Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

Células de mamíferos estão sujeitos a estresse mecânico, osmótico e bioquímico, resultando na perda da integridade da membrana plasmática. Sem rápida e eficiente de fechamento, células danificadas rapidamente iria sucumbir à morte programada ou necrótica. Desde a década de 1960, os esforços para compreender a membrana de plasma nesse processo tem sido motivados pelas consequências devastadoras associadas com suas disfunções. Na verdade, doenças como Distrofia Muscular de membro-cinta, diabetes e síndrome de Chediak-Higashi têm sido associadas a reparação da membrana de plasma deficiente devido a mutações no gene dysferlin codificação, produção de produtos finais de glicação avançada e defeitos em o regulador de tráfico dos lisossomos CHS1, respectivamente,^1,2,3,4,5,6. No entanto, até à data, nossa compreensão da membrana de fechamento é ainda limitado⁷. Os estudos iniciais demonstraram que a membrana recelagem é iniciada pelo influxo de extracelular Ca^{2 +} através da membrana de plasma danificado^8,9,10. Desde então, vários não mutuamente exclusivas Ca^{2 +}-dependentes mecanismos têm sido propostos para selar as células. A hipótese de remendo propõe que no próximo a ferida, intracelulares vesículas fundem-se com os outros e a membrana plasmática danificada para atuar como um patch^11,12,13,14. Um segundo modelo propõe que exocitose de cálcio-dependente de lisossomos para a ferida local libera a enzima lisossomal sphingomyelinase ácido, que converte esfingomielina, a ceramida no folheto externo da membrana plasmática. Esta súbita mudança na composição de lipídios resulta em endocitose ceramida-conduzido a região danificada^15,16,17. Por último, o terceiro mecanismo proposto envolve um papel para o CDDP classificação complexa necessária para o transporte (ESCRT) promover a formação de vesículas virados que brote fora da membrana plasmática¹⁸. Somente um conjunto limitado de proteínas foi identificado nestes modelos, e suas máquinas devem ser ainda mais elucidada.

Aqui descrevemos um ensaio de alto rendimento que medidas a membrana plasmática recelagem eficiência em células de mamíferos aderentes sujeitos a danos mediadas por recombinação listeriolisina O (LLO)¹⁹. LLO é uma toxina formadoras de poros (PFT) secretada pelo patógeno intracelular facultativo Listeria monocytogenes^20,21,22 e pertence a MACPF/CDC (complexo de ataque de membrana, perforina, e Superfamília Citolisina dependente de colesterol). MACPF são mamíferos poro-formando proteínas envolvidas em defesas imunitárias, Considerando que os conjuntos são toxinas bacterianas principalmente produziram por patógenos gram-positivos que danificam as células do hospedeiro para promover sua patogenicidade, estilos de vida²³. Conjuntos são sintetizados como monômeros Water-soluble ou dímeros que se ligam ao colesterol presente na membrana plasmática e oligomerize em um complexo prepore de até 50 subunidades. O complexo de prepore então se reorganiza para inserir β-vertentes através da bicamada lipídica, formando um poro do β-tambor que se estende por 30-50 nm de diâmetro^24,25,26,27.  Estes poros dilatados permitam fluxos de íons e pequenos componentes celulares dentro e fora da célula; no entanto, alguns estudos têm proposto que os poros de tamanhos menores também são formados^28,29,30. Entre os conjuntos, LLO exibe propriedades exclusivas, incluindo agregação irreversível e temperatura-dependente do pH, que é propício para análises de alta produtividade^31,32. LLO pode ser adicionado ao meio de cultura de células no 4 ˚ c, uma temperatura permissiva a sua ligação às células, mas não para a formação do complexo do poro. Iniciação de formação de poros então pode ser sincronizada, elevando a temperatura a 37 ˚ c, permitindo que pela difusão de moléculas de toxina no plano da membrana oligómeros de forma eficiente e para a remodelação conformacional envolvidos na geração de poros. Portanto, seguir o interruptor de temperatura, a cinética de danos celulares dependerá da quantidade de toxina ligada a membrana plasmática. Importante, LLO solúvel (não ligado a membrana plasmática) rápida e irreversivelmente agrega quando a temperatura atinge 37 ˚ c, que alivia a necessidade de lavar as moléculas da toxina não acoplado e limita a extensão dos danos de membrana ao longo do tempo. Por último, porque LLO vincula-se ao colesterol e forma poros nas membranas celulares ricos em colesterol, este ensaio é passível de uma ampla variedade de células de mamíferos. É importante ter em mente que LLO afeta a célula hospedeira sinalização principalmente através de formação de poros, com poucas exceções em qual célula independente de poro sinalização pode ocorrer^{33,34,35,36 ,37,38,39}. Portanto, não pode ser excluído que LLO sinalização atividades podem influenciar o processo de reparação da membrana.

