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Artigo de método

Métodos para classificar os focos citoplasmáticos como grânulos de estresse de mamíferos

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DOI:

10.3791/55656

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12 de maio de 2017

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1Division of Rheumatology, Immunology, and Allergy, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Harvard Medical School, 3Department of Histology and Embryology, Poznan University of Medical Sciences, 4The Broad Institute of Harvard and M.I.T.

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Os grânulos de estresse (SGs) são estruturas citoplasmáticas não-membranosas que se formam em células expostas a uma variedade de tensões. As SGs contêm mRNAs, proteínas de ligação a RNA, subunidades ribossómicas pequenas, factores relacionados com a tradução e várias proteínas de sinalização celular. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho que utiliza várias abordagens experimentais para detectar, caracterizar e quantificar SGs de boa-fé .

Resumo

As células são muitas vezes desafiadas por mudanças ambientais súbitas. Os gr�ulos de stress (SGs), complexos de ribonucleoprote�a citoplasm�icos que se formam em c�ulas expostas a condi�es de stress, est� implicados em v�ios aspectos do metabolismo celular e sobreviv�cia. As SGs modulam as vias de sinalização celular, expressão de genes pós-transcricionais e programas de resposta ao estresse. A formação destes grânulos contendo mRNA está directamente ligada à tradução celular. SG é desencadeada por inibição da iniciação da tradução e a desmontagem SG é promovida por ativação da tradução ou por alongamento da tradução inibida. Esta relação é ainda mais realçada pela composição da SG. Os componentes Core SG são complexos de pré-iniciação de tradução paralisados, ARNm e proteínas de ligação a RNA seleccionadas (RBPs). A finalidade da montagem do SG é conservar a energia celular sequestrando mRNAs arranjados da manutenção da tradução, permitindo a tradução realçada de proteínas stress-responsivas. Em additiSobre os constituintes do núcleo, tais como complexos de pré-iniciação de tradução paralisada, as SGs contêm uma multiplicidade de outras proteínas e moléculas de sinalização. Defeitos na formação de SG podem prejudicar a adaptação celular ao estresse e, assim, podem promover a morte celular. SGs e gr�ulos contendo ARN semelhantes foram ligados a v�ias doen�s humanas, incluindo dist�bios neurodegenerativos e cancro, levando ao interesse recente na classifica�o e defini�o de subtipos de gr�ulos de ARN. Este protocolo descreve ensaios para caracterizar e quantificar SGs de mamíferos.

Introdução

As células empregam muitos mecanismos para responder ao estresse. Algumas respostas ocorrem no nível pós-transcricional e envolvem a regulação da tradução e / ou estabilidade do mRNA 1 , 2 . A detenção e degradação da tradução do mRNA modulado pelo estresse estão associados com a formação de focos celulares não-membranares específicos, sendo os mais bem caracterizados os Stress Granules (SGs) 3 . As SGs são focos citoplasmáticos que concentram mRNPs não-traduzidos em células arrancadas pela tradução que respondem ao estresse ( por exemplo, oxidação, choque térmico, inanição de nutrientes e infecção viral) 4 . Para além dos mRNAs não traduzidos, os SGs contêm factores de iniciação de tradução, proteínas de ligação a RNA e várias proteínas de sinalização 5 . As SGs são biomarcadores da tradução de proteínas inibidas e do metabolismo do ARN alterado e têm sido associadas à sobrevivência celular e à apoptose, via de sinalizaçãoS e processos nucleares 5 .

SGs são entidades dinâmicas, e sua formação está firmemente conectado ao status de tradução celular 6 . Apesar da sua aparência aparentemente sólida, a maioria dos componentes da proteína SG transite rapidamente para dentro e para fora, com um tempo de residência de segundos. Enquanto SGs persistem por minutos a horas, a maioria dos seus componentes estão em fluxo rápido. A inibição da iniciação da tradução ea conseqüente desmontagem dos polissomos de translação promovem a formação de SGs; Assim, as SGs estão em equilíbrio com os polissomas de translação. Este equilíbrio polissômico / SG é fundamental para distinguir SGs bona fide de outros focos induzidos pelo estresse 6,7.

A interrupção da iniciação da tradução implica a conversão de complexos de pré-iniciação competentes para a tradução que contêm mRNA, factores de iniciação de tradução (eIF) e subunidades ribossómicas 40S O-chamado 48S complexos) em translacionalmente stalled complexos (chamados 48S * complexos) que podem coalescer em SGs 4 , 6 . As SGs são promovidas por paragem translacional em dois passos diferentes a montante da formação do complexo 48S: interferência com as funções do complexo eIF4F de ligação de tampão ( por exemplo, direccionando a sua subunidade eIF4A) ou fosforilação da subunidade a do factor de iniciação da tradução eIF2, mediada por uma Ou mais das quatro cinases eIF2. A presença de complexos 48S bloqueados ( isto é, subunidades ribossómicas 40S e factores de iniciação de tradução seleccionados) é uma característica dos SG 8 , 9 .

