laser verde. (B) 24 horas após a ablação, "cegos" vermes ablacionadas dupla olho viajar através de pontos de luz. (C) aos 7 dias após a ablação, duplos olho ablated vermes regenerados seu sistema visual suficientemente para recuperar evitar luz. seta amarela: comportamento aberranteresposta al. (D - E) ablação do olho é restrita aos tecidos do cálice óptico, e não perturba os tecidos cerebrais subjacentes. (D) A imuno-histoquímica mostra arquitectura cérebro (anti-sinapsina) está inalterada em relação a uma ablação antes h após ablação. (E) hematoxilina e eosina (H & E) coloração em 1 h após a ablação de uma secção transversal que mostra o dano é grandemente restringida ao local do cálice óptico sujeito a ablação. olho direito (com células de pigmento preto) serve como controlo interno. setas vermelhas: olhos ablação. Barras de escala = 1 mm em (AC) 1 mM, 100 ^ M no (DE). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Marcas do ablações bem e mal sucedidas. (A) bem sucedidos ablações olho simples e duplas (a 5 min após a ablação) têm feridas que são mais ou menos semelhante em tamanho ao copo óptica inicial. (B - E) ablações mal sucedidas: (B) demasiado tecido é removido ou a ferida liga os dois olhos, (C) as lágrimas local da ferida e estende-se para a margem, (D) a ferida é demasiado profunda e pica através do dorsal (D) para o lado ventral (D'), e (e - F) nem todos os tecidos do copo óptica são removidos, visualizado tanto morfologicamente (e) e por coloração com anti-arrestina dos neurónios fotorreceptores (F). setas amarelas: ablações aberrante. círculos amarelos: site ablação. Barras de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.