Este ensaio avalia diretamente a extensão da célula ferindo medindo-se a incorporação de uma célula impermeant fluorocromo (por exemplo, iodeto de propidium) que passivamente entra as células feridas e torna-se altamente fluorescente, uma vez que associa os ácidos nucleicos . Daí, o fluorocromo pode ser mantido em meio de cultura celular durante todo o experimento, permitindo análises em tempo real da célula ferindo. A intensidade da fluorescência do corante ácido nucleico-ligação aumentará a concentração de toxina e, para uma dada concentração de toxina, irá aumentar ao longo do tempo até que todos os poros são formados, e as células são totalmente reparadas ou até saturação é alcançada. O afluxo de extracelular Ca^{2 +} através da membrana poros é um evento de condição sine qua non para selar. Portanto, a eficiência de fechamento pode ser evidenciada indiretamente comparando a célula ferindo em meio de cultura contendo Ca^{2 +} (condição permissiva do reparo) para ferir em um Ca^{2 +}-livre médio (condição restritiva de reparação). Porque a intensidade da fluorescência do corante ácido nucleico-vinculação é diretamente proporcional à concentração de células em cada poço, é importante para as células de semente na mesma concentração em todos os poços. Também é importante enumerar as células em cada poço antes e após o ensaio para garantir que desprendimento celular não ocorre, como flutuante, agregados de células podem obscurecer as leituras de fluorescência que podem complicar a interpretação dos dados. Para enumerar as células, as células expressando nuclear-localizada histona 2B-GFP (H2B-GFP) foram utilizadas neste ensaio. Temperatura controlada, multi-modo, leitores de microplacas combinam rápidas medições, de alto rendimento (usando um formato de placa de 96 ou 384 poços) das intensidades de fluorescência com imagem de microscopia de células vivas, a 37 ° C. Este último pode ser usado para enumerar o número de telemóvel e observar a eventual formação de populações de células distintas.

Em última análise, este ensaio fornece aos usuários a capacidade de expandir seus conhecimentos sobre a complexidade dos mecanismos de reparação da membrana por triagem para moléculas do anfitrião ou reparar de forma exógena adicionados compostos que podem controlar a membrana. O protocolo a seguir descreve as etapas experimentais para medir a eficiência de fechamento de células expostas a LLO e avaliar os efeitos de uma determinada droga ou tratamento celular na eficiência de fechamento.

