Isolamento de F₁-ATPase do Protista parasita Trypanosoma brucei

Os F-tipo ATP sintases estão ligados a membrana rotativa complexos Multiproteicos translocação de prótons que casal entre energia-transducing membranas de cloroplastos, mitocôndrias e bactérias com a formação de ATP. Detalhes moleculares do mecanismo rotacional da síntese de ATP são conhecidos principalmente por causa de estudos estruturais de purificado bacteriana e mitochondrial ATP sintases e seus subcomplexes¹. F-tipo ATP sintase está organizado em partes da membrana-intrínsecos e extrínsecos-membrana. A parte da membrana-extrínseco, conhecida como F₁-ATPase, contém três sites catalíticos, onde ocorre a fosforilação de difosfato de adenosina (ADP) para ATP ou a reação inversa. F₁-ATPase pode ser libertada experimentalmente o moiety intrínsecas da membrana mantendo sua capacidade de hidrolisar, mas não sintetizar, ATP. O setor de membrana-limite, chamado F_ó, Medeia a translocação da proteína, que leva a rotação da parte central da enzima. Os setores de_ó de F e F₁ são conectados pelos talos centrais e periféricos.

O primeiro tenta purificar o F₁-ATPase do fermento de brotamento e coração bovinos mitocôndrias data voltar à década de 1960. Estes protocolos usados extraído de mitocôndrias, que foram interrompidas pelo sonication, fracionado por precipitação de sulfato de amônio ou protamina, seguida da execução opcional cromatografia e tratamento térmico^{2,3,4 ,5,6}. A purificação foi grandemente melhorada e simplificada pelo uso de clorofórmio, que prontamente libera o F₁-ATPase da membrana mitocondrial fragmentos⁷. A extração de clorofórmio foi então usada para extrair F₁- ATPase de vários animal, vegetal e bacterianas fontes (por exemplo, fígado de ratos⁸, milho⁹, Arum maculatum¹⁰e Escherichia coli ¹¹). Mais purificação do clorofórmio-lançado F₁-ATPase por cromatografia de afinidade ou tamanho-exclusão (SEC) rendeu uma proteína altamente pura complexa, que era adequada para a determinação da estrutura de alta resolução por cristalografia de raios x, como documentado pelas estruturas de F₁-ATPase de coração bovino^12,13 e Saccharomyces cerevisiae¹⁴. F₁-estruturas de ATPase determinaram-se também de organismos que são difíceis de cultivar e, assim, a quantidade de matéria biológica inicial foi limitada. Neste caso, a F-₁-subunidades ATPase foram artificialmente expressa e montados para o complexo em e. coli, e a enzima heteróloga toda foi purificada por afinidade cromatografia através de uma subunidade marcada. Tal abordagem levou à determinação de F₁-estruturas de ATPase de duas espécies de bactérias termofílicas, Geobacillus stearothermophilus¹⁵ e Caldalkalibacillus thermarum^{16, 17}. no entanto, esta metodologia é bastante inadequada para eucariontes F₁- ATPase desde que baseia-se no aparelho protheosynthetic procarióticas, processamento pós-traducional e montagem complexa.

A extração baseado em clorofórmio foi usada anteriormente para isolar F₁- ATPase de digenetic unicelulares parasitas Trypanosoma cruzi¹⁸ e T. brucei¹⁹, importantes patógenos mamíferos causando americano e Trypanosomiases africanos, respectivamente e de monogénicas inseto parasita Crithidia fasciculata²⁰. Estas purificações levaram apenas para uma simples descrição do F₁- ATPase, desde que não há aplicações a jusante foram usadas para caracterizar plenamente a composição, estrutura e propriedades enzimáticas do complexo. Este artigo descreve um método otimizado para F₁-purificação ATPase desde a fase do ciclo de vida de inseto culta de T. brucei. O método é desenvolvido com base em protocolos estabelecidos para isolamento de bovinos e levedura F₁- ATPase^21,22. O procedimento produz altamente pura e homogênea enzima apropriada para em vitro enzimática e inibitórios ensaios, caracterização detalhada proteomic por espectrometria de massa²³e de determinação de estrutura²⁴. O protocolo de purificação e o conhecimento da F₁-estrutura ATPase do nível atômico abre uma possibilidade para a concepção de telas para identificar inibidores da pequeno-molécula e ajuda no desenvolvimento de novas drogas contra trypanosomiases africanos. Além disso, o protocolo pode ser adaptado para purificar F₁-ATPase de outros organismos.

