Method Article

Modelo de cocultura sem contato para o estudo da ativação de células imunes inatas durante a infecção por vírus respiratório

DOI:

10.3791/62115

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February 28th, 2021

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1Department of Otolaryngology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Haartman Institute, Medicum, University of Helsinki, 4Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National University Hospital, National University Health System, 5Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore Immunology Network (SIgN), 6NUHS Infectious Diseases Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalha uma investigação das interações iniciais entre células epiteliais nasais infectadas viralmente e ativação celular inata. Subconjuntos individuais de células imunes podem ser distinguidos com base em sua ativação em resposta a infecções virais. Eles podem então ser investigados para determinar seus efeitos sobre as respostas antivirais precoces.

Abstract

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As interações precoces entre a camada epitelial nasal e as células imunes inatas durante infecções virais permanecem uma área pouco explorada. A significância da sinalização de imunidade inata em infecções virais aumentou substancialmente à medida que pacientes com infecções respiratórias que apresentam alta ativação de células T inatas mostram um melhor desfecho da doença. Assim, dissecar essas interações imunológicas inatas precoces permite a elucidação dos processos que os regem e pode facilitar o desenvolvimento de potenciais alvos terapêuticos e estratégias para amortecer ou mesmo prevenir a progressão precoce de infecções virais. Este protocolo detalha um modelo versátil que pode ser usado para estudar o crosstalk precoce, interações e ativação de células imunes inatas a partir de fatores secretados por células epiteliais viralmente infectadas pelas vias aéreas. Utilizando um vírus de influenza H3N2 (A/Aichi/2/1968) como modelo representativo do vírus, a ativação celular inata de células mononucleares periféricas co-cultivadas (PBMCs) foi analisada usando citometria de fluxo para investigar os subconjuntos das células que são ativadas pelos fatores solúveis liberados do epitélio em resposta à infecção viral. Os resultados demonstram a estratégia de diferenciação dos subconjuntos das células e revelam as diferenças claras entre as populações ativadas de PBMCs e seu crosstalk com o controle e epitélio infectado. Os subconjuntos ativados podem então ser analisados para determinar suas funções, bem como alterações moleculares específicas das células. Os achados de tal investigação de crosstalk podem descobrir fatores importantes para a ativação de populações celulares inatas vitais, que são benéficas no controle e na supressão da progressão da infecção viral. Além disso, esses fatores podem ser universalmente aplicados a diferentes doenças virais, especialmente em vírus recém-emergentes, para amortecer o impacto desses vírus quando circulam pela primeira vez em populações humanas ingênuas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os vírus respiratórios estão talvez entre os patógenos mais difundidos que causam cuidados de saúde graves e carga econômica. Desde os surtos globais periódicos de cepas epidêmicas emergentes (por exemplo, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) até as cepas sazonais da gripe todos os anos, os vírus são uma ameaça constante à saúde pública. Embora as vacinas formem a maior parte da resposta a esses desafios globais de saúde pública, é preocupante notar que essas contramedidas sãomeramente responsivas 1,2. Além disso, um atraso entre o surgimento de uma nova cepa infecciosa e o desenvolvimento bem-sucedido de sua vacina é inevitável3, levando a um período em que as medidas disponíveis para conter a propagação do vírus são altamente limitadas.

Esses atrasos são ainda mais enfatizados pelos custos que são infligidos à sociedade economicamente e socialmente. Só a gripe sazonal é responsável por aproximadamente US$ 8 bilhões em custos indiretos, US$ 3,2 bilhões em custos médicos e 36,3 mil mortes nos Estados Unidos da América anualmente4. Isso é antes da consideração dos custos de pesquisa necessários para financiar o desenvolvimento de vacinas. Surtos epidêmicos têm efeitos ainda mais graves na sociedade, agravados pelo aumento da taxa de globalização a cada ano, como evidenciado pelas perturbações globais causadas pelo surgimento e rápida disseminação da síndrome respiratória aguda grave coronovírus 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.

Estudos recentes têm mostrado que pacientes infectados com maior população de células T inatas ativadas tendem a ter um melhor desfecho da doença 8,9,10. Além disso, a população de células T inatas é categorizada em múltiplos subgrupos: as células invariantes associadas à mucosa T (MAIT), células Vδ1 γδ T, células Vδ2 γδ T e as células T (NKT) assassinas naturais. Esses subgrupos de células T inatas também apresentam heterogeneidade dentro de suas populações, aumentando a complexidade das interações entre as populações celulares envolvidas na resposta imune inata11. Assim, o mecanismo que ativa essas células T inatas e o conhecimento dos subgrupos específicos de células T inatas podem fornecer uma via diferente de pesquisa para reduzir os efeitos infecciosos desses vírus no hospedeiro humano, especialmente durante o período de desenvolvimento vacinal.

