Modelagem de morte Neuronal e a degeneração no Mouse grânulo cerebelar primária de neurônios

Neurônios de grânulo cerebelar (CGNs) são bem caracterizados em cultura e têm servido como um modelo eficaz para estudar a morte neuronal e desenvolvimento ^{1,2,3,4,5, 6}. a expressão inicial dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) no CGN culturas em vitro faz-lhes um modelo atraente para estudar induzida por NMDA sinalização. A ativação destes receptores com NMDA em conjunto com a despolarização da membrana é usada para modelar a estimulação da atividade neuronal fisiológica e tem permitido para pesquisa em mecanismos de plasticidade sináptica ^7,8. Pelo contrário, excesso de estimulação desses receptores por ligante NMDA pode ser usado para modelar excitotoxicidade, um importante mecanismo de perda neuronal aguda doenças danos cerebrais e neurodegenerativas ⁹. Um mecanismo para a indução da excitotoxicidade é através da inanição de ATP com oxigênio reduzido, como pode ser visto com lesão neuronal aguda. Isso resulta na despolarização da membrana e liberação de níveis elevados de glutamato em sinapse. A superestimulação subsequente do receptor NMDA pelo glutamato elevado resulta em excessiva Ca^{2 +} influxo através destes receptores, que por sua vez ativa diversos caminhos, incluindo Ca^{2 +}-ativado proteases, fosfolipases, e endonucleases, resultando na degradação descontrolada da críticos componentes celulares e morte celular. Além disso, alta intracelular Ca^{2 +} leva à geração de radicais livres de oxigênio e dano mitocondrial ^10,11.

Enquanto a maioria da perda neuronal após excitotoxicidade neuronal induzida por NMDA é devido ao influxo de cálcio e é independente de Bax/Bak, outros mecanismos de morte celular não podem ser excluídos deste modelo. A aparência de ambos necrótico e apoptose morte celular devido a excitotoxicidade é parcialmente devido a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e danos no DNA causados por^{alta intracelular Ca 2 +} níveis ¹². Dano do ADN resulta em morte neuronal através de mecanismos de apoptose, sendo correlacionados com marcas da morte de apoptose celular, como o aparecimento de massas de cromatina e corpos apoptotic. Indução da apoptose é mediada através da liberação de citocromo c da mitocôndria e foi mostrada para ser dependente de Bax/Bak oligomerização ¹³. Bax/Bak oligomerização promove a formação de poros na membrana mitocondrial externa, resultando em citocromo c liberação e ativação de pro-apoptotic reguladores como visto com lesão isquêmica leve ¹⁴.

Geração de ROS é uma questão importante no cérebro devido os baixos níveis endógenos de antioxidantes, juntamente com a exigência de oxigênio grande para funcionamento neuronal ¹⁵. Quando exposta a um evento isquêmico, óxido nítrico sintase é upregulated, produzir o óxido nítrico e aumento de espécies reativas de oxigênio ¹⁴. A maior concentração de radicais de oxigênio pode resultar em danos ao DNA e indiretamente causar fome de energia. Altos níveis de quebras de dupla-hélice do DNA são corrigidos por ativação de poli ADP-ribose polimerase-1 (PARP-1), uma proteína de limite a cromatina eucariótica responsável por catalisar a transferência de unidades de ADP-ribose do NAD⁺, parte integrante de um processo Reparação de DNA ¹⁶. No entanto, com danos excessivos devido ao estresse oxidativo, ativação de PARP-1 pode causar fome de energia devido a drenagem aumentada no NAD⁺, um substrato necessário para a produção de ATP através da fosforilação oxidativa. Em última análise, estresse oxidativo irá desencadear a apoptose em uma maneira dependente de Bax/Bak levando a liberação c mitocondrial citocromo e foi mostrado para induzir a remodelação mitocondrial em CGNs ¹⁷.