SGs foram ligados a vários estados patológicos, tais como infecções virais, neurodegeneração, auto-imunidade e câncer 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . As formas mutadas de vários componentes SG estão associadas a doenças neurodegenerativas ( por exemplo, esclerose lateral amiotrófica) nas quais os neurônios exibem inclusões patológicas intracelulares que podem desempenhar papéis ativos na morte neuronal 13 . Alguns vírus sequestrar SG componentes para inibir SG formação e para reforçar a replicação viral [ 14] . Estudos recentes também ligam SGs ao cancro 15 e à sobrevivência das células cancerígenas nos tratamentos de quimioterapia e radioterapia 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Embora tais descobertas tenham estimulado grande interesse na biologia da SG, muitos dos relatórios publicados não têm controles importantes para distinguir a formação de SGs de boa-fé de outros focos induzidos pelo estresse.

As SGs foram inicialmente descritas como focos citoplasm�icos n� membranosos compostos de prote�as de liga�o a mRNA seleccionadas (RBPs), incluindo o antig�io ntracelular de c�ulas T 1 (TIA-1) e Prote�a de Liga�o a Poli-A (PABP); Factores de iniciação de tradução; MARN poliadenilado; E pequenas subunidades ribossómicas 4 , 6 , 21 , 22 . Tradicionalmente, a sua composição foi determinada por técnicas como a imunocoloração e a expressão ectópica de proteínas com marcação fluorescente 23 , 24 . Devido à sua natureza altamente dinâmica, a imunolocalização de proteínas SG e / ou mRNAs continua a ser a metodologia de definição para a detecção de SGs 23 , 24 . Até à data, muitas RBP e outras proteínas (mais de 120 proteínas distintas) são descritas como SG componentes [ 11] . QuantasAs proteínas G-localizadas alteram a sua localização tanto de uma forma dependente de stress como de uma forma independente e podem acumular-se em outros compartimentos intracelulares e focos, é importante escolher marcadores SG correctos e empregar critérios funcionais para distinguir SGs de outros tipos de stress induzido Focos Bona fide SGs contêm mRNA, fatores de iniciação de tradução e pequenas subunidades ribossômicas e estão em equilíbrio dinâmico com a tradução.

Esse fluxo de trabalho simples é projetado para determinar se os focos induzidos pelo estresse são SGs de boa-fé . Este fluxo de trabalho inclui várias abordagens experimentais usando células U2OS, células comumente usadas para estudar SGs. Estas células são ideais, porque têm um citoplasma grande, são relativamente lisas, e atribuem fortemente aos lamínulas de vidro. Outros tipos de células podem ser usados ​​para estudar SGs, mas é importante estar ciente de que as diferenças no tempo, na concentração de fármacos e na abundância de proteínas nucleantes de SG podem alterar a cinética e a composiçãoPosição. Al� disso, algumas c�ulas respondem �fixa de paraformalde�o formando ves�ulas de superf�ie celular, dando, ent�, uma apar�cia abaulada que provoca a localiza�o puncata de alguns marcadores SG; Sem uma análise cuidadosa, estes podem ser classificados erroneamente como SGs. Isso destaca a necessidade de avaliar todos os critérios necessários para identificar focos induzidos pelo estresse como SGs de boa-fé . Vinorelbina (VRB), um cancro terapêutico que promove SGs 20 , bem como Sodium Arsenite (SA), um robusto e bem caracterizado SG indutor, são utilizados como stress para as experiências neste protocolo.

As SGs canônicas contêm múltiplos marcadores SG (proteínas e mRNAs) que se colocalizam em focos citoplasmáticos. Este protocolo utiliza tanto a imunofluorescência como a hibridização in situ fluorescente (FISH) para detectar a localização de marcadores de proteína e ARNm poliadenilado 22 , respectivamente. Resumidamente, a imunofluorescência indirecta utiliza anticorpos ( i.E. Anticorpos prim�ios) espec�icos para uma determinada prote�a para a detectar dentro da c�ula. Em seguida, os anticorpos secundários (geralmente específicos de espécies) ligados a fluorocromos reconhecem o anticorpo primário e revelam a localização da proteína alvo. A microscopia fluorescente é utilizada para detectar o sinal localizado dentro da célula. Utilizar anticorpos produzidos em diferentes espécies e detectá-los com anticorpos secundários de cor diferente permite a detecção da colocalização de múltiplos anticorpos, indicando que os alvos proteicos são encontrados no mesmo local 23 . É importante selecionar marcadores que foram verificados para co-localizar em SGs de boa-fé .

FISH usa uma sonda marcada que base-pares para uma determinada RNA ou DNA seqüência [ 25] . Para detectar ARNm, este protocolo utiliza uma sonda de oligo (dT) 40 biotinilada que hibrida (ou pares de bases) com a cauda poliA de mRNA ( isto é, poliA FISH). A sonda biotinilada é então detectada utilizando estreptavidina conjugada com fluorescência, uma vez que a estreptavidina tem uma elevada afinidade para a biotina. Ao avaliar SGs, é importante acoplar poliA FISH com imunofluorescência detectando um marcador SG, como em SGs bona fide , os dois sinais devem colocalize.