As células epiteliais infectadas pela gripe produzem fatores que ativam rapidamenteas células T inatas 12,13,14. Com base nessa descoberta, este modelo de co-cultura de Interface Ar-Líquido (ALI) sem contato tem como objetivo imitar as interações químicas iniciais (mediadas por fatores solúveis liberados pela camada epitelial infectada) entre a camada epitelial nasal infectada e os PBMCs durante a infecção precoce. A separação física entre a camada epitelial nasal (cultivada nas pastilhas de membrana) e os PBMCs (na câmara inferior) e a integridade epitelial previne a infecção direta dos PBMCs pelo vírus, permitindo um estudo detalhado dos efeitos dos fatores solúveis derivados da epitelial nos PBMCs. Os fatores identificados podem, portanto, ser investigados por seu potencial terapêutico em induzir a população de células T inatas apropriadas que possam proteger contra a infecção por gripe. Este artigo, portanto, detalhou os métodos de estabelecer uma cocultura para o estudo da ativação inata de células T a partir de fatores solúveis derivados do epitélio.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Consulte a Tabela 1 para receitas de mídia utilizadas neste protocolo.
NOTA: o hNECS cultivado em transwell de 12 poços foi encontrado para crescer em espessura mais ideal para fatores solúveis para chegar à câmara basal prontamente quando infectados com o vírus influenza. Por isso, recomenda-se o uso de transwell de 12 bem dimensionados para a cocultura.

1. Estabelecimento da camada alimentador 3T3

  1. Estabelecimento de estoques congelados
    1. Descongele um criovial de fibroblastos NIH/3T3 de estoques congelados. Adicione o conteúdo do criovial a 2 mL de DMEM (Minimal Essential Media, mídia essencial mínima) da Dulbecco e resuspenque as células.
    2. Centrifugar por 5 min a 300 × g e temperatura ambiente/pressão (rtp), e remover o sobrenatante. Resuspenda as células em DMEM completo.
    3. Conte as células usando manchas azuis de tripano. Adicione 10 μL de trippan azul a 10 μL da suspensão da célula resuspended. Misture bem e adicione 10 μL da suspensão a um hemótmetro para contar as células.
    4. Células de sementes a uma densidade de 1 × 104 células/cm2 em um prato de cultura apropriado (por exemplo, frasco T75). Incubar o frasco de cultura resultante por 3 dias a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5%.
  2. Tratamento mitomicina C
    1. Aos 3 dias, certifique-se de que a confluência seja de 60%-80%, remova o meio e lave as células com soro fisiológico tamponado de fosfato 1x (PBS).
      NOTA: É importante que a camada de alimentador 3T3 não atinja a confluência total; caso contrário, o tratamento mitomicina C não será eficaz.
    2. Adicione dMEM completo suplementado por mitomicina C ao frasco e incubar por 3,5 h a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5%. Remova o meio contendo mitomicina C e lave as células 2x com 1x PBS.
  3. Semeadura de células 3T3 em placas de 6 poços
    1. Adicione 3 mL de 1x trypsin-EDTA ao frasco por 3-5 min para desassociar as células. Colete as células dissociadas em um tubo fresco de 15 mL. Centrifugar o tubo de 15 mL por 5 min a 300 × g, rtp; descartar o supernatante. Resuspenda as células em DMEM completo.
    2. Conte as células usando manchas azuis de tripano. Semente as células em uma placa de 6 poços a 7,5 × 10 5-2,5 × 106 células/bem. Incubar a placa durante a noite a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2.
      NOTA: A camada de alimentador 3T3 é considerada pronta se as células estiverem saudáveis. Neste ponto, semeou as células-tronco/progenitoras epiteliais nasais humanas (hNESPCs) na camada alimentadora para expansão.
    3. Adicione DMEM completo ao frasco e incubar a 37°C, 5% DE CO2 durante a noite para as células 3T3 se recuperarem do tratamento mitomicina C.

2. Estabelecimento da cultura da célula epitelial nasal humana (hNEC)

NOTA: As amostras clínicas devem ser obtidas de pacientes livres de sintomas de infecção do trato respiratório superior.