1. preparação

1. Chapeamento de célula
   Nota: Células epiteliais do colo do útero humanas, HeLa e HeLa expressando histona 2B-GFP (H2B-GFP), foram utilizadas neste protocolo, mas este ensaio pode ser adaptado a outras células de mamíferos,¹⁹.
   1. Separe células aderentes de um frasco de cultura de células de² 75cm lavando as células com 2 mL de EDTA-tripsina 0,25%. Substitua a tripsina usada com 2 mL de fresco do trypsin-EDTA 0,25%.
   2. Incube as celulas em 37 ˚ c por 5 min até as células arredondadas e retirado o balão.
   3. Ressuspender as células em 8 mL de meio de cultura (DMEM contendo 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL).
   4. Determine a concentração de células usando um hemocytometer e 10 µ l de suspensão de células.
   5. Dilua as células em um meio para uma concentração de 2,5 x 10⁵ células/mL.
   6. Despeje a suspensão de células em uma bacia de pipeta estéril e misturar cuidadosamente a suspensão usando uma pipeta sorológica 10ml.
   7. Utilizando uma micropipeta multicanal-12 e 200 µ l dicas, distribua células HeLa (2,5 x 10⁴ células/100 µ l/poço) em triplicado (ou quatro exemplares) em uma placa de cultura de tecidos tratados poliestireno inferior plana de 96 poços, claro, preto.
      Nota: Um arranjo de chapeamento é apresentado como um exemplo na Figura 1.
   8. Cultura de células para 24 h em uma incubadora de cultura celular umidificado no 37 ˚ c e 5% CO₂.
2. Preparação da solução-mãe
   1. Preparar 1 L de um estoque de 10 x de buffer M (usado para preparar a M1 e M2) pela adição de 95 g de Hanks equilibrada solução salina, 0,476 g de MgCl₂ (5 mM) e 23,83 g de HEPES (100 mM) de 900 mL de água. Ajustar o pH para 7,4 e aumentar o volume de 1 L. Filter esterilizar.
   2. Prepare-se 50 mL de um 50 x (1.25 M) estoque de glicose, adicionando 11,26 g de D-(+)-glicose para um total de 50 mL de água. Filtro de esterilizar a solução.
   3. Prepare-se 50 mL de um 100 x estoque (120 mM) de cálcio, adicionando 0,666 g de CaCl₂ para um total de 50 mL de água. Filtro de esterilizar a solução.
   4. Preparar 50 mL de um 10 x estoque (50 mM) de etileno glicol-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N', ácido etilenodiaminotetracético (EGTA) adicionando 0,951 g de EGTA a 40 mL de água. Aumentar o pH a 8 usando NaOH para dissolver o EGTA e, em seguida, aumentar o volume de 50 mL. Filtro de esterilizar a solução.
   5. Para uma única placa de 96 poços, preparar 50 mL de meio 1 (M1, contém Ca^{2 +}), 50 mL de meio 2 (M2, Ca^{2 +}-livre) e 15 mL de 2 meio suplementado com EGTA, consequentemente:
      1. Para M1, adicione 5 mL de 10x Buffer M, 0,5 mL de 100 x CaCl₂e 1 mL de glicose de x 50 a 43,5 mL de água.
      2. Para M2, adicione 5 mL de 10x Buffer M e 1 mL de glicose 50 x a 44 mL de água.
      3. Para M2/EGTA, adicionar 1,5 mL de 10 x Buffer M e 1,5 mL de 10 x EGTA a 12 mL de água.
         Nota: Todas as soluções contendo iodeto de propidium (PI) devem ser preparadas diretamente antes da adição para as células.
3. Placa leitor/imagens citômetro configurações
   Nota: Use um leitor de placa multi-modo, equipado com duas unidades de detecção: um spectrofluorometer e um citômetro de imagem. Limite a exposição de fluorescência para evitar fotobranqueamento o fluorophores.
   1. Pré-aquecer o leitor a 37 ° C antes de realizar o ensaio.
   2. Configurar os parâmetros para o ensaio cinético adequadamente dentro do modo de configurações :
      1. Escolher o monocromador, FL (fluorescência)e cinética para a configuração óptica, modos de ler e ler tipo, respectivamente.
      2. Em Configurações de comprimento de onda, selecione um 9 e 15 nm excitação e emissão bandpass, respectivamente. Para ensaios usando iodeto de propidium (PI), definir os comprimentos de onda de excitação e emissão de 535 e 617 nm, respectivamente.
      3. Em Tipo de placa, selecione 96 poços para o formato da placa e uma configuração de placa de pre-ajuste correspondente para um prato fundo transparente preto-parede.
      4. Sob a Área de leitura, destaca os poços que serão analisados em toda a cinética.
      5. Sob a óptica e PGTO, preset os flashes por leitura de 6 e a caixa de seleção para a leitura da parte inferior.
      6. Sob o Timing, insira 00:30:00 na caixa do Tempo Total de execução de um ensaio cinético de 30 min e insira 00:05:00 para o intervalo.
         Nota: Para cada vez que aponte e um comprimento de onda, o tempo de leitura de uma placa de 96 poços completo é de 30 s.
      7. Confirme as configurações especificadas nas Informações de configurações para a direita e selecione Okey. Imprensa leitura para iniciar a cinética executar.
   3. Configurar os parâmetros de imagem adequadamente dentro do modo de configurações:
      1. Escolher o Minimax, Imaginge ponto de extremidade para a configuração óptica, modos de ler e ler tipo, respectivamente.
      2. Em comprimentos de onda, selecione transmitida a luze uma ou ambas as caixas de fluorescência correspondente a excitação e emissão de comprimentos de onda de 456/541 nm (GFP) e 713/625 nm (PI).
      3. Use as mesmas opções para o Tipo de placa e Área de leitura , conforme definido nas etapas 1.3.2.3 e 1.3.2.4.
      4. Em Bem a área de configuração, selecione o número de sites dentro de um poço para ser fotografada.
         Nota: 12 locais correspondem a uma imagem bem cheia.
      5. Sob as Configurações de aquisição de imagem, selecione os tempos de exposição para luz transmitida, 541 (GFP) e 713 (PI). Para as boas práticas agrícolas, todo o bem com um tempo de exposição de 20 ms/imagem de imagem. Para transmitir luz (TL) e fluorescência de PI, adquirir uma única imagem do centro de cada poço com tempos de exposição de 8 e 20 ms, respectivamente.
      6. Confirme as configurações especificadas nas informações de configurações para a direita e selecione Okey. O tempo de aquisição de imagem de toda a superfície de cada poço (12 imagens/poço) de uma placa de 96 poços e para um comprimento de onda é ~ 15min. imprensa leitura para iniciar a geração de imagens.
         Nota: O tempo de aquisição de um único imagem/bem de uma placa de 96 poços requer ~2.5 min/placa para um comprimento de onda. Os parâmetros descritos acima correspondem ao equipamento específico em nosso laboratório. Spectrofluorometric medições: uma lâmpada de flash de xénon exibindo 1,0 nm incremento da excitação comprimentos de onda (250-850 nm) com um ajustável 9 ou 15 nm passa-banda, um detector de tubo fotomultiplicador com um 6 > log gama dinâmica e uma emissão de nm 15 ou 25 ajustável bandpass. Citômetro de imagem: uma fonte de luz iluminação capaz de luz branca, 460 nm e 625 nm excitação comprimentos de onda com um 20 nm bandpass, filtros de emissão centrados em 541 nm (108 nm bandpass) e 713 nm (123 nm bandpass), respectivamente, e um objectivo X 4 acoplado a um 1.25 megapixel câmera de 12 bits dispositivo de carga acoplada.

2. ensaio

Nota: Na época do ensaio, as células devem ser confluente de 70-90%. Durante as etapas de lavagem, o meio deve ser retirado e aplicado para a parede lateral do poço (não diretamente acima das células). Manter a temperatura de LLO no < 4 ˚ c para evitar a sua agregação até passo 3.1.5.

