Questo protocollo descrive la rimozione e la purificazione delle cellule endoteliali dell’arteria polmonare (PAECs) che aderiscono alle punte palloncino del catetere di Swan-Ganz mentre essi sono incuneate in arteria polmonare durante la cateterizzazione del cuore destro e rimanere aderente alla palloncino sgonfio dopo la rimozione dal corpo del paziente.
Una varietà di patologie causare ipertensione polmonare (PH), che è definita come una pressione media dell’arteria polmonare superiore a 25 mmHg a riposo. Per un’ulteriore diagnosi e il gestore di PH, i pazienti subiscono cateterizzazioni ripetute del cuore destro (RHC) in cui un catetere di Swan-Ganz è avanzato in un ramo dell’arteria polmonare e un palloncino viene gonfiato a Cuneo la punta del catetere. Questo articolo illustra un protocollo per cui le cellule endoteliali dell’arteria polmonare (PAECs) potrebbero essere raccolte dalle punte del palloncino del catetere di Swan-Ganz dopo RHC e purificate con una tecnica di colonna di affinità anti-CD146 per purificare PAECs putativi. Queste cellule potrebbero essere utilizzate per fornire un’istantanea in loco dello stato biologico dell’endotelio vasculature polmonare per integrare misure emodinamiche ottenute durante RHC. Raccolte e PAECs purificato può essere utilizzato per una coltura cellulare o per successivi saggi analitici come flusso cytometery.
Attuali linee guida europee e statunitensi richiedono la cateterizzazione del cuore destro per la diagnosi di ipertensione polmonare1. I medici e gli scienziati che cercano di comprendere questa malattia desidero campioni biologici dal sistema vascolare polmonare per integrare i dati emodinamici raccolte durante RHC. Purtroppo, il rischio associato a biopsia vascolare polmonare è molto alto, e di conseguenza campioni biologici del vasculature polmonare sono raramente se mai ottenuti da pazienti viventi sottoposti RHC. Mentre una visione molto è stata acquisita da tessuto vascolare polmonare ottenute da cadaverico o polmoni espiantati, questi campioni sono in grado di riflettere la biologia del processo della malattia di PH, come esso si sta svolgendo in un paziente di vivere. Nel 2013, abbiamo segnalato prima che le cellule endoteliali dell’arteria polmonare (PAECs) sono spogliate dai rami dell’arteria polmonare di contatto fisico con la punta del palloncino del catetere Swan-Ganz durante RHC e possono essere recuperate nei piccoli numeri dalle punte del catetere Dopo la procedura2.
Questo articolo illustra la nostra tecnica per la rimozione e la purificazione delle cellule endoteliali dell’arteria polmonare (PAECs) dalle punte palloncino dei cateteri Swan-Ganz dopo cateterizzazione del cuore destro. Finora, la metodologia per l’esecuzione di questa tecnica di raccolta è stato descritto dettagliatamente nella letteratura per garantire risultati uniformi tra laboratori che eseguono la tecnica insufficiente. Questo articolo è destinato a superare questa carenza, offrendo visualizzati dimostrazione della tecnica, da comodino collezione di punte di catetere al prodotto finale delle cellule endoteliali CD146 + purificate. Questa tecnica dovrebbe aiutare a far progredire la ricerca nel pathobiology di varie eziologie di PH ed eventualmente provocare lo sviluppo di nuovi test diagnostici per integrare dati emodinamici raccolti durante RHC.
L’importanza di questa tecnica nel campo della ricerca e medicina vascolare polmonare è che fornisce l’accesso a uno snapshot della biologia dell’endotelio polmonare in situ e in contrasto con gli studi precedenti sui polmoni espiantati o cadaverici, non rappresenta un endpoint per il polmone del soggetto. Recentemente, abbiamo dimostrato che un biomarcatore di anti-apoptotica in queste cellule può avere utilità in più precisamente phenotyping relative varietà di ipertensione polmonare3. Il rendimento delle cellule ottenute è relativamente piccolo, ~ 5, 000-25.000 PAECs per campione e queste cellule sono difficile (ma non impossibile) alla cultura. Noi crediamo che i ricercatori e i clinici intelligenti troverà sinergie tra queste tecniche compagno per avanzare la ricerca vascolare polmonare, diagnostica e prognostica.