1. buffers e soluções

1. Prepare as soluções listadas abaixo. Desgaseifica todos os buffers para cromatografia líquida. Adicione inibidores da protease, Benzamidina e ADP imediatamente antes da utilização.
   1. Prepare o tampão de tampão a: 50 mM Tris com ácido clorídrico (Tris-HCl) pH 8.0, 0,25 M de sacarose, Benzamidina de 5 mM, 5 mM aminocaproico ácido (ACA) e protease inibidores (10 µM amastatin, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatin, 50 leupeptin µM e 50 µM diprotin A).
   2. Prepare o tampão b: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,25 M de sacarose, ácido de 4mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), Benzamidina 5 mM, 5 mM ACA, 1mm ADP e ao inibidores de protease (10 µM amastatin, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatin, 50 leupeptin µM e 50 µM diprotin A).
   3. Preparar o tampão de Q-coluna: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 4 mM de EDTA, 10 mM de MgSO₄, 5mm benzamidina, 5mm ACA e 1 mM ADP.
   4. Preparar o tampão de eluição de Q-coluna: buffer de Q-coluna com 1 M de NaCl.
   5. Preparar o tampão do SEC: pH 20 mM Tris-HCl 8.0, 10 mM de MgSO₄, 100 mM de NaCl, 1 mM ADP.
   6. Prepare o clorofórmio saturado com 2 M Tris-HCl pH 8,5. Misture o clorofórmio com 2 M Tris-HCl pH 8,5 em aproximadamente a proporção 1:1 em um frasco de tampa de rosca, agitar, deixar as fases orgânicas e aquosas separadas e medir o pH na camada aquosa superior com uma tira de papel indicador de pH. Armazenar em temperatura ambiente. Imediatamente antes da utilização, agitar novamente e deixe as fases separadas. Use a camada inferior de clorofórmio.
      Cuidado: Clorofórmio é volátil e irritante para os olhos e pele. Trabalho em uma coifa. Use óculos de segurança quando a tremer.

2. preparação de partículas submitocondrial

1. Resuspenda vesículas mitocondriais (mitoplasts) isoladas por lise hipotónica²⁵ de 1 x 10¹¹ a 2 x 10¹¹ células de procyclic T. brucei em 5 mL de tampão gelada r. manter a amostra refrigerada até o passo 3.2.
2. Determine a concentração de proteína na suspensão pelo bicinchoninic ácido (BCA) proteína ensaio²⁶ de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Use uma série de diluições de albumina de soro bovino (BSA) em água ultrapura para construir a curva padrão. Dilua uma pequena quantidade de amostra 20 - 100 vezes com água ultrapura para encaixar nos padrões da gama de BSA.
   2. Calcular a quantidade de proteína total na amostra e trazer a concentração de proteína de 16 mg/mL, diluindo-lo com buffer adicionais A.
3. Fragmentar mitoplasts em vesículas invertidas e pedaços de membrana por sonication da suspensão 7 x 15 s com uma energia total de 70 a 100 J por impulso com um microtip de 3,9 mm de diâmetro. Se o homogenizador Ultrassônico não exibir a saída de energia, comece a otimização em 50% da potência máxima. Incubar a amostra em gelo por 30 s entre impulsos. Após o sonication, a suspensão torna-se um pouco mais escura.
4. Fragmentos de sedimentos da membrana por ultracentrifugação a 54.000 x g, durante 16 h ou a 98.000 x g, durante 5 h a 4 ° C. Decante o sobrenadante e prosseguir com a extração de clorofórmio, ou congelam o sedimento em nitrogênio líquido e armazená-lo a-80 ° C.