Usando este protocolo, colocalização é avaliada de várias maneiras. Em uma imagem multicanal ( ou seja, RGB: vermelho, verde e azul), a colocalização alterará a cor do sinal sobreposto ( por exemplo, colocalized vermelho e verde aparecem amarelo) 23 . Adicionalmente, a colocalização é quantificada graficamente usando análise de varredura de linha, onde a intensidade de cada cor é medida através de uma dada linha 8 , 20 . Este protocolo descreve dois procedimentos de análise de varredura de linha usando o ImageJ 26 . Um procedimento é manual e passa por todo o processo,O outro usa uma macro, ou um programa simples que automatiza as etapas manuais. É importante passar pelo programa manual para entender o procedimento macro.

SGs formam-se em células onde a tradução é reprimida; Portanto, as células com SGs devem exibir níveis diminuídos de tradução global em comparação com células não tratadas. Experimentalmente, utiliza-se ribopuromicilação. A puromicina e a emetina são adicionadas às células durante um curto período de tempo antes da fixação, permitindo que a puromicina se incorpore aos polipéptidos que formam activamente, causando a terminação 27 , 28 . O tratamento com emetina é necessário para prevenir o re-início 29 . A puromicina pode então ser detectada utilizando anticorpo anti-puromicina, dando um instantâneo de tradução activa. Este método é usado porque é rápido, não requer pré-fome com um meio que não tem um aminoácido particular (e potencialmente pretensão das células), e revela aLocalização subcelular de tradução de proteínas. Outros m�odos, nomeadamente utilizando an�ogos de amino�idos modificados, tais como o an�ogo de metionina L-azidohomoalaina (AHA), acoplados com a qu�ica "click-it" 30 , foram utilizados para mostrar que as c�ulas contendo SG apresentam uma tradu�o muito mais baixa do que as c�ulas vizinhas 31 . No entanto, esta técnica requer inanição de metionina seguida de marcação por impulsos durante 15-30 min. A privação de metionina constitui um estresse adicional, enquanto que o longo tempo de marcação ( isto é, 15-30 min) resulta na medição de tradução cumulativa em vez de contínua e também permite que as proteínas recém-sintetizadas se movam do seu local de síntese para o seu destino final dentro do célula. Em contraste, a ribopuromicilação é muito mais rápida e é compatível com qualquer meio, tal como o meio isento de glucose utilizado para induzir SGs através de inanição de glucose.

As SGs canônicas estão em equilíbrio dinâmicoCom tradução activa de polissomas. Isto pode ser avaliado experimentalmente por tratamento de amostras com os fármacos que estabilizam ou desestabilizam polissomas, inclinando assim o equilíbrio entre SGs e polissomas 23 . A ciclo-heximida (ou emetina, que se comporta de modo semelhante) bloqueia o alongamento por "congelamento" de ribossomas no mRNA, diminuindo assim o conjunto de mRNPs não polissómicos disponíveis capazes de formar SGs. Experimentalmente, isto pode ser usado de duas maneiras: pela adição de cicloheximida (ou emetina) antes da tensão para prevenir a formação de SG ou pela adição de cicloheximida (ou emetina) após a formação das SGs, mesmo sem remover o agente estressante, causando a desmontagem da SG Os complexos de pré-iniciação são lentamente admitidos na fracção de polissomo. Em contraste, a puromicina provoca a terminação prematura e promove a desmontagem do polissomo, aumentando o conjunto de mRNAs iniciadores capazes de se reunirem em SGs. Experimentalmente, o tratamento com puromicina aumenta o número de SGs ou reduz oD em que se formam em resposta ao stress graduado ou dose de fármaco. Ao avaliar o efeito da puromicina, é importante utilizar um nível sub-máximo do fármaco de interesse, uma vez que se espera que a puromicina aumente o efeito do fármaco e aumente a percentagem de células apresentando SGs - isto não pode ocorrer se o fármaco / Estresse provoca SGs em 100% das células inicialmente. Isto contrasta com o tratamento com cicloheximida, que desmonta as SGs e funciona melhor quando ~ 95% das células inicialmente exibem SGs de modo que a maior diminuição possível pode ser observada e quantificada com precisão.

Este protocolo proporciona uma estrutura para estudar SGs em células de mamíferos. Os métodos incluem: (1) colora�o imunofluorescente e an�ise de ImageJ para avaliar a colocaliza�o dos marcadores SG-associados eIF4G, eIF3b e prote�a de liga�o de prote�a 1 activadora de Ras GTPase (G3BP1) em SGs putativas; (2) hibridação in situ de fluorescência de oligo (dT) (poliA FISH) para detectar ARNm poliadenilado; (3) tratamento com ciclo-heximida e puromicina para determinar se os focos induzidos pelo estresse estão em equilíbrio dinâmico com polissomos; E (4) ribopuromicilação para avaliar o estado de translação de células contendo SGs putativas. Juntos, estes ensaios podem determinar se os focos induzidos pelo stress podem ser classificados como SGs de boa-fé .