  1. Processamento de tecido nasal em suspensão unicelular
    1. Lave o tecido nasal no PBS (dPBS) de Dulbecco (PBS) (PBS sem Mg2+ e Ca2+) contendo 100 μL/mL de uma mistura antibiótico-antimíctico. Corte o tecido em pequenos fragmentos e trate a amostra em 10 mg/mL de uma protease neutra durante a noite a 4 °C com agitação.
    2. Centrifugar por 5 min a 200 × g, e remover o sobrenatante após centrifugação. Incubar a pelota em 1-2 mL de 1x trypsin-EDTA (37 °C, 15 min), e saciar adicionando um volume de soro bovino fetal igual a 10% do volume no tubo.
    3. Dissociar mecanicamente o tecido digerido em agregados unicelulares por pipetação, e então passar a suspensão resultante através de um coador de células de 70 μm. Resuspenda as células em DMEM completo.
      NOTA: Após esta etapa, a suspensão celular é uma mistura de células terminais diferenciadas e células-tronco que são referidas como células-tronco/progenitoras nasais humanas (hNESPCs). O objetivo das etapas subsequentes é selecionar e enriquecer a população do HNESPC a partir da mistura de diferentes populações celulares.
  2. Semeadura de uma suspensão de célula única na camada alimentador 3T3 para seleção de hNESPCs
    1. Centrifugar a suspensão celular da etapa 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp), e remover o sobrenante. Resuspense as células em 3-5 mL de média 3.
      NOTA: O Medium 3 é formulado para promover o crescimento seletivo dos hNESPCs.
    2. Conte as células através de coloração azul trypan. Semente 1 x 106 células em 2mL de média 3 por poço em placa de 6 poços contendo camada de alimentador 3T3 preparada após a remoção da mídia na placa de 6 poços. Incubar a cocultura resultante a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5%.
      NOTA: Após a semeadura, tome cuidado para não agitar a placa, pois ela afetará a fixação dos hNESPCs.
    3. Troque o médio 3 (2 mL) a cada 2-4 dias, removendo o médio antigo inteiramente e substituindo-o por meio fresco 3.
      NOTA: O médio é alterado para repor nutrientes e para evitar que condições excessivamente ácidas influenciem negativamente o crescimento dos hNESPCs. O intervalo entre cada mudança média depende de quão ácido (amarelo) o meio se torna. Os intervalos devem ser encurtados se o meio se tornar ácido rapidamente.
    4. Após 7-10 dias, observe que os hNESPCs estão em uma confluência adequada para transferi-los para as pastilhas de membrana. Consulte a Figura 1 para morfologia representativa de hNESPCs em 3 horários diferentes (2 dias, 5 dias e 10 dias).
  3. Transferência de hNESPCs para pastilhas de membrana
    NOTA: Devido ao tratamento da mitomicina C, a camada alimentador 3T3 se degradará lentamente durante o período de expansão do hNESPC. Isso resultará em uma adesão enfraquecida à superfície do poço, permitindo seu desalojamento lavando-se com uma pipeta, deixando para trás apenas os hNESPCs saudáveis.
    1. Retire o meio e adicione 500 μL de 1x dPBS a cada poço. Lave as células 3x com uma micropipette para desalojar as células 3T3 e descartar o 1x dPBS. Observe sob o microscópio que os hNESPCs redondos permanecem enquanto a camada alimentador 3T3 em forma de fuso é desalojada.
    2. Adicione 500 μL de um reagente de dissociação celular por poço, e incubar a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5% por 5-10 min, ou até que os hNESPCs tenham se destacado da superfície do poço.
    3. Colete a suspensão hNESPC, centrífuga (300 × g, 5 min, rtp) e remova o supernaspeso.
    4. Resuspenda a pelota em média 3. Conte as células através de coloração azul trypan. Semente 3 × 104 células em 150 μL de inserção média 3 por membrana (placa de 24 poços) ou 1 × 105 células em 300 μL de média 3 por inserção de membrana (placa de 12 poços) (Figura 2). Incubar as células a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 .
    5. Troque o médio (médio 3) das câmaras apical e basal a cada 2 dias. Navegue por uma ponta de pipeta entre os braços de suporte da pastilha de membrana para acessar a câmara basal, remova o meio antigo e, em seguida, reintroduza o meio fresco pelo mesmo método. Embora a câmara apical seja facilmente acessível, tome cuidado para não perturbar a crescente camada hNESPC.
      NOTA: Não perturbe o meio na câmara apical por pelo menos 2 dias após a semeadura, pois as células precisam de tempo para se prender à membrana.
  4. Diferenciação dos hNESPCs em hNECs
    1. Quando os hNESPCs atingem 100% de confluência (aproximadamente 3-7 dias a partir da semeadura na pastilha da membrana), inicie a cultura ALI. Altere o meio basal para o meio de diferenciação e remova o meio da câmara apical. Basta adicionar meio à câmara basal sem adicioná-la à câmara apical ao alterar o meio a cada 2-3 dias, conforme indicado na Figura 3 e etapa 2.3.5.
      NOTA: O meio é alterado para meio de diferenciação para promover a diferenciação dos hNESPCs em hNECs em ALI. Os hNESPCs levam aproximadamente 3-4 semanas para atingir a maturidade total para se tornarem hNECs em ALI, momento em que as células teriam se tornado uma multicamadas com diferentes populações de células em cada camada. Cília também deve ser observada em uma ampliação de 400x (cílio pode ser identificado pelo seu movimento de espancamento, o que faz com que o campo de microscópio pareça estar vibrando). Neste ponto, as células estão prontas para serem usadas para os experimentos de co-cultura. Consulte a Figura 4 para obter a seção transversal de uma camada hNEC totalmente diferenciada.
    2. Depois de obter hNECs maduros, lave as células na câmara apical 3x com 1x dPBS em intervalos de 2-3 dias durante uma semana antes do experimento de cocultura. Sinergize a etapa de lavagem com as alterações do meio basal e realize as lavagens da seguinte forma.
      1. Adicione 50 μL (24-bem)/150 μL (12-bem) de 1x dPBS na câmara apical da inserção da membrana e incubar as células a 37 °C por 10 min. Remova o dPBS após 10 minutos de incubação para remover muco acumulado e células mortas ao longo da diferenciação.
        NOTA: Dependendo da natureza do experimento, a solução de bicarbonato de sódio pode ser usada para lavar totalmente a camada de muco. No entanto, para infecção viral em experimentos de cocultura, a camada de muco é retida, e apenas o excesso de muco é removido com lavagem dPBS. Esta retenção é para imitar a camada fisiológica do muco presente na epitélia nasal que vai interagir com a infecção viral que se entrada.

