Espólio-Temporal Em Vivo Imagem de Sistemas de Entrega de Drogas Oculares usando Microendoscopia a laser confocal de fibra óptica

A liberação de sangue, a distribuição de tecidos e a ocupação-alvo de drogas em sistemas vivos são pilares para a compreensão da disposição in vivo de drogas. Em modelos animais pré-clínicos, esses parâmetros são tipicamente avaliados por amostragem frequente de sangue e tecido em determinados pontos de tempo após a administração de medicamentos. No entanto, esses procedimentos são geralmente invasivos, muitas vezes incluem medidas de não sobrevivência, e exigem grandes coortes de animais para alimentação estatística. Pode haver custo extra e tempo incorridos, juntamente com preocupações éticas para o uso excessivo de animais. Como resultado, a imagem não invasiva está rapidamente se tornando um passo integral em estudos de biodistribuções. A microendoscopia a laser confocal (^CLM1,2) é adequada para aplicações oculares para imagem não invasiva da distribuição espátula-temporal da terapêutica aos olhos de animais vivos com alta sensibilidade e alta ^{resolução1,3,4}.

A CLM tem o potencial de facilitar a triagem robusta de sistemas de entrega de medicamentos oculares (DDS), como lipossomos, antes da quantificação abrangente do DDS e da biodisponibilidade de medicamentos. Os lipossomos são atraentes por sua flexibilidade em ajustar suas propriedades físico-químicas e biofísicas5,6,7,8,9,10,11 para encapsular uma grande variedade de carga terapêutica e controlar o local tecidual de liberação de drogas e duração da ação. Lipossomos têm sido usados em aplicações oculares para a entrega de grandes moléculas, como o anticorpo monoclonal ^{bevacizumab12}, e pequenas moléculas como ciclosporina13 e ganciclovir14. Lipossomos carregados de drogas têm meias-vidas biológicas mais longas e efeitos terapêuticos prolongados em comparação com formulações não liposômicas de "droga livre". No entanto, a distribuição de drogas no tecido ocular é tipicamente extrapolada das concentrações de drogas em componentes fluidos do olho (ou seja, sangue, humor aquoso e humor vítreo15,16,17). Como o destino inicial in vivo da carga de droga carregada é definido pelas propriedades do próprio nanocarrier, a imagem CLM dos lipossomos fluorescentes pode servir como um substituto para a droga revelar o direcionamento tecidual e os tempos de residência do tecido in situ. Além disso, evidências visuais de entrega com CLM podem orientar o re-projeto do DDS, avaliar os benefícios terapêuticos da droga e talvez até prever eventos biológicos adversos (por exemplo, toxicidade tecidual devido à localização indesejável do DDS por períodos prolongados de tempo).

Aqui, um procedimento passo-a-passo é detalhado sobre como estudar a biodistribução ocular de lipossomos em ratos vivos com um sistema CLM de banda dupla. Este sistema CLM específico pode detectar fluorescência de duas cores (com lasers de excitação verde e vermelho a 488 nm e 660 nm) em tempo real, com uma frequência de 8 quadros/s. Ao colocar fisicamente a sonda de detecção no olho, o protocolo demonstra a aquisição de imagens e a análise de lipossomos verde-fluorescentes sobre a administração subconjuntiva em camundongos pré-injetados por via intravenosa (IV) com 2% de corante Evans Blue (EB). O corante EB ajuda a visualizar as estruturas vascularizadas no canal de fluorescência vermelha. Mostramos resultados representativos de um estudo que avalia lipossomos neutros de 100 nm compostos do POPC fosfolipídeo (ou seja, 1-palmitoyl-2-oleoyl-glicero-3-fosfocholina) e dopados com fluorescemina-tagged Fl-DHPE (i.e., N-(fluoresceína-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-gliceo-3-fosfoethanolamina) a uma proporção de 95% de POPC: 5% Fl-DHPE (Figura 1B ). O CLM é capaz de capturar os lipossomos marcados por fluoresceína verde a 15 μm axial e 3,30 μm de resolução lateral por delineamento das fronteiras do tecido ocular manchados pelo EB.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da SingHealth (Cingapura). Camundongos C57BL/6 J femininos (6- 8 semanas de idade; 18-20 g) foram obtidos de InVivos, Cingapura, e alojados em um vivarium controlado pela temperatura e luz da Duke-NUS Medical School, em Cingapura. Os animais foram tratados de acordo com as diretrizes da Declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisa oftalmológica e de visão.

NOTA: Um fluxograma destacando os principais procedimentos é mostrado na Figura 2.