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Protocolo

1. Preparação da Célula

  1. Adicionar lamínulas autoclavadas a 12 poços de uma placa de 24 poços, como indicado na Figura 1A ; Isso pode ser feito usando uma pipeta estéril Pasteur anexado a um vácuo para pegar cada lamínula. Toque suavemente a lamela no lado do poço para liberar a sucção, permitindo que a lamela para cair no poço.
  2. Placa 1 x 10 5 células de osteosarcoma U-2 OS (U2OS) por poço a um volume final de 500 μL de meio. Mova a placa lado a lado e para cima e para baixo várias vezes para garantir que as células são distribuídas uniformemente.
  3. Suavemente pressione os lamínulas para baixo com uma ponta P1000 limpa para garantir que a lamela está no fundo do poço e que não há bolhas sob a lamela.

2. Estressando as Células

  1. No dia seguinte, verifique visualmente a placa para assegurar que as células estejam uniformemente dispersas e uniformemente confluentes através da lamela, uma vez que variações entre saPodem afetar adversamente a reprodutibilidade dos resultados. Use um objetivo 10X em um microscópio de cultura de tecido invertido.
  2. Pré-aqueça o meio a 37 ° C. Evite aplicar meios frios ou quentes nas células, pois estas causam choque frio ou choque térmico, respectivamente.
  3. Diluir drogas em meios pré-aquecidos. Para cada concentração de fármaco diferente, preparar 2 poços contendo 500 μL de meio. Prepare um adicional de 500 μL para permitir a perda durante a pipetagem. Alíquota 4 tubos, contendo cada um 1,5 mL.
    1. Para o arsenito de sódio: para cada poço contendo 500 μL, adicionar 1,5 μL de arsenito de sódio 100 mM (concentração final: 100 μM) ou adicionar 0,75 μL de arsenito de sódio 100 mM (concentração final: 50 μM).
    2. Para vinorelbina: a cada poço contendo 500 μL, adicionar 22,5 μL de vinorelbina 10 mM (concentração final: 150 μM) ou adicionar 18,75 μL de vinorelbina 10 mM (concentração final: 100 μM).
      NOTA: Arsenito de sódio É um indutor de grânulos de stress bem caracterizado e vulgarmente utilizado e é portanto classicamente utilizado como controlo positivo.
  4. Remova e descarte a mídia dos poços B1 - 4 e C1 - 4. Adicione o meio com drogas e espere 60 min (Figura 1A).
    1. Adicionar 500 μL de meio com 100 μM de arsenito de sódio aos poços B1 e B2. Adicionar 500 μL de meio com 50 μM de arsenito de sódio aos poços B3 e B4.
    2. Adicionar 500 μL de meio com 150 μM de vinorelbina aos poços C1 e C2. Adicionar 500 μL de meio com 125 μM de vinorelbina aos poços C3 e C4.
  5. 30 min antes da fixa�o, tratar os po�s na coluna 2 com 5 � de cicloheximida (1 mg / mL de stock) e os po�s na coluna 4 com 2 � de puromicina (pasta de 1,25 mg / mL). Agite suavemente a placa para misturar antes de colocar a placa de volta na incubadora a 37 ° C.

3. Fixação Celular e Imunofluorescência

Nt "> NOTA: Antes do experimento, assegure-se de que o metanol é arrefecido até -20 ° C. Faça buffers, incluindo solução salina tamponada com fosfato (PBS), 5% de soro de cavalo normal (NHS) em PBS e paraformaldeído a 4% ) Em PBS.