3. Medição da resistência elétrica transeptelial (TEER)

NOTA: A confirmação da integridade epitelial é importante para garantir que uma camada epitelial intacta e saudável seja obtida. Uma camada epitelial intacta é determinada através da medição teer realizada em 4 poços aleatórios usando um voltohmômetro.

  1. Enxágüe o eletrodo com 70% de etanol e esterilize-o com luz ultravioleta por 15 minutos antes de usar para garantir a esterilidade. Enxágüe com 1x dPBS após a esterilização.
  2. Adicione 100 μL (para 24-bem) ou 300 μL (para 12-bem) de 1x dPBS à câmara apical da inserção da membrana. Incubar a placa a 37 °C por 10 min; em seguida, remova o dPBS.
  3. Para cada poço a ser medido, prepare um bem nãoutilado com 1 mL (para 24-bem) ou 3 mL (para 12-bem) de meio de diferenciação pré-equipado (a 37 °C). Coloque a inserção de membrana no poço preparado e adicione 200 μL (para 24-bem) ou 600 μL (para 12-bem) de meio de diferenciação pré-armado à câmara apical. Equilibre a 37 °C (sujeito à temperatura de incubação do tipo de vírus adicionado, por exemplo, 35 °C para Influenza) por 15 min.
    NOTA: Prepare um branco (inserção de membrana vazia) da mesma forma para o cálculo do TEER.
  4. Equilibre um tubo de 15 mL de meio de diferenciação pré-armado na mesma temperatura por 15 min também. Coloque os eletrodos no tubo de 15 mL e ligue o voltohmômetro.
    NOTA: Neste ponto, a leitura deve ser de 0 resistência, pois os eletrodos estão no mesmo meio. Se alguma outra leitura for obtida, equilibre o eletrodo no tubo de 15 mL até que a leitura seja 0.
  5. A partir do espaço em branco, posicione os eletrodos em cada poço de tal forma que um eletrodo esteja submerso no meio da câmara apical e o outro no meio da câmara basal. Registo a leitura somente quando uma leitura constante é obtida por um período de pelo menos 5 minutos.
  6. Após cada medição, lave o eletrodo com PBS antes da próxima medição. Para cada poço testado, faça medições para três amostras em diferentes posições da membrana. Para calcular o TEER líquido de cada amostra, subtraia a resistência de fundo, dada pela inserção da membrana em branco, a partir de cada medição.
  7. Calcule a leitura total do TEER para um poço usando a seguinte equação:
    Integridade Epitelial (Ωcm2) = Net TEER(ohms) × Área da membrana (cm2)
    NOTA: Os valores teer de hNECs para experimentos de infecção viral devem ser >1000 Ωcm2 13,15,16. 

4. Isolamento de monócitos sanguíneos periféricos e células NK

NOTA: As amostras de sangue devem ser obtidas de voluntários saudáveis e usadas no mesmo dia do isolamento.

  1. Coletar 30-40 mL de sangue inteiro de cada doador em tubos de coleta de sangue de 10 mL.
  2. Isole os PBMCs usando centrifugação de gradiente de densidade e obtenha PBMCs da camada buffy após os passos seguintes (veja também a Tabela de Materiais).
    1. Misture completamente ~10 mL de sangue do tubo de coleta de sangue em um vacutainer antes de diluir com um volume igual de solução de sal balanceada (PBS).
    2. Adicione 15 mL de gradiente de densidade médio à base de um tubo de 50 mL.
      NOTA: A razão entre o gradiente de densidade e o sangue diluído devem ser de 2:3-3.5.
    3. Camada 35 mL de sangue diluído no meio gradiente de densidade com uma pistola pipeta (com a configuração de dispensa definida para o mais baixo possível) inclinando o tubo em 45° e permitindo que o sangue diluído caia de forma gota na parede interna do tubo para que a camada de gradiente de densidade não seja perturbada.
    4. Centrifugar lysate a 500 × g, 18-20 °C por 30 min (freio: desligado). Remova e descarte cuidadosamente a camada de plasma superior sem perturbar a camada inferior.
    5. Transfira a camada de buffy para um novo tubo sem misturar a camada de glóbulos vermelhos, a camada média de densidade gradiente ou a camada buffy. Uma vez que o casaco buffy tenha sido coletado em um novo tubo de 50 mL, cubra o volume para 50 mL com 1x PBS.
    6. Centrifugar lysate a 800 × g, 18-20 °C, 8 min (freio: desligado) e remover o sobrenatante com uma arma de pipeta. Resuspenque a pelota celular com 50 mL de 1x PBS, e centrífuga a 120 × g, 18-20 °C, 10 min para remover plaquetas.
    7. Descarte o supernatante por pipetação, sem perturbar a pelota celular.
      NOTA: Como a pelota de célula pode estar solta, é desaconselhável descartar o supernatante derramando.
    8. Resuspend a pelota celular com meio RPMI completo (Roswell Park Memorial Institute). Realize uma contagem celular adicionando 10 μL de ácido acético de 3% com azul de metileno a 10 μL da suspensão celular resuspended. Misture bem e adicione 10 μL da mistura a um hemótmetro para contar as células.
  3. PBMCs diluídos com meio RPMI completo a uma densidade de 2 × 106/mL (para 24-bem) ou 4 × 106/mL (para 12-bem).