1. Preparação de agentes de contraste: Evans Blue (EB) e lipossomos

1. Para 2% de solução de corante EB, dissolva 1 g de EB em 50 mL de soro fisiológico estéril. Filtre a solução usando filtros de 0,22 μm em tubos estéreis de 1,5 mL e armazene-os em temperatura ambiente para uso posterior.
2. Para lipossomos verde-fluorescentes, adicione POPC/Fl-DHPE (95:5), clorofórmio/metanol (2:1) em um frasco fundo redondo de 100 mL. Use um evaporador rotativo a 150 rpm a 40 °C durante 1h, com vácuo mantido a 0 ^mbar1 para criar uma fina película lipídica.
   NOTA: Ao comparar efeitos de propriedades liposômicas (por exemplo, tamanho, carga, saturação lipídica, comprimento da cadeia lipídica) na distribuição, mantenha uma porcentagem fixa de Fl-DHPE ou outros lipídios fluorescentes para confirmar que os resultados observados se devem ao efeito das propriedades testadas, e não à carga variável de grandes corantes hidrofóbicos.
3. Hidrate o filme lipídico com soro fisiológico tamponado de fosfato (para alcançar 26,3 mM de lipossomos fluorescentes) a 40 °C para formar vesículas multi-lamelar (MLV). Coloque os MLVs em uma seringa de vidro para extrusão manual (30 vezes usando um filtro de policarbonato de tamanho de poros de 0,08 μm) para atingir o tamanho desejado de 100 nm.
   NOTA: A temperatura para hidratação deve ser maior do que a temperatura de transição dos lipídios.
4. Filtre os lipossomos passando-os através de um filtro de seringa estéril de 0,22 μm. Confirme o diâmetro hidrodinâmico (_DH) dos lipossomos usando um sistema dinâmico de dispersão de luz.

2. Administração de EB e lipossomos em ratos vivos

1. Injete o mouse com EB IV (intravenoso) através da veia da cauda (2,5 mg/kg), 2 h antes da injeção subconjuntival.
2. Para injeção subconjunta, primeiro, sedeia o rato usando 5% de isoflurane via inalação em uma câmara de indução para alcançar um plano adequado de anestesia. Transfira o mouse para um cone de nariz e mantenha a sedação em 2%-2,5% de isoflurane enquanto estiver em uma almofada de aquecimento durante todo o procedimento.
3. Corte os bigodes perto do olho para serem injetados e incutir uma gota de solução de cloridrato de proxymetacaina 0,5% proxymetacaína diretamente no olho.
4. Carregue uma seringa de vidro de 10 μL (com agulha de 32 G) com lipossomos fluorescentes (Fl-DHPE: 0,78 mg/kg) e dissite todas as bolhas de ar na seringa antes da injeção.
   NOTA: Até 20 μL de injeção podem ser acomodados no espaço subconjuntivo de ^{camundongos18,19}.
5. Usando uma pinça, levante ligeiramente a conjuntiva e injete lentamente no espaço subconjuntivo (Figura 1A). Retire a agulha lentamente para evitar o fluxo de volta. Certifique-se de que uma bleb visível cheia de lipossomos fluorescentes seja formada (Figura 1C).
6. Administre uma gota de antibiótico 1% de ácido fusídico no olho após a injeção e monitore o rato até que ele recupere a consciência.