  1. Descarte a mídia e lave os poços contendo lamínulas com PBS. Dependendo dos fármacos utilizados, pode ser importante descartar adequadamente os meios contendo drogas; Entre em contato com o escritório local de segurança ambiental para obter instruções específicas. Para lavar eficientemente, encha uma garrafa de espremer com PBS, corte a ponta de modo a permitir um fluxo suave ao invés de um fluxo apertado e use isso para adicionar PBS a cada poço após a aspiração do PBS original.
  2. Fixar as células utilizando ~ 250 μL de PFA a 4% durante 15 min à RT sob agitação suave. Cubra completamente a parte superior da lamela com PFA; 250 μL deve ser suficiente, mas se não, adicione mais. Sempre evite pipetar diretamente nos lamínulas, pois algumas células (ou tratamentos de tensão de células) podem alterar o apego, e tA força de pipetagem pode desalojar as células.
  3. Remova o PFA e descarte adequadamente. Entre em contato com o escritório local de segurança ambiental para obter detalhes sobre como descartar adequadamente paraformaldeído.
  4. Adicionar ~ 250 μL de metanol (-20 ° C) e incubar durante 5 min à RT sob agitação suave; Isto permeabiliza e aplana as células.
  5. Remover e descartar o metanol e bloquear as células, aplicando ~ 250 μL de NHS a 5% durante 1 h a RT O / N a 4 ° C. Entre em contato com o escritório de segurança ambiental local para obter detalhes sobre como descartar adequadamente metanol.
  6. Para anticorpos primários, diluir os anticorpos em NHS a 5%.
    NOTA: A utilização de múltiplos marcadores SG é fundamental para confirmar se os grânulos observados são SGs de boa-fé . O número de marcadores SG que podem ser usados ​​depende dos filtros disponíveis no microscópio. Se estiverem disponíveis conjuntos de filtros verde, vermelho e far-vermelho padrão, utilize G3BP1, eIF4G e eIF3b a uma diluição de 1/250.
    1. Para esta experiência (12 lamelas a 250 μL de cada-Total: 3 mL de NHS a 5%), adicionar 12 μL de cada um dos seguintes: anti-G3BP1, anti-eIF3b e anti-eIF4G. Incubar os anticorpos primários utilizando agitação suave durante pelo menos 1 h à RT ou O / N a 4 ° C.
  7. Lavar os poços 3x com PBS, e incubar cada lavagem durante 5 min.
  8. Para anticorpos secundários, diluir todos os anticorpos secundários (diluição 1/250) e corante Hoechst (diluição 1/1000) em NHS a 5%.
    1. Para esta experiência (12 lamelas a 250 μL de cada um - Total: 3 mL de NHS a 5%), adicionar 12 μL de cada um dos seguintes: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit e Cy5-Goat (uma diluição 1/250 de cada ) E adicionar 3 μL de corante Hoechst.
    2. Incubar os lamínulas com os anticorpos secundários durante 1 h à RT. Durante este e os seguintes passos, proteger as amostras de luz, cobrindo a placa com uma caixa ou colocando folha sobre o topo do prato de cultura de tecidos.
  9. Lave oLls três vezes com PBS durante 5 min cada.
  10. Monte os lamínulas em lâminas de vidro etiquetado usando meio de montagem. Aquecer o meio de montagem num bloco de calor a 37 ° C durante 10 min; Isto diminui a viscosidade e facilita a pipetagem. Com uma ponta de corte P200, pipetar 25 μL de meio de montagem por lamela em uma lâmina de vidro; 4-8 lamínulas podem caber em uma lâmina de vidro, assumindo que o estágio do microscópio permite isso. Usando fórceps finos, transferir a lamela do poço para o slide, certificando-se de colocar o lado da célula para baixo sobre o meio de montagem. Usando uma ponta P200 limpa, pressione o lamínula para baixo.
  11. Uma vez que todos os lamínulas foram montados, use tecido de laboratório dobrado para limpar o excesso de mídia de montagem, pressionando o tecido de laboratório muito firmemente sobre o slide. Use um frasco de compressão contendo H 2 O para enxaguar o excesso de meio de montagem e, em seguida, repita o blotting com tecido de laboratório dobrado para remover a água.

4. Fluorescência In Situ </ Em> Hybridization (FISH)

  1. Placa e tratar as células, usando os passos 1 e 2.1-4 como um guia; Só é necessário plaquear as células na coluna 1, uma vez que são necessários apenas 3 lamelas na experiência seguinte.
  2. Certifique-se de que todos os tampões são preparados ( isto é, PFA a 4% em PBS, etanol a 70% em água, 2x Citrato de sódio salino (SSC) e NHS a 5%), que o metanol seja arrefecido até -20 ° C e que O forno de hibridação é aquecido até à temperatura apropriada.
  3. Execute os passos 3.1-3.3 para lavar e fixar as células.
  4. Permeabilizar as células por adição de -20 ° C de metanol durante 10 min.
  5. Remover o metanol e incubar as lamelas em etanol a 70%. Colocar a placa a 4 ° C durante a noite. Selar a placa usando parafilme para evitar a evaporação.
  6. No dia seguinte, remover o etanol e re-hidratar as células adicionando 500 μL de SSC 2x. Incubar os lamínulas durante 5 min com agitação suave à temperatura ambiente.
  7. Remova o SSC 2x e adicione 500ΜL de SSC 2X. Incubar durante 5 minutos sob agitação suave.
  8. Coloque um pedaço de parafilme na parte de baixo do forno de hibridação. Pipetar 25 μL de tampão de hibridização sobre o parafilme para cada lamínula. Remova a lamela do prato de 24 poços (neste ponto, os lamínulas estão lado da célula para cima) e coloque a lamela lado da célula para baixo sobre o buffer de hibridização. Faça-o a 42 ° C ou opcionalmente a 65 ° C durante 15 min.
    NOTA: Completar esta etapa a 65 ° C desnaturalizará RNAs celulares; Isto pode melhorar o sinal se o poliA é mascarado por interações com proteínas.
  9. Diluir a sonda de Biotina-Oligo (dT) (100 ng / μL) em tampão de hibridação para uma concentração de 2 ng / μL; 25 μL por lamínula é suficiente.
  10. Para cada lamela, pipetar 25 μL de tampão de hibridação contendo Biotina-Oligo (dT) sobre o parafilme. Pegue a lamela com fórceps e toque suavemente a borda da lamela em um tecido de laboratório para remover o excessoTampão de hibridação. Transferir a lamela para o tampão de hibridação com Biotin-Oligo (dT); Lembre-se de manter o lado da célula para baixo.
  11. Coloque os lamínulas em uma caixa de hibridização para limitar a evaporação. Incubar os lamínulas com Biotina-Oligo (dT) em tampão de hibridação por 60 min a 42 ° C.
  12. Colocar 2x SSC no forno de hibridação para permitir que ele se equilibre a 42 ° C.
  13. Adicionar ~ 500 μL de 2 x SSC aquecido para os poços na placa de 24 poços e usar pinças para transferir os lamínulas para o poço. Incubar durante 10 min.
  14. Repetir o passo de lavagem acima duas vezes a 42 ° C e depois duas vezes à TA.
  15. Complete os passos 3.5-3.10, certificando-se de usar um fluorocromo de estreptavidina para detectar o Biotin-Oligo (dT) em vez de um anticorpo convencional.