5. hNEC Infecção viral e transição para hNEC:PBMC co-cultura

NOTA: H3N2 (A/Aichi/2/1968) é usado como a cepa representativa da infecção neste protocolo. A multiplicidade de infecção (MOI) de 0.1 é utilizada como moi representativa neste protocolo.

  1. Dia 0 (Infecção de hNECs)
    NOTA: Um poço dos hNECs cultivados a partir do mesmo doador é usado para obter uma contagem de células representativa para cada bem utilizado no experimento.
    1. No bem representativo, adicione 150 μL de 1x trypsin-EDTA à câmara apical da inserção da membrana e 350 μL de 1x trypsin-EDTA à câmara basal, e incubar a 37 °C por 10 minutos, ou até que as células se desprendem da membrana.
    2. Lave as células na membrana tubondo para cima e para baixo, e colete a suspensão em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Adicione 200 μL de DMEM completo para saciar a atividade de trypsin. Conte células através de coloração azul trypan para obter a contagem de células por poço.
    3. Calcule o MOI necessário do vírus com base na contagem de células por poço, e dilua o estoque do vírus de acordo com o RPMI completo no gelo.
      NOTA: MOI 0.1 de 1,26 × 106 hNECs por poço = 1,26 × 105 H3N2 partículas virais por poço em 30 μL (para 24-well)/100 μL (para 12-bem)
    4. Para os demais poços para o experimento de infecção, adicione 50 μL (para 24-bem)/150 μL (para 12-bem) de 1x dPBS nas câmaras apical das pastilhas de membrana, incubar a 37 °C por 10 minutos e remover o 1x dPBS.
    5. Altere o meio basal nas pastilhas de membrana para completar o meio RPMI transferindo as pastilhas para uma nova placa com RPMI completo adicionado aos poços (350 μL (para 24-bem)/700 μL (para 12-bem)).
      NOTA: Quando os hNESPCs têm totalmente diferenciado para os hNECs, eles são tolerantes/permissivos a diferentes mídias por até 72 h, sem alterações na morfologia ou organização quando o meio é trocado para RPMI12. O RPMI é usado para apoiar o crescimento e manutenção da população do PBMC.
    6. Adicione o inóculo preparado de 30 μL (para 24-bem)/100 μL (para 12-bem) do inóculo do vírus na câmara apical da inserção da membrana, incubar a 35 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 1 h, e remover o inóculo viral da câmara apical.
    7. Mude o meio basal da inserção de membrana para meio RPMI completo fresco e incubar para 35 °C em uma atmosfera de CO2 de 5% por 24 h.
  2. Dia 1 (estabelecimento de hNECs + CO-cultura PBMCs)
    1. Semente o número necessário de PBMCs em 150 μL (para 24-well)/300 μL (para 12-bem) de meio RPMI completo adicionando diretamente a suspensão PBMC na câmara basal de cada poço de hNECs não infectados ou infectados a partir do dia 0 (1,5 × 106 para placas de 24 poços e 3 × 106 para placas de 12 poços). Incubar a 37 °C por 24/48 h.
      NOTA: O volume final na câmara basal após a criação da cocultura é de 500 μL (para 24-well)/1000 μL (para 12-well).
  3. Dias 2-3 (colheita de PBMCs 48/72 h infecção pós-viral)
    1. Coleta de supernantes apical (infecção pós-viral de 48/72 h)
      1. Adicione 50 μL (para 24-bem)/150 μL (para 12-bem) de 1x dPBS em cada câmara apical, e incubar a 37 °C por 10 min. Colete o 1x dPBS em tubos de 1,5 mL. Aliquot 25 μL (para 24-well)/50 μL (para 12-well) do supernasal para ensaio de placa em um novo tubo de 1,5 mL, e congele imediatamente tanto o estoque quanto as alíquotas a -80 °C.
    2. Coleta de RNA celular de hNECs (infecção pós-viral de 48/72 h)
      1. Transfira a inserção da membrana para um poço limpo, adicione 300 μL (para 24-bem)/600 μL (para 12-bem) de tampão de RNA para a câmara apical e incubar na rtp por 5 min. Colete o supernante em um tubo de centrífuga de 1,5 mL e armazene-o a -80 °C até a extração de RNA para análise molecular.
    3. Colheita de PBMCs (infecção pós-viral de 48/72 h)
      1. Com a base ampla de uma ponta de pipeta estéril, raspe suavemente a superfície do poço para desalojar os PBMCs ativados que podem ser aderentes à superfície do poço. Colete o meio basal contendo PBMCs em um tubo de centrífuga de 2 mL.
      2. Lave os poços 2x com 300 μL de 1x dPBS, e colete a lavagem no mesmo tubo de 2 mL. Centrifugar o tubo de 2 mL (500 × g, 5 min, rtp), e coletar o supernatante em um tubo fresco de 2 mL sem perturbar a pelota celular. Armazene o supernatante a -80 °C para análise de citocina e quimioterapia; resuspensar a pelota de célula em 200 μL de 1x dPBS.