1. Preparar um estoque de 30 µM PI em M1 e um estoque de 30 µM PI em M2 pré aquecido a 37 ˚ c.
2. Lave delicadamente as células na placa 1 uso uma micropipeta multicanal-12 e 200 µ l conselhos, como segue:
   1. Para condições de reparação-permissivo, remova o meio de crescimento e lavagem que das células duas vezes com 200 µ l/poço M1 pré aquecidas a 37 ˚ c. Substitua o medium com 100 µ l/poço de M1 quente contendo 30 µM PI.
   2. Para reparar a condições restritivas, remover o meio de crescimento e lavar as células uma vez com 200 µ l/poço quente M2 contendo 5 mM EGTA de quelato Ca^{2 +}, seguido por uma lavagem com 200 µ l/poço M2. Substitua o medium com 100 µ l/poço quente M2 contendo 30 µM PI.
   3. Depois que o meio de crescimento foi lavado e substituído com meio contendo iodeto de propidium, directamente mova para passo 2.1.3.
3. Placa 1 sob luz transmitida, GFP e PI como detalhado sob 1.3.3 (pré-cinético). Esta etapa leva 15-20 min.
4. Durante o período de 15 min na etapa 2.1.3, prepare o prato 2 usando uma micropipeta multicanal-12 e 200 µ l dicas da seguinte maneira:
   1. Coloque uma microplaca de polipropileno de fundo redondo de 96 poços no gelo. Configure a placa usando um delineamento experimental correspondente para placa 1 (Figura 1).
   2. Para condições de reparação-permissivo, adicionar 100 µ l/poço de M1 gelada contendo 60 µM PI, seguido pela adição de 100 µ l/poço de M1 gelada contendo 4 x LLO ou não para o controle.
   3. Para condições restritivas para reparação, adicionar 100 µ l/poço de gelada M2 contendo 60 µM PI, seguido pela adição de 100 µ l/poço de gelada M2 contendo 4 x LLO ou não para o controle.
5. Imagem placa 1 (passo 2.1.3), imediatamente depois de colocá-lo no gelo, usando papel alumínio para separar a placa de contato direto com gelo. Permitir que a placa 1 arrefecer por 5 min.
6. Utilizando uma micropipeta multicanal-12 e 200 µ l dicas, transferi 100 µ l de cada poço para a placa 2 (passo 2.1.4) aos poços correspondentes na placa 1. Para distribuir adequadamente a toxina na mídia da chapa 1, insira as dicas abaixo o menisco e ejetar suavemente o volume sem introduzir bolhas.
   Nota: Não pipete acima e para baixo, como isso pode, inadvertidamente, separar as células.
7. Deixe o prato para um 1 min adicional permitir que a toxina a ligar para as células e transferir imediatamente chapa 1 para o leitor para o ensaio cinético usando o modo de spectrofluorometer (passo 1.3.2).
8. No final do ensaio cinético, imediatamente imagem placa 1 (pós-cinético) usando passo 1.3.3.

3. análise: Célula enumeração

1. Determine a contagem de células baseada em fluorescência nuclear usando o software de enumeração de célula de microplacas.
   1. Dentro de configurações, selecione Re-análisee sob a seção categoria dentro as Configurações de análise de imagem , selecione Discreto objeto análise usando 541 como o comprimento de onda para encontrar objetos.
   2. Dentro da opção de encontrar objetos, usando a desenhar nas imagens encontrar método, selecione núcleos sob a guia de configurações e pressione aplicar.
   3. Pressione Okey e leitura para iniciar a célula algoritmo de contagem.
2. Alternativamente, se tal ferramenta não estiver disponível, use um software de análise de imagem tais como ImageJ para enumerar as células.
   1. No ImageJ, abra o arquivo de imagem como uma pilha.
   2. Converter imagens em tons de cinza de 8 bits clicando em imagem na barra de menu, passe o mouse sobre o tipo, a pilha e selecione 8-bit.
   3. Subtrair o plano de fundo: clique na imagem na barra de menus, focalize em ajustee selecione Brightness/Contrast. Ajuste o valor mínimo para remover o ruído de fundo e selecione Apply.
   4. Limiar para criar imagens binárias: clique na imagem na barra de menus, focalize em ajustee selecione o limiar. Selecione o fundo escuro, ajustar os valores de limiar mínimo e máximo e clique em aplicar.
   5. Em caso de cumulação de núcleos, uma ferramenta de bacia hidrográfica pode ser usado para núcleos do segmento. Clique em processo no menu, passe o mouse sobre o binário e selecione o divisor de águas.
      Nota: Isto separará automaticamente núcleos conectados.
   6. Analise as imagens mascaradas aplicando critérios especificados pelo usuário (tamanho e circularidade) para aperfeiçoar a identificação dos núcleos e excluir os restos celulares.
      1. Clique em Analyze no menu e em seguida analisar partículas. Definir o tamanho desejado (pixel ^ 2) e circularidade (um valor de 1 é um círculo perfeito) intervalos que são suficientes para incluir células/núcleos individuais.
      2. Na caixa de lista suspensa mostrar, selecione as opções desejadas, verificar resumire clique em Okey para obter a contagem de células.