5. Ensaio de ribopuromicilação para avaliar o estado translacional

  1. Placa de células U2OS em lamínulas, como indicado no passo 1, mas apenas chapa um lamínula por condição (nesteCaso, 3 lamínulas: não tratadas, arsenito de sódio 100 μM e vinorelbina 150 μM) ( Figura 1 A).
  2. Células de estresse usando o protocolo na etapa 2, completando as etapas 2.1-2.4.
  3. 5 min antes da fixação, adicionar 2 μL de puromicina (estoque: 1,25 mg / mL, diluir 2 μL em 500 μL para obter uma concentração final de puromicina de 5 μg / mL) e 2,9 μL de emetina (estoque: 20 μg / mL; 2,9 μL à mesma solução contendo já a puromicina) para cada poço contendo 0,5 mL.
  4. Completar os passos 3.1-3.10 como indicado acima, utilizando um anticorpo anti-puromicina (diluição 1/1000) para detectar puromicina. Idealmente, use outros dois marcadores SG nos canais restantes.
  5. Ao quantificar o sinal de puromicina, tome todas as imagens usando a mesma exposição. Escolha esta exposição usando a amostra mais brilhante (sem tensão) e tirando uma imagem tão brilhante quanto possível sem saturação.
    NOTA: A intensidade do sinal fluorescente anti-puromicina represA tradução contínua, como substitutos de puromicina para um aminoácido, incorpora na proteína nascente, e impõe a terminação prematura da proteína.