Finalmente, mudanças na concentração de cloreto de potássio (KCl) em culturas CGN podem ser usadas para modelar baixo potássio/despolarização mediada por apoptose ^18,19,20. Quando expostos a baixos níveis de K⁺, CGNs passam por mudanças fisiológicas distintas, resultando em reduções de respiração mitocondrial e glicólise, atribuído à diminuição da demanda de celulares ²¹, bem como a redução dos níveis de nuclear factor-κB (NFκB) que regula as atividades, incluindo a inflamação e a transmissão sináptica ²². Este modelo é de particular interesse para o estudo da morte celular durante o desenvolvimento neuronal. O ambiente de K⁺ baixo mais de perto se assemelha a condições fisiológicas e provoca marcas da morte celular durante o desenvolvimento neuronal ²³.

Em resumo, CGNs fornecer um modelo de longa data para investigar os mecanismos moleculares subjacentes da morte neuronal e degeneração. O seguinte protocolo permitirá isolamento e cultivo de CGNs, expressão ou repressão um percurso genético específico usando o vírus e a indução de morte neuronal através de diferentes mecanismos que representa a degeneração e lesão neuronal.

este protocolo é baseado em modificações de procedimentos que foram previamente descrito ^{18 , 24 , 25 , 26 , 27}. o presente protocolo é aprovado pelo Comité de cuidado Animal na Universidade McGill.

1. preparação experimental

Nota: as seguintes soluções estoque podem ser preparadas e mantidas até o uso.