4. análise: Curvas de cinéticas

1. Transferi dados cinéticos a partir do software de leitor de placa para um software de dados analíticos.
2. Para cada condição experimental, média as intensidades de fluorescência das repetições em cada commit, juntamente com o correspondente desvio padrão e erro padrão da média para cada condição experimental.
3. Para cada condição experimental, traçar a curva correspondente-cinética: intensidade de PI (eixo y) versus tempo (eixo x).
4. Para calcular a eficiência de fechamento de uma condição de determinado tratamento, calcular a área sob a curva (AUC) da + LLO em M1 (AUC(M1)) e + LLO em M2 (AUC(M2)). Use a abordagem sugerida abaixo para avaliar a eficiência (E) efectuou:
   
5. Realize uma comparação entre o tratamento de controle e teste, determinando-se o rácio de eficiência (R_FEP) indicado abaixo:
   
   R_EFF = 1, tratamento de teste não tem efeito sobre reparação
   R_FEP < 1, teste tratamento inibe reparação
   R_FEP > 1, teste tratamento melhora a reparação
6. Calcule a área sob a curva utilizando a seguinte equação:
   , onde k é o número total de follow-ups.

Célula, contando com precisão: as células HeLa são usadas frequentemente como uma linha de células de mamíferos do modelo para explorar mecanismos de reparação da membrana. Ao avaliar a reparação da membrana no nível da população de célula, é importante para as células da placa na mesma concentração em todos os poços para interpretação de dados apropriados. Também é importante verificar no momento do ensaio que celulares sejam equivalentes em poços. Células HeLa que expressam constitutivamente histona 2B fundido a GFP (H2B-GFP) foram introduzidas neste ensaio enumerar automaticamente células baseadas sobre a detecção de seus núcleos fluorescentes. Para estabelecer a precisão na enumeração de célula, diluições seriais de células HeLa H2B-GFP foram banhadas em triplicado em uma placa de 96 poços e cultivadas por 4h. Esta quantidade de tempo é suficiente para a fixação da célula e fornece limitada a divisão celular. Completo poços foram fotografados sob luz transmitida (TL) e iluminações de fluorescência de GFP e contagem de células foram avaliadas com base em fluorescência de GFP, usando o software de análise de leitor de placa (Figura 2A e 2B). O contagens de célula média ± desvio padrão foi plotado contra célula semeadura concentrações, e uma linha de melhor ajuste indicou uma relação de 1.08:1 de contagem de célula para célula semeadura, demonstrando a exatidão da contagem (Figura 2). Por imagem-todos os poços antes um ensaio cinético, pode ser assegurado que o número de células é consistente entre todos os poços. Também, por imagem poços após o ensaio cinético, um pode estabelecer se a exposição à toxina causou desprendimento de células.

Expressão de GFP não interfere com medições de intensidade de iodeto (PI) de propidium (IPI): para garantir que a associação nuclear H2B-GFP não interfere com incorporação de PI ou PI fluorescência medida da intensidade iPI, euPI foi comparado em células HeLa e HeLa H2B-GFP que foram expostas, ou não, a 1 nM LLO (Figura 3). Na ausência de PI, havia um similarmente baixo nível de fluorescência de fundo em HeLa e HeLa H2B-GFP, indicando que a GFP não sangram através de filtros de emissão de fluorescência de PI. Na presença de PI, mas a ausência de LLO, houve uma emissão de fluorescência de PI basal semelhante em HeLa e HeLa H2B-GFP que não mudaram ao longo do tempo. Isso confirmou que a expressão de GFP não afeta a medição de fluorescência de PI e indicado que PI não penetra as células danificadas não sobre o frame de tempo do experimento. Adição de LLO resultou em um aumento na fluorescência de PI ao longo do tempo que era semelhante em ambos HeLa e HeLa H2B-GFP. Este aumento é devido à célula ferindo por LLO combinado com associação de PI com ácidos nucleicos. Juntos, estes resultados estabelecem que a expressão de histona-2B-GFP não afeta incorporação de PI ou a medição da sua fluorescência.

Fluorescência de PI não interfere com a contagem de células GFP-baseado: reciprocamente, foi importante verificar que incorporação nuclear de PI em células feridas não interfere com a contagem de células GFP-baseado. Imagens de fluorescência representativa de HeLa e HeLa H2B-GFP exposto a 1 nM LLO na presença de PI mostrou que havia um marcado acúmulo de PI em células feridas post cinética, como esperado (Figura 4A). Imagem latente também revelou que a PI pode sangrar através da detecção de fluorescência de GFP (Figura 4A e tabela 1). Este cruzamento de fluorescência foi melhor apreciado nas imagens pós-cinéticas de células HeLa que não expressam GFP, mas ainda exibido verdes fluorescentes núcleos (Figura 4A). Este cruzamento pode também ser evidenciado a medição da intensidade de fluorescência de GFP (IGFP) em células HeLa H2B-GFP, que aumentaram significativamente pós-cinética comparado ao pre-cinético (Figura 4B). Importante, o cruzamento de fluorescência PI não afeta célula contando porque o processo de segmentação envolvido na enumeração dos núcleos não é afetado por um aumento na fluorescência de GFP (Figura 4).