6. Aquisição e Análise de Imagens

  1. Quantificação de grânulos de estresse
    1. Para quantificar SGs, adquira 3 - 5 imagens totalizando> 100 células por amostra usando um objetivo 40X. Em alternativa, adquira imagens utilizando outros objectivos, mas certifique-se de que> 100 células são contadas por lamínula e que a ampliação é suficientemente grande para visualizar claramente os grânulos. Faça isso dividindo a lamela em cinco regiões aproximadamente iguais e selecionando aleatoriamente um campo de cada região ( Figura 1B ); Imagens do mesmo campo devem incluir todos os canais para avaliar a colocalização de marcadores.
    2. Uma vez que todas as imagens foram adquiridas, mesclar os canais. Algum software da câmera fará automaticamente isto, enquanto outros requerem a fusão manual; Isso pode ser feito comImageJ abrindo todas as imagens e selecionando [Image | Cor | Mesclar Canais].
    3. Contagem manual do número total de células, contando o número de núcleos, usando Hoechst como o marcador de núcleos. Contagem manualmente o número de células que contêm mais de dois SGs por célula.
      NOTA: Por exemplo, usando uma imagem de três canais combinada exibindo G3BP1 (verde), eIF4G (vermelho) e Hoechst (azul), conte os núcleos (ou número de células) usando o canal azul. Em seguida, considere as células SG-positivas como aquelas com dois ou mais focos amarelos por célula. Os grânulos aparecerão amarelos, como verde de G3BP1 e vermelho de eIF4G aparecem amarelos se colocalized.
    4. Determine a percentagem de células que são SG positivo, combinando os dados das 3-5 regiões independentes e, em seguida, calcular:
      Número de SG positivo / número de núcleos) * 100 = percentagem de células SG-positivas
  2. Avaliação da Colocalização por Análise de Varredura de Linha - Método Manual
    1. AbertoImageJ. Faça o download gratuitamente de ()
    2. Abra o gerenciador de ROI: [Analisar | Ferramentas | Gerente de ROI ...].
    3. Abra a imagem mesclada no ImageJ: [File | Aberto].
    4. Usando a ferramenta de linha localizada na barra de ferramentas ImageJ, adicione uma linha que passa por um SG, certificando-se de incluir antes e depois do SG. Adicione esta linha ao gerenciador de ROI clicando em [Adicionar] na janela do gerenciador de ROI.
    5. Dividir a imagem mesclada em canais separados para avaliar a localização de cada marcador para o grânulo: [Image | Cor | Split Channel]; Isso dividirá a imagem mesclada em três imagens em preto e branco.
    6. Na imagem em preto-e-branco, certifique-se de que a linha está selecionada; A linha é selecionada se aparecer na imagem. Caso contrário, na janela do gestor de ROI, clique na linha no painel; Isto irá realçar a linha em azul na janela do gestor de ROI e tornará a linha visível na imagem em preto e branco. Se a linha ainda não aparecer, certifique-se de que "mostrar tudo" é chEcked no gerente de ROI e, em seguida, clique na linha na imagem.
    7. Analisar a intensidade da linha: [Analisar | Plot Profile]; Isto irá abrir a janela "Plot Profile", que traça a intensidade do sinal através da linha.
    8. Na janela "Plot Profile", clique em [List], que abre uma janela contendo os dados brutos do gráfico. Copie todos os dados nesta janela e cole-os em um arquivo de planilha. Para fazer isso, selecione todos os dados na janela: [Editar | Selecionar tudo]. Copie a data: [Editar | Cópia de]. Abra um arquivo de planilha e cole os dados: [Editar | Colar].
    9. Complete os passos 6.2.6 a 6.2.8 para cada canal separadamente. Certifique-se de acompanhar o canal que está sendo avaliado.
    10. Em uma planilha, gere um gráfico de linha dos resultados. Selecione as colunas que incluem dados pressionando [controle] e clicando na letra na parte superior de cada coluna. Em seguida, selecione o gráfico de linha: [Inserir | Gráfico de linha].
    11. Repita essa análise para multGranulados de estresse em várias experiências independentes.
  3. Avaliando Colocalização por Análise de Varredura de Linha - Plugin ImageJ
    1. Faça o download e instale a ferramenta de perfil RGB no site da ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Quando instalado corretamente, um ícone vermelho, verde e azul (RGB) -lineado deve aparecer na barra de ferramentas.
    2. Abra a imagem ( por exemplo, Tiff, JPG) em ImageJ: [File | Aberto].
    3. Clique no ícone RGB localizado na barra de ferramentas ImageJ.
    4. Clique e arraste para adicionar uma linha que se estende através de um SG, certificando-se de incluir regiões adjacentes; Uma imagem do histograma aparecerá em uma janela pop-up.
    5. Salvar os dados como uma imagem: [Arquivo | Guardar como | Tiff]. Como alternativa, exporte e, em seguida, grafique os dados em outro programa gráfico usando a etapa 6.2.8 acima.

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Resultados

Os focos induzidos pelo estresse não são necessariamente SGs. As SGs são classificadas como focos citoplasmáticos que contêm mRNAs, factores de iniciação de tradução e proteínas de ligação ao ARN e estão em equilíbrio com a tradução activa. O protocolo acima pode ser usado como um modelo para caracterizar se um determinado estresse induz SGs bona fide .

SGs colocalize com outros marcadores SG conhecidos, incluindo pro...