6. Citometria de fluxo

NOTA: Esta seção do protocolo é continuada diretamente da seção anterior usando a suspensão da célula PBMC da etapa 5.3.3.2. Certifique-se de exposição mínima à luz durante as seguintes etapas nesta seção. Um painel de amostra de marcadores de coloração de superfície pode ser encontrado na Tabela 2.

  1. Coloração de superfície
    1. Transfira a cápsula de célula PBMC resuspended para uma placa de fundo de 96 V. Centrifugar lysate a 800 × g por 3 min, e remover o sobrenante.
    2. Incubar todos os PBMCs (exceto os "não manchados") com 100 μL de uma mancha de viabilidade por 15 min no rtp. Cubra até 200 μL com 150 μL de buffer MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting, classificação celular ativada magnética). Centrifugar lysate a 800 × g por 3 min, e descartar o sobrenante.
    3. Prepare um painel de anticorpos de coloração superficial de interesse com razões de diluição apropriadas e um volume final de 50 μL por reação (retoco com tampão MACS para obter o volume final). Realize a coloração da superfície adicionando 50 μL da mistura de anticorpos preparados às células usando uma pipeta multicanal. Incubar a 4 °C por 15 min no escuro.
    4. Lave adicionando 150 μL de buffer MACS. Centrifugar lysate a 800 × g por 3 min, e descartar o supernasce. Se não for necessária a coloração intracelular, proceda diretamente à incubação de 15 min na etapa 6.3.
  2. Coloração intracelular (se necessário)
    1. Adicione 100 μL de uma solução de fixação e permeabilização a cada poço. Incubar a 4 °C por 20 min no escuro. Cubra os poços com 100 μL de 1x tampão MACS.
    2. Centrífuga (800 × g, 3 min, 25 °C), e remova o sobrenante. Repita a lavagem adicionando 200 μL de 1x tampão de lavagem de permeabilização. Centrífuga (500 × g, 3 min, 25 °C), e remova o sobrenatante.
    3. Prepare as diluições para o painel de anticorpos de interesse para obter um volume final de 50 μL usando 1x tampão de lavagem de permeabilização. Incubar no gelo por 30 minutos no escuro. Adicione 200 μL de 1x tampão de lavagem de permeabilização.
    4. Centrifugar as células (800 × g, 3 min, 4 °C) e remover o sobrenante. Resuspenque as células em 100 μL de tampão de classificação celular ativado pela fluorescência.
  3. Pipette 200 μL de uma solução de lise em cada poço. Incubar por 15 min na RTP. Centrifugar lysate a 800 × g por 3 min e descartar o sobrenante.
  4. Resuspense as pelotas de célula em 200 μL de buffer MACS. Realize a citometria de fluxo de acordo com as configurações descritas anteriormente13, ou armazene a 4 °C no escuro.

7. Determinação dos níveis de citocina e quimiocina

  1. Processe 25 μL do supernasciente da câmara basal usando um ensaio multiplex de imunologia de acordo com o protocolo18 do fabricante.
  2. Calcule a concentração de cada analito usando o software multiplex manager utilizando um algoritmo de ajuste de curva (5 parâmetros) para a curva padrão.

8. Avaliação da contaminação viral

  1. Extrair RNA viral utilizando um kit de extração em 4 conjuntos de soluções: a solução de estoque H3N2, a diluição MOI 0.1 para infecção, as diluições seriais de 10x do MOI 0.1 e o meio basal das amostras (48 e 72 h pós-infecção viral)12.
  2. Selecione gene não estrutural (NS1) e matriz (M1) como alvos para reação em cadeia de polimerase (PCR) (ver a Tabela de Materiais para primers usados no experimento representativo).
  3. Realize a transcrição reversa-PCR (RT-PCR) (42 °C, 60 min) para converter o RNA viral em cDNA antes de realizar pcr quantitativo (qPCR) para medir os níveis NS1 e M1 como um proxy para presença viral, e correlacionar os níveis à curva padrão obtida da RT-qPCR realizada na diluição serial de 10x do MOI 0.1 alit. Consulte a Tabela 3 para a composição das misturas de reação e utilize as seguintes condições: pré-insubtação a 95 °C por 10 min, seguida de amplificação de 3 etapas para 40 ciclos: 95 °C para 10 s, 60 °C para 10 s, 72 °C para 30 s; curva de fusão: 95 °C para 10 s, 65°C para 60 s e 97°C para 1 s.