1. Solução de dissecação
   1. dissolver 3,62 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,2 g de cloreto de potássio (KCl), 0,069 g de fosfato de sódio (NaH ₂ PO ₄ ∙ H ₂ O) e 1,306 g de D-(+)-glicose em 500 mL de água destilada H ₂ O. Em seguida, adicione 12,5 mL de tampão HEPES, 450 µ l de solução de vermelho de fenol e 20 mL da fração BSA V à solução. Ajustar o pH 7,4 usando 1 N de hidróxido de sódio (NaOH).
   2. Esterilize com 0,22 µm filtro e em 4 ° C. Esta solução permanecerá estável por até uma semana a 10 dias.
2. Tripsina
   1. preparar uma solução com uma concentração de 25 g/L de tripsina em cloreto de sódio 0,9%. Armazenar a solução a -20 ° C.
3. Inibidor de tripsina
   1. preparar um estoque com uma concentração de 10 mg/mL, dissolvendo 1 g de inibidor de tripsina de clara de ovo de galinha em 100 mL de HCl. loja de 1 mM esta solução a -20 ° C.
4. DNase
   1. dissolver 100 mg de DNase 1 em 10 mL de água estéril para gerar um estoque de 10 mg/mL. Armazenar a solução a -20 ° C.
5. MgSO ₄
   1. Adicionar 6,02 g de sulfato de magnésio (MgSO ₄) a 50 mL de água destilada (H ₂ O) para gerar um estoque de 1 M. Conservar a solução em 4 ° C.
6. CaCl ₂
   1. dissolver 0,735 g de cloreto de cálcio (CaCl ₂ ∙ 2 H ₂ O) em 50 mL de água destilada H ₂ O a uma concentração de ações de 100 mM. Conservar a solução em 4 ° C.
7. KCl
   1. dissolver 3.7275 g de KCl em 50 mL de água destilada de H ₂ O a uma concentração de ações da solução de armazenamento de 1 M. em 4 ° C.
8. D-(+)-glicose
   1. dissolver 1,802 g de D-(+)-glicose em 50 mL de água destilada de H ₂ O a uma concentração de ações de 100 mM. Conservar a solução em 4 ° C.
9. Meios de cultura de célula
   1. preparar meios de cultura celular da seguinte maneira: 5 mL de calor inativada dializados soro bovino Fetal, 500 µ l de 200 mM L-glutamina, 100 µ l de 50 mg/mL de gentamicina e 1 mL de 1,0 M de KCL devem ser adicionados aos 45 mL de filtro esterilizado águia ' s essencial media mínimos (E-MEM) que são suplementados com 1,125 g/L D-glicose para gerar 50 mL de meios de cultura de neurônio cerebelar do grânulo. Armazenar a mídia em 4 ° C.
10. Furanoside de Beta-D-Arabino citosina
    1. dissolver 48 mg de furanoside de beta-D-arabino citosina em 10 mL de meio de crescimento para uma concentração das ações de 20 mM. Armazenar a solução a -20 ° C.
11. Poli-lisina-D
    1. para gerar um poli de 2 mg/mL estoque D-lisina, adicionar 10 mL de estéril H ₂ O a 20 mg de poli D-lisina. Ações poli D-lisina deve ser armazenado a-80 ° C em 100 alíquotas µ l.
12. Nota: as seguintes soluções devem ser preparadas antes dissecação e mantidas a 4 ° C até o uso.
13. MgSO ₄ solução de dissecação Supplemented
    1. Adicionar 300 µ l de estoque MgSO ₄ a 250 mL de solução de dissecação.
14. Solução de tripsina dissecação
    1. Adicione 100 µ l de estoque tripsina e 12 µ l de estoque MgSO ₄ a 10 mL de solução de dissecação.
15. 1 de solução de inibidor de tripsina
    1. Adicionar 164 µ l do inibidor de tripsina estoque, 250 µ l de estoque DNase 1 e 12 µ l de estoque MgSO ₄ a 10 mL de solução de dissecação.
16. 2 de solução de inibidor de tripsina
    1. Adicionar 1040 µ l do inibidor de tripsina estoque, 750 µ l de estoque DNase 1 e 12 µ l de estoque MgSO4 a 10 mL de solução de dissecação.
17. CaCl ₂ suplementado solução dissecação
    1. Adicionar 10 µ l de estoque CaCl ₂ e 25 µ l de estoque MgSO ₄ a 10 mL de solução de dissecação.
18. Poli D-lisina revestido cultura pratos
    1. para revestir pratos de cultura, diluir 100 µ l de estoque poli D-lisina em 40 mL de estéril H ₂ O. Para pratos de cultura Nunc 35mm, adicione 2 mL de poli diluído solução D-lisina. Para 4 placas bem, adicionar 300 µ l de diluídos poli D-lisina em cada Pocito.
    2. Deixa o poli-lisina D sentar-se por 1h antes de aspirar e lavar cada um bem com 4 mL ou 600 µ l (para 35 milímetros cultura pratos ou 4 placas de bem, respectivamente) de estéril H ₂ O. Depois Aspire o H ₂ O e deixe o ar de pratos secar por 1 h.

2. Extração e isolamento do cerebelo do cérebro

1. Decapitate por 6-7 dia filhote de rato velho usando tesouras de decapitação. Faz a dissecação do cérebro em uma capa de cultura de tecido estéril.
2. Para remover o cérebro, segure a cabeça usando um par de pinças e cortar a pele em direção a parte anterior da cabeça usando tesouras microdissection conforme demonstrado na Figura 1. Então corte através do osso do crânio usando um novo par de tesouras para minimizar o risco de contaminação. Remover o crânio que cobrem o cérebro usando fórceps e destrinchar o cérebro usando uma espátula de fórceps.
   1. Conforme necessário, cortar o nervo óptico para facilitar sair o cérebro como um todo.
3. Coloque o cérebro na solução de dissecação, que é complementada com MgSO ₄. Manter a solução e o cérebro no gelo
4. Seguinte remoção, sob um microscópio de dissecação do cérebro, dissecar o cerebelo do cérebro enquanto ainda na solução de dissecação MgSO ₄ completadas e remover as meninges usando pinça fina. Vire o cerebelo para seu lado ventral e garantir a remoção do plexo coroide.
5. o cerebella do pool em um prato de 35mm contendo ~ 1 mL de solução de dissecação MgSO ₄ completadas.
6. Cortar o tecido em pequenos pedaços e transferir para um tubo de 50 mL contendo 30 mL de solução de dissecação MgSO ₄ buffer.