La tecnica descritta in questo articolo è meglio apprezzata nel contesto di precedenti paradigmi sperimentali per studiare l’endotelio vascolare polmonare. Precedenti tentativi di ottenere PAECs da esseri umani sono stati limitati a polmoni espiantati/cadaverico5 e un breve tentativo di sviluppare un catetere in grado di arteria polmonare biopsia6. Come osservato in una recente recensione7, la tecnica attuale si distingue dalla vendemmia del tessuto del polmone dalla sua capacità di ottenere PAECs da una vita umana e di farlo in più punti di tempo nella progressione di malattia e/o terapia. Tuttavia, dovrebbe essere notato che una tecnica di compagno recentemente è stata segnalata per cui indotta da cellule staminali pluripotenti (IPSCs) può essere transdifferentiated in PAECs4,5. Questa tecnica produce abbondanti colture di paziente-specific PAECs e permette di studio degli effetti del background genetico specifico per ogni paziente sulla biologia di CEPA. Nonostante questi vantaggi, questi PAECs IPSC-derivato non può offrire tutte le informazioni sull’interazione tra microambiente locale e background genetico specifico per ogni paziente. Nostro gruppo ha presentato la vista che la “punta di cath” e tecniche di IPSC rischiano di essere sinergici nell’avanzare il campo8.
All’interno di questo contesto attuale e storico, si devono osservare le limitazioni di questa tecnica. In primo luogo, è importante notare che i rendimenti di PAECs derivati da questo metodo possono variare sensibilmente. Presumibilmente, paziente-, malattia medico-specific e stato fattori contribuiscono a questa variabilità, come il protocollo non contiene passaggi che dovrebbe generare ingenti perdite di materiale sorgente. La tabella 1 Mostra rappresentante che CD146 + produce da una varietà di raccolti di CEPA utilizzando punte di catetere ottenute da una varietà di pazienti con diverse patologie di ipertensione polmonare e una varietà di operatori medico. In secondo luogo, i rendimenti delle cellule sono globale bassa, e loro vitalità per la cultura ha dimostrato di essere più basso ancora nelle nostre mani. Mentre in precedenza siamo cresciuti culture di PAECs utilizzando questo metodo1, ci assumiamo tali risultati rappresentano salvataggio di un sottoinsieme delle cellule progenitrici dopo Moria della maggior parte del campione e riesce soltanto a intermittenza nelle nostre mani. Ad esempio, non è insolito da trovare solo qualche dozzina aderente PAECs nella cultura la mattina dopo un raccolto è stato placcato. Spesso queste micro-culture non sopravvivono all’espansione. Ulteriore lavoro è necessario ottimizzare questo protocollo in un modo che sosterrà l’attuabilità di PAECs e le loro condizioni nella cultura per conseguire l’obiettivo desiderato di propagazione di paziente-specific PAEC raccolti. Infine, la selezione positiva CD146 che abbiamo adattato non può escludere la contaminazione con altre cellule CD146 +, ad esempio di fare circolare le cellule endoteliali4, periciti, cellule muscolari lisce e rara CD146 + T cellule9,10. Tuttavia, queste cellule sono presunti per essere molto pochi in numero di campioni raccolti in questo modo, e CD146 è considerevolmente più specifico per questo protocollo di altri marcatori delle cellule delle cellule endoteliali come CD31 (che è anche presente su una varietà di ematica cellule compreso le piastrine11). Eventuali futuri miglioramenti volti a migliorare la specificità devono essere equilibrati contro gli effetti potenzialmente negativi sulla resa.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori vorrebbe ringraziare i medici e il personale del servizio avanzato di scompenso cardiaco e ipertensione polmonare di Allegheny General Hospital di supporto per la fornitura di centinaia di campioni di catetere nel corso degli anni che hanno facilitato la ottimizzazione di questa metodologia.
100mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
Forceps | any | ||
Hemostat | any | ||
LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
PBS | Fisher | BP2438-4 | |
Scissors | any | ||
Syringes | BD | 309597 |