9. Ensaio de placa

  1. Dia 0: semeadura MDCK (Madin Darby Canine Kidney) em placas de 24 poços
    1. Remova o meio de um frasco T75 de células MDCK confluentes. Lave 2x com 1x PBS para remover todos os traços de soro. Trypsinize as células MDCK adicionando 10 mL de trippsina e incubando a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 20-30 min até que as células se desprendem.
      NOTA: Não toque no frasco, pois isso pode resultar em aglomeração.
    2. Pipete a suspensão da célula em um tubo de 15 mL contendo 2 mL de Meio Essencial Mínimo (EMEM) completo da Eagle. Centrífuga (300 × g, 5 min, rtp), e remova o supernante.
    3. Resuspende as células em 6 mL de EMEM completo. Conte as células por manchas azuis.
    4. Diluir a suspensão da célula MDCK a uma concentração de 1 × 105 células/mL, e sementes 1 mL da suspensão diluída em cada poço de uma placa estéril de 24 poços. Incubar a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5% por 24 horas para obter uma monocamada confluente de células MDCK em cada poço.
  2. Dia 1: infecção de células MDCK
    1. Prepare o meio de infecção. Retire o meio da monocamhada MDCK na placa de 24 poços e lave 2x com 1x dPBS. Para a segunda lavagem, deixe o PBS nos poços enquanto prepara diluições seriais do vírus.
    2. Descongele as amostras do vírus no gelo, e dilui-as em série em uma placa de 24 poços para obter diluições seriais de 10-1 a 10-6.
      NOTA: Como exemplo, encha cada poço em uma placa de 24 poços com 270 μL de meio de infecção.
    3. Adicione 30 μL da amostra do vírus ao primeiro poço da linha. Com uma nova ponta de pipeta, misture bem e transfira para o próximo poço na linha para diluir a amostra em 10x. A continuação até 10-6 diluição foi alcançada; realizar etapas 9.2.1-9.2.3 para todas as amostras de vírus.
    4. Remova o PBS da placa MDCK e infecte em duplicata com 100 μL das diluições virais preparadas. Para poços de controle, adicione 100 μL do meio de infecção (sem a amostra viral). Incubar a 35 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 1h, agitando a placa para eliminar manchas secas a cada 15 minutos.
    5. Remova o inóculo viral e adicione 1 mL de sobreposição líquida para cada poço. Incubar a 35 °C em uma atmosfera de CO2 de 5% por 72 h.
  3. Dia 4 (72 h pós-infecção): visualização de placa
    1. Remova a sobreposição líquida e fixe as células com 4% de formaldeído em 1x PBS por 1h. Remova a solução de formaldeído e lave uma vez com 1x PBS ou água destilada.
    2. Manche as células fixas adicionando 1% de solução violeta cristalina por 15 minutos. Remova o corante violeta cristalino e lave as células com água corrente. Seque a placa na rtp.
    3. Uma vez seco, conte placas e calcule o título viral de acordo com a seguinte fórmula:
      Número de placas × Fator de Diluição = Número de Placa - Unidades de Formação em 100 μL

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Results

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Embora as células T convencionais formem o principal repertório de resposta imune adaptativa contra infecção viral para facilitar o despejo viral, a população de células T inatas trabalha em um espectro mais amplo para suprimir a carga viral para liberação eficaz em um estágio posterior. Portanto, este protocolo cria especificamente uma condição robusta para estudar células T inatas, sua ativação e sua população funcional após a infecção por gripe, sem precisar de amostras epiteliais e cé...

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Discussion

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As respostas imunológicas inatas contra vírus são um campo de estudo pouco investigado no manejo antiviral. As células epiteliais das vias aéreas e as células imunes inatas trabalham em conjunto para suprimir a replicação viral durante uma infecção, além de servir como determinante de resposta adaptativa hiperativa se a carga viral não for mantida em xeque 12,13,17. No entanto, o desenvolvimento de um modelo humano relevante par...