3. Mouse cerebelar grânulo neurônio isolamento e Culturing

1. centrifugar o tubo de 50 mL contendo o tecido cerebral picado por 5 min em 644 x g e 4 ° C.
2. Remover o sobrenadante e adicionar 10 mL de solução de dissecação de tripsina. Em seguida, agitar o tubo em alta velocidade por 15 min a 37 ° C.
3. Adicionar 10 mL de solução de inibidor de tripsina 1 para o tubo e a pedra delicadamente por 2 min.
4. Centrifugar o tubo por 5 min em 644 x g e 4 ° C.
5. Remover o sobrenadante e adicionar 2 mL de solução de inibidor de tripsina 2 e depois transferir para um tubo de 15 mL.
6. Triture o tecido no tubo de 15 mL até que a solução torna-se turva. Então deixe de se contentar com 5 min.
7. Remover o sobrenadante claro e transferir o sobrenadante para um novo tubo contendo 1 mL de solução de dissecação CaCl ₂ suplementado.
8. Adicionar outra mL de solução de inibidor de tripsina 2 para o fundo do tubo contendo a pelota da etapa 3.6. Triture novamente e deixa-se por 5 min. Retire o sobrenadante e adicioná-lo ao tubo contendo o sobrenadante da etapa 3.7 (que é uma repetição de passos 3.6-3.7). Repita este processo até que a maioria do tecido é mecanicamente dissociado.
9. Adicionar 0,3 mL de CaCl ₂ suplementado solução de dissecação à coleção sobrenadante para cada mL do sobrenadante.
10. Misturar o conteúdo do tubo e centrifugar durante 5 min à 644 x g..
11. Remover o sobrenadante e adicionar 10 mL de mídia fresca ao pellet e misture.
12. Células podem ser contadas e diluídas a uma concentração de 1,5 x 10 ⁶ células/mL. Por favor, note que, em geral, 10 milhões de células são esperados de cada cérebro dissecado, dependente do tempo tripsinização e eficiência de dissecação. Placa de células em placas de poli anteriormente feito D-lisina. Para placas 4 boas, chapa de 0,5 mL, dando 7,5 x 10 ⁵ células por poço. Para pratos de 35 mm, placa de 4 mL, dando 6 x 10 ⁶ células por placa.
13. Após 24 h, adicionar citosina-β-arabino furanoside (AraC) para as placas para reduzir a contaminação glia. Para cada mL de mídia 0,5 µ l de 20mm AraC é necessária. Adição de AraC não exige uma mudança de mídia. Se as células são para ser mantida por 7 a 8 dias, repetir este tratamento no dia 3.
14. Manter culturas numa incubadora 5% CO ₂ a 37 ° C e alimentar com 100 µ l de glicose de 100 mM, adicionado à cultura para cada 2 mL de mídia a cada 2 dias últimos 5 dias. Uma mudança completa de meios de comunicação não é necessária.

4. Embalagens de Lentivirus, purificação e titulação

Nota: O protocolo para a embalagem, concentração, purificação e titulação de lentivirus anteriormente foi descrito em detalhe sem o uso de um kit ²⁸, incluindo métodos alternativos para a titulação, tais como fluxo cytometry ²⁹. Aqui apresentamos brevemente o protocolo usado no nosso laboratório para a produção de lentivirus para estudar a lesão neuronal usando solução de purificação de vírus rápida e um kit de titulação Lentivirus qPCR.