Membrana plasmática recelagem eficiência de medição: nesta seção, apresentamos a metodologia básica usada para medir a eficiência da membrana de fechamento. Para evidenciar o processo de fechamento de membrana, as células HeLa H2B-GFP foram expostas, ou não, a 1 nM LLO na presença (M1) ou ausência (M2) de extracelular Ca2 + (Figura 5). Como esperado, na ausência de LLO, euPI permaneceu constante em M1 e M2. Adição de LLO em Ca2 +-contendo meio resultou em um aumento constante na intensidade de fluorescência de PI (IPI), Considerando que, na ausência de extracelular Ca2 +, houve um aumento significativamente mais acentuado na fluorescência do PI, refletindo a ausência de membrana de fechamento. Para avaliar a eficiência de fechamento, que é definida como a capacidade de células para reparar em M1 em relação ao M2 (etapa 1.5.4.1), a área sob as curvas de M1 e M2 (AUC) foram determinadas e a eficiência de reparação (E) foi calculada para ser 0,287.

Uma alternativa ao PI: PI tem sido usado ubiquitously como um marcador para danos de membrana plasmática. No entanto, existem outros corantes de ligação de ácido nucleico que também são adequados para este ensaio. Por exemplo, uma ligação de ácido nucleico carbocyanine impermeant membrana tingir (CNABD) exibe um espectro de emissão, atingindo o muito vermelho e tem uma alta especificidade para ADN encalhado dobro. PI, por outro lado vincula tanto DNA e RNA de40,41. Ao contrário de PI, a excitação e espectros de emissão de CNABD não se sobreponha com aqueles de GFP, permitindo melhor resolução espectral entre os dois fluorochromes. Além disso, o CNABD usado no presente protocolo tem um coeficiente de extinção quase duas vezes o de PI, o que significa que para seus comprimentos de onda de excitação respectivos, este corante é mais capaz de absorver a energia do PI, resultando em uma forte emissão de fluorescência. Análise quantitativa da fluorescência de imagens CNABD e GFP mostrou que este corante apresenta uma gama dinâmica grande fluorescência, não emite significativamente em comprimentos de onda da fluorescência de GFP e não afeta a contagem de células (figura 6A-D). Na verdade, células HeLa H2B-GFP incubadas em meios M1 ou M2, contendo CNABD e danificado por 1 nM LLO exibiu um 4 - e 5.5 vezes aumento euCNABD em relação as controles não-danificada, respectivamente (Figura 7A). Para comparação, as células expostas a 1 nM LLO na presença de PI exibiu um aumento de 2,5 - e 3 vezes na intensidade de fluorescência de PI em M1 e M2, respectivamente (Figura 5). Gosto de PI, exposições CNABD, aumentando a intensidade de fluorescência com o aumento da concentração de LLO em M1 (Figura 7A), e a eficiência de reparação resultante foi calculada conforme descrito na etapa 1.5.4.1 (Figura 7B). Informamos que a célula eficiência diminui com o aumento da concentração de LLO de fechamento. Este fenômeno reflete o fato de que células diminuem sua capacidade de selar quando são causados danos excessivos.

Avaliação da qualidade do ensaio do reparo da membrana: um aspecto crítico de qualquer ensaio é sua robustez ou capacidade de detectar e resolver as diferenças entre os controles positivos e negativos. Variação de sinal entre os controles positivos e negativos deve exibir reprodutibilidade e suficiente alcance dinâmico. Neste ensaio de reparo de membrana, os controles positivos e negativos são células expostas a LLO em reparação-permissivo (M1) e condições de reparação-restritivas (M2), respectivamente. Duas abordagens foram levadas para avaliar a robustez deste teste para análise de alta produtividade. Primeiro, o Z-fator ou coeficiente de janela, de triagem determina se um determinado conjunto de condições fornece uma grande suficiente alcance dinâmico, enquanto a contabilidade para a variabilidade do sinal. Z-fatores dentro das escalas 0 < Z ≤ 0,5 e 0,5 < Z ≤ 1 correspondem a um ensaio aceitável e muito boa, respectivamente42,43. Uma limitação do uso do fator de Z para avaliação da qualidade é que condições testadas geralmente apresentam valores mais moderadas em comparação com os controles positivos e negativos extremos. Portanto, como uma segunda abordagem, calculamos a diferença média padronizada estritamente (SSMD, β), que pode identificar as diferenças entre as condições experimentais que caso contrário poderia ser categorizadas como um resultado negativo com base em um fator-Z qualificado44 ,,45. Valores do SSMD podem ser categorizados em força de efeito variando de nenhum efeito (β = 0) extremamente forte (β ≥ 5). Usando os dados da Figura 7A e AUC para comparação de M1 contra condições M2, exposição a 0,25 e 0,5 nM LLO produziu valores de Z-fator de 0.3100813 e 0.137313 e β = 6.0672 e 4.803308, respectivamente, indicando que uma janela de concentrações de LLO é apropriado para o ensaio. Como a concentração de LLO é aumentada além 1 nM, a lacuna no ICNABD curvas cinéticas entre M1 e M2 condições fecha resultando em valores de Z-fator e SSMD drasticamente reduzidos (Figura 7B). Tais concentrações elevadas de LLO correspondem às condições em que o potencial de reparação é compensado pelos danos e, portanto, nega a utilização do ensaio na identificação de fatores envolvidos na reparação da membrana. Isso é ainda mais ilustrado pela diminuição na eficiência de reparação (E) com o aumento da concentração de LLO (Figura 7B). Todos os dados (Z-fator, SSMD e E) foram gerados com 3 repetições biológicas e 3 técnicos Replica por condição experimental para validação do ensaio. Juntos, esses dados mostram que este ensaio tem a robustez esperada para um ensaio de alta produtividade com concentrações de LLO inferiores a 1 nM para as células HeLa.