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Discussão

Conforme evidenciado por estudos imuno-histológicos em múltiplas doenças, o estresse crônico leva à formação de diferentes focos intracelulares. Por exemplo, a maioria das doenças neurodegenerativas é caracterizada por agregados intracelulares de proteínas insolúveis. A presença de proteínas associadas a SG nesses agregados é frequentemente a base para concluir que tais focos são SGs. Uma conclusão semelhante é também tirada quando os focos citoplasmáticos positivos para o marcador SG são observados em células tratadas ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros dos laboratórios Ivanov e Anderson por sua útil discussão e feedback sobre este manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [GM111700 e CA168872 para PA, NS094918 para PI], o National Science Centre na Polônia [concessão UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 para WS]. WS também reconhece o Ministério da Ciência e Educação Superior na Polônia (Programa Mobility Plus) ea Comissão Fulbright polonesa-americana por seu apoio financeiro de sua pesquisa nos EUA.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
U-2 OSATCC ATCC® HTB-96™Comumente escrito "U2OS"
Culture at 37 ° C abaixo de 5% de CO2 em 10% de FBS/DMEM
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)Corning10-013-CVContém 4,5 g/L de glicose, piruvato e vermelho de fenol
Suplementado com 10% de FBS, HEPES 10 mM e penicilina/steptomicina
Pré-aqueça a diluição do(s) medicamento(s) Soro
Fetal Bovino (FBS)SigmaF2442-500mlUsado para suplementar o meio
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630-080Usado para suplementar mídia
penicilina estreptomicinaSigmaP0781-100mlUsado para suplementar mídia
Placa de 24 poçosCostar3524
tecidos de laboratório (kimwipes)KIMTECH SCIENCE34120
Capa de Vidro para Óculos de Cobertura de CrescimentoFisher Scientific12-545-82Autoclavado antes do uso
Mantenha estéril na capa de cultura de tecidos
(meta)arsenito de sódio ≥ 90% (SA)SigmaS7400-100GDissolver em água até a concentração de 1 M, depois diluir até 100 µ M como estoque de trabalho
Vinorelbina (VRB)TSZ CHEMRS055Dissolver em água a 10 mM
PuromicinaSigmaP9620Usado para avaliar o nível de tradução (ribopuromicilação)
-Usado para avaliar a conexão SG com tradução ativa
Diluir em água a 10 mg/mL
de hidrato de dicloridrato de emetinaSigmaE2375Usado em combinação com puromicina para avaliar o nível geral de tradução
Usado para avaliar a conexão SG com tradução ativa
-Diluir em água para 10 mg/mL
de cicloheximida (CHX)SigmaC4859Usado para avaliar a conexão SG com tradução ativa
Diluir em água para 10 mg/mL
de solução salina tamponada com fosfato (PBS)Lonza / VWR95042-486Tampão de lavagem para imunofluorescência
Grau de reagente de paraformaldeído, cristalino (PFA)SigmaP6148-500GFaça uma solução a 4% em PBS quente na capela de exaustão, mexa até dissolver
Alíquotas podem ser armazenadas a -20 ° C por vários meses
Perigoso, use ventilação
Descarte em resíduos especiais
Metanol, ACSBDH / VWRBDH1135-4LPPré-resfriamento a -20 &graus; C antes de usar
Descarte em resíduos especiais
Soro Normal de Cavalo (NHS)Thermo Fisher Scientific31874Diluir a 5% em PBS
Adicionar azida de sódio para armazenamento a 4 &graus; C
Solução de bloqueio para imunofluorescência
Etanol, Puro, 200 Proof (100%),USP, KOPTECDecon Labs / VWR89125-188Diluir a 70% com água
Lâminas de microscópio Fisherbrand Superfrost Plus Fisherbrand12-550-15
anticorpo anti G3BP1 de camundongo (TT-Y)Santa Cruzsc-81940Armazenar em 4 ° C
1/100 diluição
coelho anti eIF4G anticorpo (H-300)Santa Cruzsc-11373Armazenar em 4 ° C
1/250 caprino diluição
anti eIF3η (N-20) anticorpoSanta Cruzsc-16377eIF3η também é conhecido como eIF3b
Loja a 4 ° C
1/250 diluição
de camundongo anticorpo anti-puromicina 12D10MilliporeMABE343Armazenar a 4 ° C
diluição de 1/1.000
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson Immunoresearch715-225-150Reconstituir em água por fabricante' s instruções então armazene a 4 ° C
diluição de 1/250
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-165-152Reconstituir em água conforme o fabricante' s instruções então armazene em 4° C
diluição de 1/2.500
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immunoresearch705-175-147Reconstituir em água de acordo com o fabricante' s instruções então armazene em 4° C
diluição 1/250
Solução Hoechst 33258Sigma94403-1MLIncubar com anticorpos secundários
Solução de estoque 0,5 mg/mL em dH20, proteger da luz
-Armazenar a 4 > C
Cy3 StreptavidinJackson Immunoresearch016-160-084Reconstituir em água por fabricante» s instruções, em seguida, armazenar em 4 ° C
1/250 diluição
oligo-(dT)40x sonda biotiniladaTecnologias Integradas de DNA (IDT)/Reconstituir em água a 100 ng/mL, alíquota e armazenar a -20 ° C
Diluir em tampão de hibridação 1/50 antes de usar
Caixa de hibridação//Faça uma câmara de umidade com qualquer caixa de lâminas de armazenamento adicionando papel umidificado na parte inferior
- pré-aqueça a caixa antes do uso
20x tampão SSCThermo fisher AmbionAM9763Dilua para 2x SSC usando água livre de RNase (tratada com DEPC)
Armazene em RT
Tampão de lavagem para FISH
Buffer de hibridização PerfectHybPlusSigmaH7033-50mlBloco e tampão de incubação de sonda para
mídia de montagem de slidesfeito em casa/Misture 5 g de " solúvel a frio" poli(álcool vinílico) em 20 mL de PBS
Misture por sonicação, seguido de agitação O/N em RT
Adicione 5 mL de glicerol e 0,2 mL de azida sódica a 20% e agite por 16 h em RT
Centrifugação a 20.000 g por 20 min, descarte o pellet grande
líquido viscoso alíquota, armazenamento de longo prazo a -20 & C, 1 semana às 4 > C
Parafilm "M"SigmaP7793-1EA
Poli (álcool vinílico)SigmaP-8136-250GReagente para fazer vinol
GlicerolSigmaG5516-100MLReagente para fazer
vinol azida sódicaFisher ScientificS2002-5GAgente conservante para solução de bloqueio e vinol
Faça uma diluição de 20% em água
de pedido personalizado FISH

Referências

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