1. Placa Hek293T células em pratos de cultura de 10 cm com Dulbecco ' s modificado águia ' s essencial meio mínimo (DMEM) suplementado com 10% FBS. Para a obtenção de um alto título viral, cresce pelo menos 5 placas de células Hek293T para cada transfeccao. Certifique-se que no dia de células de transfeccao são 70% de Confluencia. Mudar a mídia três horas antes do transfection.
2. Para cada transfeccao, preparar dois tubos. No tubo 1 Adicione 1,5 mL soro MEM-reduzida media e 41 µ l de reagente de transfeccao, misture bem. No tubo 2, adicione 1,5 mL de mídia soro MEM-reduzido e 6 µ g de plasmídeo de transferência, 6 µ g de pCMV-dR8.2 vetor (plasmídeo de embalagem), vetor de pCMV-VSV-G 3 µ g (plasmídeo de envelope) e 35 µ l de reagente de potenciador p3000 (fornecido com lipofectamine). Misture bem e combinar tubos 1 e 2, vórtice e incube por 15 min.
3. Retire 50% da mídia Hek293T chapas e adicionar complexos lipídios-DNA às células. Incube durante 6 h a 37 ° C, 5% de CO ₂. Meios de remover e substituir com 5 mL de DMEM fresco, incubar durante uma noite.
4. Em 24 h após transfeccao, coletar o primeiro lote de viral sobrenadante de cada prato. Mantenha a mídia viral a 4 ° C e adicionar 5 mL de mídia fresca em cada placa de células Hek293T. Incubar durante uma noite.
5. 48 h pós-transfection, coletar o segundo lote de sobrenadante viral, combiná-lo com o primeiro lote e centrifugar o sobrenadante viral combinada durante 10 minutos a 600 x g.
6. Filtrar o sobrenadante através de um filtro com tamanho de poro 45 µm.
7. Purificar o vírus usando uma solução de purificação de vírus de rápida. Para cada 45 mL de sobrenadante viral, adicionar 5 mL de solução de vinculação Lentivirus, mistura e centrifugar durante 10 minutos a > 5.000 x g e 4 ° C.
8. Remover o sobrenadante cuidadosamente para não perturbar o sedimento.
9. Adicionar 20 a 40 µ l de meio e ressuspender o sedimento. Alíquota e conservar a -80 ° C.
10. Para obter o título de Lentivirus, um kit de titulação Lentivirus qPCR é usado. Dilua 2 µ l de vírus purificado em 500 µ l de PBS. Adicionar 2 µ l do vírus diluído a 18 µ l de tampão de lise de vírus (fornecido no kit).
11. Conjunto de três diferentes reações de PCR-RT-q em triplica e rotulá-los como, controle de lisado, positivo viral 1 (STD1) e controle positivo 2 (STD2). Para cada reação adicionar, 12,5 µ l de 2 x qPCR MasterMix, 2,5 µ l de qualquer viral lisado ou STD1 (fornecido no kit) ou STD2 (fornecido no kit) e 10 µ l de reagente-mix (fornecido no kit) em tubos PCR de 0,2 mL.
12. Definir o programa PCR como segue: 20 min a 42 ° C, durante a transcrição reversa, 10 min a 95 ° C, para a ativação da enzima, 40 ciclos de 15 s a 95 ° C para desnaturação e 1 min a 60 ° C para recozimento/extensão.
13. Calcular o título viral usando esta fórmula:
    Título do viral lisado = 5 x 10 ⁷ / 2 ^{3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1)}.
    CTX = valor médio do Ct da amostra desconhecida, Ct1 = valor médio da STD1, Ct2 = valor médio de STD2.
    Nota: CGNs pode ser melhor transduzidas com lentivírus ou infectados com adenovírus dependendo do modo da lesão a ser estudado. Adição de lentivírus em um MOI de 2-3 para a solução de cultura celular no momento do chapeamento é usada para estudar NMDA induzido sinalização no 7º dia da cultura. Isso resulta em mais de 80% transdução e é apropriado para prosseguir com as análises bioquímicas destes neurônios ( Figura 2). Adição de adenovírus no dia 5 de cultura (em MOI 50) e estudando NMDA induzido sinalização no dia 7-8 é usada por outras técnicas como a imagiologia. Este tratamento resulta em menos de 10% infecção dos neurônios, tornando-se ideal para geração de imagens e localização co de proteínas. Adenovírus podem ser usados no momento do chapeamento para estudar a morte de pilha do DNA danos induzidos pela adição de camptothecin no dia 2-3 ou estresse oxidativo pela adição de peróxido de hidrogênio. A presença de proteínas de fluorescência (GFP, RFP, PCP ou YFP) marcada para o gene de interesse pode ser usada para estimar a porcentagem transdução e toxicidade potencial. Com o MOI recomendada, vemos toxicidade mínima e máxima transdução ( Figura 3).