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Disclosures

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Todos os autores não declaram conflito de interesses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer à equipe de pesquisa do Departamento de Otorquinologia e Departamento de Microbiologia e Imunologia da NUS por sua ajuda com o trabalho relacionado à cultura e à cultura viral do HNEC. Gostaríamos também de agradecer aos cirurgiões e equipe cirúrgica do Hospital Universitário Nacional, Departamento de Otormologia, por sua ajuda no fornecimento das amostras de células e sangue necessárias para o estudo.
Este estudo foi financiado pelo National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (para De Yun Wang) e MOH-OFYIRG19may-0007 (para Kai Sen Tan). Kai Sen Tan é um beneficiário do apoio de bolsas da European Allergy and Clinical Imunology (EAACI) Research Fellowship 2019.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,5% Tripsina-EDTAGibco15400-054
0,5 M Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pH 8,0, livre de RNaseThermofisherAM9260G0,5M EDTA
1,5 mL Tubos SafeLockEppendorf00301200861,5mL Tubo de Centrífuga
10 mL K3EDTA Tubos VacutainerBD36664310mL Tubos de Coleta de Sangue
10x dPBSGibco14200-075
10x PBSVivantisPC0711
Placa de 12 poçosCorning 3513
Inserto Transwell de 12 poçosCorning 3460membrana de inserção
1x FACS Lysing SolutionBD349202
2.0 mL SafeLock TubesEppendorf00301200942 mL tubo de centrífuga
24-well PlateCorning 3524
Inserto Transwell de 24 poçosCorning 3470
3% Ácido Acético com Azul de MetilenoSTEMCELL Technologies07060
3,3',5-triiodo-l-thyronineSigmaT-074
37% Solução de Formaldeído w 15% Metanol como Estabilizador em H2OCentrífuga Sigma533998
5810REppendorf5811000320
5 mL polipropileno tubos (tubos de fluxo)BD352058
70 µ m Filtro de CélulasCorning 
A-4-62 RotorEppendorf5810709008
AccutaseGibcoA1110501Reagente de Dissociação de Células
Antibiótico-AntimicóticoGibco15240-062
Avicel CL-611FMC BiopolímeroNALiquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Software PadrãoBio-Rad Laboratories, Inc171STND01Software de Gerenciador de Multiplex
Agulha Borboleta 21 GBD367287
Toxina de CóleraSigmaC8052
Cristal Violeta MerckC6158
Cytofix/Cytoperm SolutionBD554722Solução de Fixação e Permeabilização
Dispase IISigmaD4693Protease Neutra
DMEM/Alta GlicoseGE Healthcare Life SciencesSH30243.01
DMEM/Mistura de Nutrientes F-12Gibco-Invitrogen11320033
dNTP MixPromegaU1515dNTP Mix
EMEM (com L-Glutamina)ATCC30-2003
Dispositivo de voltohmetro EVOMWPI, Sarasota, FL, EUA300523
Solução de lise FACSBD3492021x Solução de lise
Tubo Falcon 15 mLCellStar188271tubo de 15 mL
Tubo Falcon 50 mLCellStar22726150 mL Sondas
de DNA Essenciais de Início Rápido em Tubo MasterRoche6402682001qPCR Master Mix
Ficoll Paque PremiumResearch Instruments17544203Density Gradient Media
H3N2 (A/Aichi/2/1968) ATCCVR547
H3N2 M1 Sequência de Primer DiretoSigma5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'H3N2
M1 Sequência de Primer ReversoSigma 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'H3N2
NS1 Sequência de Primer DiretoSigma5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'H3N2
NS1 Sequência de Primer ReversoSigma5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'Soro
Fetal Bovino Inativadopor Calor Gibco10500-064
hNESPCsDoadores HumanosNA
Fator de Crescimento Epitelial HumanoGibco-InvitrogenPHG0314
HidrocortisonaSTEMCELL Techonologies7925Coletado de biópsias nasais durante cirurgias
de desvio de septoInsulinaSigmaI3536
Lightcycler 96Roche5815916001qPCR
Instrumento Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *para Excitação UVThermofisherL23105Mancha de Viabilidade
MILLIPLEX MAP Citocina Humana/Quimiocina Painel de Grânulos Magnéticos II - Pré-misturado 23 PlexMerck Pte LtdHCP2MAG-62K-PX23Imunologia Multiplex Ensaio
Mitomicina CSigmaM4287
M-MLV 5x BufferPromegaM1705RT-PCR 5x
Buffer M-MLV Transcriptase ReversaPromegaM1706Transcriptase Reversa
N-2 suplementoGibco-Invitrogen17502-048
NIH / 3T3ATCCCRL1658
Perm / Wash BufferBD554723Permeabilização Tampão de Lavagem
PneumaCult-ALI 10x SuplementoSTEMCELL Techonologies5001
PneumaCult-ALI Basal MediumSTEMCELL Techonologies5001
PneumaCult-ALI Suplemento de Manutenção (100x)STEMCELL Techonologies5001
Random PrimersPromegaC1181Random Primers
Rnasin Recombinante Rnase Rnase InhibitorPromegaN2511Inibidor de RNase
Tampão de Lise de RNAQiagenParte de 52904
RPMI 1640 (com L-Glutamina)Eletrodos ATCC30-2001
STX2WPI, Sarasota, FL, EUASTX2Eletrodo
T25 FrascoCorning 430639
T75 FrascoCorning430641U
TPCK Kit deTrypan SigmaT1426
Trypan BlueHycloneSV30084.01
extração de RNA viralQiagen52904
Placa em forma de V de 96 poçosCorning3894
431751 extração de RNA viral Kit de

References

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