Produção de fibras da matriz extracelular através de cultura de células de membrana de fibra oca Sacrificial
Summary
O objetivo do presente protocolo é a produção de fibras da matriz extracelular toda alvejado para reparação da ferida que são apropriados para avaliação pré-clínicos como parte de um implante de andaime regenerativa. Estas fibras são produzidas pela cultura de fibroblastos nas membranas de fibra oca e extraídas por dissolução das membranas.
Abstract
Andaimes engenharia derivadas da matriz extracelular (ECM) têm conduzido interesse significativo na medicina por seu potencial no diligenciamento encerramento e cura feridas. Extração de matriz extracelular de fibrogênicos célula culturas em vitro tem potencial para geração de ECM de linhas de células humanas – e potencialmente específicas do paciente, minimizando a presença de xenogénicas epítopos que tem dificultado o clínico sucesso de alguns produtos de ECM existentes. Um desafio significativo na produção em vitro de ECM adequado para implantação é que a produção de ECM por cultura de células é tipicamente de rendimento relativamente baixo. Neste trabalho, os protocolos são descritos para a produção de ECM por células cultivadas dentro de andaimes de membrana de fibra oca sacrificial. Membranas de fibra oca são cultivadas com linhas de células de fibroblastos em um meio de celular convencional e dissolvidas após a cultura de células para produzir fios contínuos de ECM. As fibras de ECM resultantes produzidas por este método podem ser decellularized e liofilizadas, tornando-o adequado para o armazenamento e a implantação.
Introduction
Andaimes cirúrgicos implantáveis são um dispositivo elétrico de reparação da ferida, com mais 1 milhão malhas de polímero sintético, implantado em todo o mundo anualmente para parede abdominal reparação só1. No entanto, após a implantação, os polímeros de materiais sintéticos tradicionalmente usados na fabricação destes andaimes tende a provocar uma reacção de corpo estranho, resultando em inflamação deletéria para a função do implante e cicatrização do tecido2 . Além disso, como os materiais predominantes de malha sintética (ou seja, polipropileno) não são sensivelmente remodelados pelo corpo, que são geralmente aplicáveis aos tecidos onde a cicatriz pode ser tolerada, limitando sua utilidade clínica para o tratamento de tecidos com função de ordem superior, como os músculos. Embora existam muitos produtos do engranzamento cirúrgico que tem sido aplicados com sucesso clínico, fabricante recente recorda sintético cirúrgico malhas e complicações de implantes de tecido interespécies destacam a importância da maximização do implante biocompatibilidade, solicitando que o FDA para apertar a regulamentação sobre cirúrgica malha fabricantes3,4. Implantação de andaimes derivadas de tecidos dos pacientes reduz esta resposta imune, mas pode resultar em doador-site significativa morbidade5. Matriz extracelular (ECM) andaimes produzidos em vitro são uma alternativa possível, como andaimes de ECM decellularized apresentam excelente biocompatibilidade, particularmente no caso de ECM autólogo implantes6.
Devido a limitada disponibilidade de tecido doente para colher para implante autólogo e o risco de impedir a função no local doador, a capacidade de produzir ECM moldes em vitro da cultura de linhagens celulares humanas ou, se possível, um paciente próprias células é uma alternativa atraente. Os principais desafios na produção de quantidades substanciais de ECM em vitro é o sequestro destas moléculas de difícil-para-captura. Em trabalho anterior, demonstrámos que ECM pode ser produzido pelo cultivo de fibroblastos secretoras de ECM em espumas poliméricas sacrificiais que dissolvem-se após o período da cultura de ECM de rendimento que pode ser decellularized para implantação7, 8,9,10. Como ECM produzido em espumas tendem a adotar a arquitetura interna das espumas, membranas de fibra oca (HFMs) foram exploradas como um andaime sacrificial para a produção de fios de ECM. Aqui descritos são métodos encarregados para laboratório escala fabricação de membranas de fibra oca de qualidade de cultura de pilha e a extração das fibras de matriz extracelular em massa do mesmo após um período de cultura de fibroblastos. Esta abordagem de cultura estático é facilmente adoptável por laboratórios contendo equipamentos de cultura de células de mamíferos padrão. ECM produzido por esta abordagem poderia ser aplicada em direção a uma variedade de aplicações clínicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os processos descritos permitem a produção de massa ECM biomateriais em vitro usando membranas de fibra oca, convertida por um sistema de jato seco molhado fiação, permitindo a produção em massa de baixo custo de membranas, bem como equipamentos de cultura de célula padrão. Enquanto as membranas fabricadas neste protocolo destinam-se a utilização em cultura celular, o sistema descrito também pode ser adaptado para a produção de membranas para fins de separação, com poros distribuição e oco fibra…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de artrite e osteomuscular e doenças de pele do institutos nacionais da saúde sob número do prêmio R15AR064481, National Science Foundation (CMMI-1404716), bem como a Instituto de Biociências de Arkansas.
Materials
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable – VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass – Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes – VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device – Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
Referências
- Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
- Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
- Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
- . . FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).
- Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
- Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
- Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
- Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
- Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
- Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
- Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
- Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
- Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
- Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. . Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).