5. Modelagem de lesão Neuronal

1. para induzir NMDA induzida excitotoxicidade neuronal, após 7 dias em vitro, tratar CGNs com 100 µM NMDA e glicina de 10 µM para 1 h. Substitua todo o meio meio condicionado de culturas paralelas com n tratamento. Esta concentração resulta em morte celular de 50% no tratamento de post de 24 h ( Figura 3). Fragmentação mitocondrial é evidente no tratamento de post de 6-8 h (ver Jr-Asl et al ^{26 , 27}).
2. para induzir a morte celular induzida por ROS (estresse oxidativo), tratar neuroNS com 75-100 µM de peróxido de hidrogênio (H ₂ O ₂) e interruptor para condicionado meios de culturas paralelas, após a exposição de 5 min a H ₂ O ₂. Nota, devido à instabilidade de H ₂ O ₂, otimizar a concentração a um nível que induz a morte celular de 50-70% na cultura após 24 h de tratamento.
3. Para induzir DNA dano morte celular induzida, tratar CGNs com 10 µM camptothecin. Esta concentração induz a mais do que a morte celular de 50% em 24 h. fragmentação mitocondrial e sinalização precoce de apoptose ocorre 2-3 h após a adição de camptothecin nessa concentração (ver Jr-Asl et al ¹⁸)
4. para induzir baixo K + induzida neuronal apoptosis em CGNs, mudar a mídia contendo 25 mM K ⁺ a mídia de baixo nível de potássio com 5 mM K ⁺ após 7 dias em vitro.

Com dissecção cuidadosa, o cérebro intacto deve ser removido com danos mínimos, como pode ser visto na figura 1A-B. Esforço deve ser tomado para minimizar os danos ao cérebro durante a remoção, particularmente danos no cerebelo. Danificar o cerebelo faz mais difícil identificação e remoção completa das meninges e aumenta a probabilidade de contaminação da cultura neuronal. Uma vez que foram removidas das meninges, o cerebelo pode ser dissecado do tecido remanescente, como visto na Figura 1 e preparado para dissociação.

Antes de chapeamento, CGNs pode ser transfectadas com lentivirus ou infectados com o vírus adenoide, conforme descrito na Figura 2. Encontramos a máxima eficiência e toxicidade mínima com 50 MOI de infecção com o adenovírus e um MOI de 2-3 no dia de chapeamento de lentivirus (Figura 3).

Culturas CGN transduzidas saudáveis na DIV 7 são apresentadas na Figura 3A. Se um grande número de glia permanecem presente na cultura, a concentração de AraC pode ser aumentada para garantir uma população neuronal pura. Também células gliais ocupam o vírus mais facilmente do que os neurônios e isso torna-se crítica se as transductions são realizadas no dia 5. A presença de neurônios submetidos a morte celular pode ser avaliada pela formação de núcleos picnóticos, como visto na Figura 3. Todas as concentrações do NMDA, H2O2e Camptothecin são otimizados para induzir a morte celular de 50% após 24 h. Isto permite estudar outros primeiros eventos que precedem a perda neuronal como fragmentação mitocondrial.