Prova de princípio: uma vez que a robustez do ensaio foi estabelecida, realizamos experimentos adicionais como uma prova do princípio de que este ensaio tem a sensibilidade e resolução para identificar um defeito no processo de reparação. Além disso, considerou-se que ensaios de alto rendimento são usados como um processo de seleção para identificar "sucessos" dentro de telas grandes, que podem envolver a menos de 3 biológicos Replica. Assim, é pertinente que o delineamento experimental fornece o poder de deteção para identificar "sucessos" dentro de um único ensaio. Portanto, sob uma tela de alta produtividade, o layout do ensaio pode ser ajustado para acomodar 4 repetições de técnicas para aumentar o poder estatístico em uma única experiência. As células foram banhadas em quadriplicado e foram pré-tratados 1h antes do ensaio com desipramina, um inibidor farmacológico da proteína lisossomal ácida sphingomyelinase (ASM), que desempenha um papel na membrana plasmática reparação15,17 ,46. Importante, o tratamento com desipramina não afetou a contagem de células durante o ensaio, permitindo a comparação adequada entre células desipramina-tratados e não tratados (Figura 8A). Inibição de ASM nas células tratadas desipramina resultou em um defeito na membrana recelagem eficiência mediante exposição a LLO, conforme ilustrado pela redução E e RFEP (Figura 8B e 8C). Usando um modelo de efeitos mistos, uma comparação de desipramina-Tratado de células não-tratados, expostas a 0,25 e 0,5 nM LLO em M1 mostrou p-valores de 0.0010 e 1 x 10-10, respectivamente. Juntos, os dados indicam que 0,25 e 0,5 nM LLO são concentrações adequadas para identificar defeitos de reparo em um ajuste experimental de alta produtividade, com possíveis análises estatísticas de uma única experiência, uma vez as técnicas repetições são aumentadas para quatro . Note-se que a abordagem estatística do modelo de efeitos mistos entre quatro exemplares não serão responsáveis para variações de potenciais através de várias réplicas biológicas. Quaisquer conclusões significativas usando um replicar biológico deve ser verificada nas configurações experimentais adicionais.