3. liberação de F₁-ATPase de membrana por clorofórmio

1. Resuspenda o pellet de membranas mitocondriais em buffer B com o auxílio de um pequena homogenizacao homogenizador. Calcular o volume de tampão B com base no montante total do buffer de um usado na fórmula de passos 2.1 e 2.2, usando o seguinte: volume (tampão B) = volume (tampão A) x 12/21. Transferi a suspensão para um tubo cônico de 15 ou 50 mL.
2. Retire a amostra de gelo e, de agora em diante, manter a amostra e todas as soluções para ser usado em temperatura ambiente.
3. Adicionar clorofórmio saturado com 2 M Tris-HCl pH 8,5; o volume de clorofórmio a ser adicionado é igual a metade do volume da suspensão. Feche a tampa firmemente. Agitá-lo vigorosamente para exatamente 20 s. centrifugá-lo imediatamente a 8.400 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
4. Transferi a fase aquosa superior nublada para microtubos de 1,6 mL. Adicione inibidores de protease (10 µM amastatin, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatin, 50 leupeptin µM e 50 µM diprotin A) para substituir os inibidores removidos pelo tratamento clorofórmio. Centrifugar as amostras a 13.000 x g durante 30 min à temperatura ambiente. Transferir o sobrenadante para microtubos frescos e repetir a centrifugação para remover qualquer material insolúvel.

4. permutadora cromatografia

1. Equilibrar a coluna de troca (Q) 5 mL ânion conectada a um sistema de cromatografia líquida de rápido-proteína com o buffer Q-coluna a uma taxa de fluxo de 5 mL/min até a absorbância em 280 nm e a condutividade estabilizar (aproximadamente 50 mL de tampão).
2. Carregar o sobrenadante da etapa 3.3 na coluna equilibrada em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. espere até a absorbância em 280 nm estabiliza em segundo plano. Aplica um gradiente linear de 25 mL do buffer Q-coluna eluição de 0% a 100% a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. coletar frações de 1 mL.
3. Ensaio as frações individuais correspondente ao pico de eluição principais para a atividade hidrolítica de ATP pelo ensaio Pullman ATPase² em pH 8.0. Use 10 µ l de cada fração por 1 mL da mistura de reação. As frações que apresentam atividade ATPase do pool. Opcionalmente, separe 10 µ l de cada fração em eletroforese em gel de poliacrilamida fosfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE) e manchar o gel por Coomassie Blue Visualizar individual F₁-subunidades ATPase e proteínas contaminantes.
4. Concentre-se as amostras por ultrafiltração de membrana com uma coluna de rotação com um filtro de PES MWCO 100.000 de 200-500 µ l. proceder à SEC ou loja da amostra durante a noite em temperatura ambiente.

5. tamanho-exclusão cromatografia

1. Equilibrar a coluna SEC conectada a um sistema de cromatografia líquida pelo menos 48 mL (dois volumes de coluna) do buffer SEC com um caudal de 0,5 mL/min.
2. Aplique a amostra na coluna e executar cromatografia com um caudal de 0,25 mL/min. coletamos frações de 0,25 mL.
3. Execute 10 µ l das frações que correspondem aos picos do rastreamento absorvância UV_280nm em SDS-PAGE e manchá-las por Coomassie Blue. O primeiro pico principal contém o F₁-ATPase. Ensaio as frações correspondentes a este pico para o ATP hidrolítica atividade e azida sensibilidade por ensaio de Pullman ATPase. Determine a concentração de proteína, o ensaio BCA.
4. Manter o purificada F₁-ATPase em temperatura ambiente e usá-lo dentro d 3 após a purificação para aplicações a jusante. Como alternativa, concentrar a amostra com uma coluna de rotação com um filtro de PES MWCO 100.000 > 1,5 mg / ml, precipitado, misturando-o com sulfato de amônio saturado ajustou a pH 8.0 (1.2 x volume) e armazená-lo em 4 ° C.

Uma purificação típica (Figura 1) começa com vesículas mitocondriais (mitoplasts) isoladas do gradiente de Percoll de hypotonically lisados 1 x 1011 para 2 x 1011 procyclic T. brucei células25 cultivadas no padrão rico em glicose SDM-79 médio27. Os mitoplasts são fragmentados por sonication, fiado, e o matriz contendo sobrenadante é Descartado. As membranas mitocondriais são tratadas com clorofórmio para liberar o F1-ATPase. Após a centrifugação, a fase orgânica e precipitado interfase são descartadas. A fase aquosa é fracionada por cromatografia de troca iônica em quaternário de amônio, um trocador de ânion forte (Figura 2A). As frações que correspondem a eluição maior pico e conter o F1-ATPase são agrupados e concentrada. Este material serve como a entrada para a SEC, que elimina as impurezas residuais. O principal contaminante é dihydrolipoyl desidrogenase, que elutes da coluna SEC como um pico discreto, marcado pela barra verde escura na Figura 2B. A F-1-ATPase elutes no primeiro pico dominante, em grande parte simétrico (Figura 2B).