Figura 1: remoção de cérebro de rato e dissecação do cerebelo. (A) para extrair o cérebro de um rato de 6-7 dias de idade, usando um par de pinças, segure a cabeça e cortar a pele anteriormente ao longo das linhas pontilhadas usando um par de tesouras de microdissection. Tenha cuidado para cortar somente a pele e o tecido conjuntivo, uma incisão profunda também pode perfurar o crânio e danificar o cérebro. Estas três incisões, em linha reta ao longo da linha mediana e dois, curvando-se lateralmente, permitem que a pele ser empurrado de volta revelando o crânio. Uma vez expostos, o crânio pode ser penetrado com a ponta da tesoura e cortar anteriormente. Grande cuidado deve ser tomado para não danificar o cerebelo para facilitar a identificação e remoção das meninges. Uma vez cortado, fórceps pode ser usado para descascar o crânio, expondo o cérebro, que então pode ser esmiuçado para fora em solução de dissecação legal usando um par de pinças ou espátula. A fim de remover o cérebro, o nervo óptico pode precisar de ser cortada. (B) uma vez retirados do crânio, das meninges deverá ser retiradas o cerebelo usando um par de pinças de ponta fina. (C) usando um par de pinça com ponta fina, o cerebelo é dissecado do tecido remanescente e inspecionado para garantir a remoção completa das meninges. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: modelagem lesão neuronal em neurônios Cerebelares grânulo. Cerebella isolado do dia que 6-7 ratos são dissociados em células individuais, seguindo o procedimento apresentado na parte 3. Após dissociação, as células são contadas e resuspended em um volume de meios de cultura para gerar 1,5 x 106 cells/mL.For pratos de 35 mm, 4 mL são banhados, dando 6 x 106 células por placa. Para imagens slides, 0,5 mL é chapeado, dando 7,5 x 105 células/poço. CGNs pode então ser transfectadas com lentivirus ou infectados com o vírus adenoide. Usando adenovírus no dia do chapeamento (0 dias em vitro (DIV)) dá maior que 90% de eficiência de transfeccao e permite o estudo da lesão neuronal através de stress oxidativo e dano do ADN. A adição de 10 µM camptothecin (CPT) irá induzir dano do ADN, enquanto 75-100 µM peróxido de hidrogênio (H2O2) irá induzir o estresse oxidativo. A concentração de H2O2 deve ser otimizada para induzir a morte celular de 50% após 24 h. Infectando com adenovírus na DIV 5 dá uma baixa eficiência de transdução de menos de 10%. Na DIV 7 quando os receptores NMDA são enriquecidos na cultura, neurônios podem ser tratados com 100 µM NMDA e glicina de 10 µM para induzir excitotoxicidade. Isto é ideal para posterior análise de imagem ou rastreamento de um único neurônio. Finalmente, transducing com lentivirus no DIV 0, seguido pelo tratamento com NMDA de 100 µM e 10 µM glicina, na DIV 7, dá uma eficiência de transdução suficientemente alta (> 80%) para permitir a análise bioquímica da cultura, incluindo ChIP sequenciamento, examinando expressão da proteína e realizando ensaios ao vivo/morto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: neurônios Cerebelares grânulo. (A) neurônios foram transformados com lentivírus para RFP em um MOI de 3 no momento do chapeamento e fixo e manchados em 7 dias in vitro. Colocalization do sinal RFP, MAP2 e Hoechst é mostrado para demonstrar neurônios saudáveis que são totalmente transformados por lentivírus. (B) as imagens representam análises ao vivo morto ensaio de neurônios infectados com MOI diferente, para medir a toxicidade. CGNs infectados com adenovírus expressando LacZ em um MOI entre 25 e 50 permite a máxima eficiência, mantendo a toxicidade mínima. Menos do que uma diferença de 1% na sobrevivência da pilha em relação ao controle é vista quando infectando a este MOI. (C) Hoechst coloração de controle CGNs e CGNs tratados com NMDA para induzir a morte celular. Observe a formação de núcleos picnóticos com tratamento de NMDA. Isso é indicativo de morte celular e pode ser visto em aproximadamente 50% da cultura 24 h após o tratamento com NMDA de 100 µM e 10 µM glicina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.