Figura 1: desenho Experimental. O diagrama de fluxo retrata um design de placa representativa configurado para testar o efeito das sete condições de teste em comparação com células de controle não tratados. Controles adicionais devem ser incluídos, se for o caso, quanto aos veículos de droga de exemplo. As células são banhadas (chapa 1) 24 h antes do experimento. No dia do experimento, células em placa 1 são lavadas com M1 ou M2 médio pré aquecido a 37 ° C, e a placa é imagem (TL, GFP e PI fluorescência) pré-cinéticos. Durante o 15 min de imagiologia, reagentes são adicionados no gelo a placa 2. Depois da imagem latente, placa 1 é imediatamente colocada no gelo por 5 min, e 100 μL/poço são transferidos de placa de 2 para 1 da placa. Placa 1 é colocada no leitor de placa para executar o ensaio cinético a 37 ° C por 30 min, seguido de imagem (fluorescência TL, GFP e PI). Os dados são então analisados para contar células e avaliar a eficiência de reparação em todas as condições experimentais. Em grandes conjuntos de dados, a análise pode ser automatizado. Além disso, o número de repetições de técnicas pode ser aumentado para 4 em telas de alta produtividade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: célula contando precisão. Células HeLa expressando GFP-etiquetado histona 2B foram semeadas em triplica nas concentrações indicadas. (A) células foram fotografadas a 37 ° C, sob luz transmitida (TL) e fluorescência de GFP (12 imagens/poço) e um algoritmo de deteção de celular foi usado para delinear os núcleos individuais (em roxo). Barra de escala = 1 mm. (B) aumento da TL, GFP e célula deteção (roxo) imagens (zoom 2x). Barra de escala = 100 μm. Imagem (C) software de análise foi usado para contar o número de células e a célula contagens foram plotadas contra a inicial célula concentração de semeadura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: medição de fluorescência de iodeto de Propidium não é afectada pela expressão 2B-GFP de histona. Histona 2B-GFP expressando e não-expressando as células HeLa foram expostas, ou não, a 1 nM LLO em presença (linhas sólidas) ou ausência (linhas tracejadas) 30 μm PI em Ca2 +-contendo meio (M1). O ensaio cinético medido as intensidades de fluorescência PI por spectrofluorometry cada 5 min para 30 min a 37 ° C. Dados são a PI fluorescência intensidade média (IPI) expressada em unidades (RFU) de fluorescência relativa ± SEM (n = 3 experimentos independentes, cada um realizado em triplica). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: enumeração de célula não é afetada por fluorescência PI. (A) pré e pós-cinético imagens representativas (TL, PI e GFP) das células expostas, ou não, a 1 nM LLO em M1. Barra de escala = 100 μm. (B) análise de microscopia de fluorescência quantitativa (euGFP± SEM) revelou a medição de fluorescência de GFP aumentada devido à incorporação de nuclear PI sobre célula ferindo por LLO (pós-cinético). Enumeração de células GFP-baseado (C) não foi afetada pelo aumento da intensidade GFP. Contagem de células por poço foi expressos em média ± SEM. (em B e c: preto barras = dados pré-cinéticos; barras vermelhas = dados pós-cinéticos; n = 3 experimentos independentes, cada um realizado em triplica; um bicaudal de t-Student foi usado para analisar quantitativa da fluorescência contagens de intensidade e célula de imagens adquiridas, * * p < 0,01). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: medição membrana plasmática recelagem eficiência. 2B-GFP de histona expressando as pilhas HeLa foram expor, ou não, a 1 nM LLO de Ca2 +-contendo (M1) ou Ca2 +-livre médio (M2), contendo 30 μM PI. Dados cinéticos representam a intensidade de fluorescência de PI (IPI) em fluorescência relativa unidades (RFU) ± SEM, medido por 30 min a 37 ° C. n = 3 experimentos independentes, cada um realizado em triplica. A eficiência de fechamento foi medida conforme indicado na etapa de protocolo 1.5.4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: ligação corante como um corante alternativo para avaliar a membrana de fechamento do ácido nucleico Carbocyanine. Células HeLa H2B-GFP foram expostas, ou não, a 0,5 nM LLO por 30 min a 37 ° C, na presença de 1 μM CNABD de Ca2 +-contendo (M1) ou Ca2 +-livre médio (M2). (A) células de imagens de HeLa H2B-GFP foram adquiridas pré e pós-cinético em M1 contendo o corante. Barra de escala = 100 μm. (B e C) intensidades de fluorescência CNABD integrado e GFP foram medidas usando o citômetro de imagem e expressa em unidades de fluorescência relativo (RFU) ± SEM. imagens de fluorescência de GFP (D) foram processadas para enumerar HeLa H2B-GFP células (preto barras = barras de dados pré-cinéticos, vermelho = dados pós-cinéticos, n = 3 experimentos independentes, cada um realizado em triplica). Um bicaudal de t-Student foi utilizado para analisar a intensidade da fluorescência quantitativa e célula conta de imagens adquiridas, * * p < 0,01, * * * p < 0,001) clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: efeito da concentração de LLO na recelagem eficiência, Z-fator e SSMD. (A) HeLa H2B-GFP células incubadas em M1 ou M2 contendo 1 μM CNABD foram expostas a concentrações crescentes de LLO e submetidas a ensaio cinético por 30 min a 37 ° C. Os dados são expressos como intensidade CNABD (ICNABD) em fluorescência relativa unidades (RFU) ± SEM. (B) o fator Z e diferença média padronizada estritamente (SSMD) foram calculados como uma avaliação de qualidade para a robustez do reparo da membrana ensaio, utilizando a área sob a curva (AUC) como uma métrica para as curvas de cinética42,43,44,45. As eficiências de fechamento foram calculadas conforme descrito nas seções protocolo e resultados (n = 3 experimentos independentes, cada um realizado em triplica). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: exposição de célula a desipramina causa defeitos na recelagem. Células HeLa H2B-GFP (chapeadas em quadriplicado) foram pré-tratadas com 30 desipramina μM (ou não) para 1 h a 37 ° C e em seguida exposto a 0,25 ou 0,5 nM LLO na presença de 1 μM CNABD de Ca2 +-contendo (M1) ou Ca2 +-livre médio (M2). As células foram fotografadas (pré e pós-cinético) e submetido a ensaio cinético a 37 ° C por 30 min. (A) células foram enumeradas; os dados são expressos como célula média contagens ± CNABD SEM. (B) intensidade de fluorescência (ICNABD) é expressa em fluorescência relativa eficiência de SEM. (C) Resealing ± unidades (RFU) foram calculada na presença e na ausência de desipramina. Utilizou-se um modelo de efeitos mistos nos valores de intensidade de registro-transformadas assumindo uma interceptação aleatória para cada técnica replicar. Para capturar um turno de ambos e alterar em forma de curvas de cinética, o principal efeito da condição de tratamento e o efeito de interação entre a condição de tratamento e tempo conjuntamente foram testados para significância estatística. Um bicaudal de t-Student foi usado para analisar a contagem de células de imagens adquiridas. O p-valor foi calculado usando o modelo de efeitos mistos. (4 técnicos Replica, um experimento). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Picos de excitação e emissão de GFP, PI e CNABD, o verde e o vermelho canal bandpasses de excitação e emissão para o citômetro de imagem.

Os autores não têm nada para divulgar.