O progresso da purificação é seguido o ensaio da proteína BCA (ou outro ensaio comum de proteína), SDS-PAGE e o acompanhamento da atividade ATPásica. A taxa de hidrólise de ATP é medida pelo ATP de Pullman regenerando ensaio2, baseada o decréscimo de absorbância do NADH na reação de acoplamento. Azida sódica, um inibidor estabelecido de F1-ATPase, é usado em uma concentração de 2 mM para determinar a proporção do F1-ATPase-específico hidrólise de ATP. Normalmente, o material de entrada contém cerca de 150-300 mg de proteína mitocondrial, dependendo do número de células utilizadas como fonte de vesículas mitocondriais. A proporção de azida sensíveis da atividade ATPásica total é cerca de 30% a 40% nesta fase. Após a extração de clorofórmio, mais de 90% da atividade da ATPase na amostra contribuiu para a F-1-ATPase. A purificada F1- ATPase é virtualmente completamente sensível para o tratamento de azida sódica (a ATPase residual mínima atividade pode ser atribuída à autólise fundo ATP) e representa cerca de 1% da massa entrada, com um rendimento aproximado de 1 - 1,5 mg de F-1-ATPase por 1 x 1011 células (tabela 1). Um padrão típico de banda após a separação do purificada F1-ATPase em gel de SDS-PAGE seguido de coloração de azul de Coomassie é mostrado na Figura 2. As proteínas foram identificadas pela massa do peptide recolha de impressões digitais e caracterizado em detalhe por várias abordagens de espectrometria de massa23. Esporádicas fracas bandas visíveis acima da faixa de subunidade beta representam subcomplexes do α3β3 capacete (dímeros e oligómeros de subunidades α e β) e são desprovidas de quaisquer contaminantes detectáveis por técnicas de espectrometria de massa sensível. A purificada F1-ATPase pode ser armazenada por até vários dias no buffer SEC à temperatura ambiente. Alternativamente, o F1-ATPase concentrado para ≥2 mg/mL pode ser precipitado por um volume igual de sulfato de amônio saturado no buffer SEC, com pH ajustado para 8,0 e armazenado a 4 ° C. Pelo menos seis meses após a precipitação, a enzima activa com nenhuma degradação óbvia de qualquer subunidade pode ser obtida por redissolving o material precipitado no SEC buffer ou solução semelhante. No entanto, mais de um mês de armazenamento não é adequado para cristalização, conforme determinado empiricamente.

Figura 1 : Esquema do processo de purificação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Purificação de duas etapas do clorofórmio-lançado F1-ATPase por cromatografia líquida de. (A) perfil de eluição da cromatografia de troca aniónica (painel superior) e selecionadas frações separadas sobre o gel de SDS-PAGE de Tris-glicina 10% - 20% corado com o corante azul de Coomassie (painel inferior). Azul de rastreamento: absorção UV em 280 nm; traço vermelho: concentração de NaCl no buffer de eluição; Entrada: a F1-ATPase lançado pelo clorofórmio; FT: de passagem. (B) perfil de eluição da SEC (painel superior) e selecionadas frações separadas sobre o gel de SDS-PAGE, corado com tintura de azul de Coomassie (painel inferior). Entrada: pool frações da cromatografia de troca aniónica contendo F1-ATPase. As barras de código de cores em painéis A e B marcam as frações nos perfis de eluição que foram analisadas por SDS-PAGE e as vias correspondentes no gel respectivo. (C) as identidades das proteínas individuais do isolado F1-ATPase identificados por espectrometria de massa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Exemplo do progresso típico e rendimento do F1-purificação da ATPase de mitocôndrias isoladas de 1 x 1011 procyclic pilhas de T. brucei .

Os autores não têm nada para divulgar.