3. Configuração clm

1. Ligue o sistema CLM e certifique-se de que tanto o conector quanto a ponta distal da sonda de varredura estejam limpos.
2. Limpe o conector da sonda de varredura usando um limpador de conector óptico seguindo as instruções do fabricante.
   1. Pressione o rachet (muitas vezes colorido) do limpador de conector óptico para revelar uma fita de limpeza.
   2. Posicione o conector em contato com a fita de limpeza e deslize o conector ao longo da fita enquanto mantém contato.
3. Limpe a ponta distal (também conhecida como ponta de varredura) da sonda mergulhando-a na solução de limpeza, seguida pela solução de lavagem fornecida pelo fabricante. Um aplicador de ponta de algodão também pode ser usado para uma limpeza mais completa se a ponta estiver muito suja.
4. Conecte a sonda ao sistema CLM. Escolha o Campo de exibição (FOV) e o local para os arquivos de aquisição neste momento.
   NOTA: Ajuste a intensidade do laser nesta etapa para garantir que a detecção de fluorescência para Fl-DHPE esteja na faixa linear. A intensidade do laser deve ser mantida consistente para comparação entre imagens tiradas em diferentes pontos de tempo.
5. Deixe o sistema aquecer por 15 minutos conforme instruído e use o kit de calibração para calibrar o sistema de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: No kit de calibração, há três frascos para cada laser contendo as seguintes soluções: solução de limpeza, solução de lavagem e solução fluorófora de 488/660 nm para calibração interna. As etapas de calibração são solicitadas pelo sistema e devem ser seguidas em conformidade.
   1. Mergulhe a ponta no frasco de limpeza seguido do frasco de lavagem (5 s em cada frasco). Deixe no ar para gravação de fundo para ambos os canais.
      NOTA: Esta etapa é muito crucial, pois normaliza os valores de fundo de diferentes fibras da sonda e garante a uniformidade da imagem.
   2. Mergulhe a ponta no frasco de limpeza seguido do frasco de lavagem (5 s em cada frasco). Mergulhe a ponta no frasco fluoróforo de 488 nm por 5 segundos para normalizar os valores de sinal de diferentes fibras da sonda.
   3. Mergulhe a ponta no frasco de limpeza seguido do frasco de lavagem (5 s em cada frasco). Mergulhe a ponta no frasco de lavagem até que o sinal de fluorescência seja registrado em 3,5,2. Desaparece. Mergulhe a ponta no frasco fluorforo de 660 nm para normalizar os valores de sinal de diferentes fibras da sonda.
      NOTA: Siga todas as etapas de calibração para obter a calibração adequada e a qualidade ideal da imagem.
6. Depois de calibrar a sonda, verifique se os valores de fundo das sondas estão o mais baixos possível. Para o sistema CLM utilizado, mantenha os valores de fundo abaixo de 100. Realize a limpeza repetida da sonda com um aplicador de ponta de algodão e calibração se os valores estiverem acima de 100/valor de usuário definido ou se a sonda parecer estar suja. Isto é para garantir que o ruído de fundo seja mantido em torno do mesmo valor.
   NOTA: É importante definir o valor máximo de fundo (por exemplo, 100 conforme indicado na etapa 3.6) para garantir que as condições da sonda sejam semelhantes. Isso permitirá uma comparação quantitativa adequada entre imagens tiradas em diferentes pontos de tempo. O valor pode diferir em diferentes sistemas e condições da sonda.
7. Ligue o controlador de temperatura animal (ATC). Ajuste o ATC para 37 °C. Cubra a almofada de aquecimento com uma cortina cirúrgica e fixe o cone do nariz na almofada de aquecimento.
   NOTA: ATC com uma almofada de aquecimento anexada é necessário para garantir que o animal seja mantido aquecido durante toda a duração da imagem.
8. Aperte o suporte do microscópio de dissecação na mesa para fixá-lo. Gire e ajuste a ocular do microscópio para ver o olho do rato ergonomicamente através da ocular quando o usuário estiver sentado (faça os ajustes após a colocação do animal).
9. Sedar o rato usando 5% de isoflurane em uma câmara de indução. Transfira o rato para o cone do nariz uma vez que o animal não responda e mantenha a sedação em 2%-2,5% de isoflurane durante todo o procedimento.
10. Corte os bigodes do mouse e incutir uma gota de solução de cloridrato de proxymetacaína de 0,5% no olho.
11. Para ter certeza de que os olhos estão limpos, deixe cair algumas gotas de soro fisiológico para lavar a superfície ocular.
12. Ajuste o microscópio para que o olho do mouse esteja em foco direto na ampliação de 0,67x.
    NOTA: Certifique-se de lubrificar os olhos com soro fisiológico. Se os olhos não estiverem lubrificados durante toda a sessão de imagem, eles podem secar, fazendo com que a lente se cristalize. Como resultado, durante a imagem clm, a lente pode emitir uma fluorescência vermelha de fundo.

4. Imagem ao vivo de olhos de rato com CLM e aquisição

1. Ligue o laser, coloque a sonda no olho e comece a gravar a aquisição para observar a fluorescência no olho nas regiões indicadas no mapa-olho na Figura 3.
   NOTA: Segure a sonda como uma caneta com a extremidade distal da sonda diretamente sobre a região a ser imageda.
2. Pare a gravação quando todas as regiões tiverem sido sinalizadas e rotuladas. Os arquivos de aquisição serão salvos automaticamente no local do arquivo escolhido na etapa 3.4.
   NOTA: O arquivo será salvo como um arquivo de vídeo que pode ser exportado para imagens individuais. Rotule a bandeira de acordo com o mapa dos olhos para saber exatamente a localização da sonda no quadro exato que a gravação foi feita.

5. Análise de imagem

1. Usando o mesmo software de aquisição clm, exporte os arquivos de aquisição de imagens para análise suplementar. Clique em | de Arquivo Exporte e escolha o formato a ser exportado. Os arquivos de formato Mkt permitirão ajustes de tabela de visualização (LUT) e exportações adicionais para formatos de arquivos de imagem usando o software de visualização CLM.
2. Para uma comparação precisa da intensidade da fluorescência, use o mesmo LUT ajustado para cada canal ao exportar todos os arquivos de imagem.
   NOTA: Escolha o limiar de LUT mínimo e máximo em relação aos do mouse de controle (sem lipossomos injetados) para minimizar as leituras de fluorescência de fundo.
3. Abra a imagem em um programa de processamento de imagem/freeware apropriado (por exemplo, ImageJ). Desenhe a região de interesse (ROI).
   NOTA: O ROI aqui refere-se à região de interesse no programa de processamento. Na maioria dos casos, o ROI será toda a imagem digitalizada. No entanto, no caso de imagem do limbus, a sonda não pode simplesmente obter a imagem do limbus separadamente. Portanto, um ROI deve ser desenhado para 'quantificar' a fluorescência na região do limbus, conforme desenhado na Figura 4. Para manter o ROI consistente, use o mesmo ROI em todas as imagens.
4. Meça e regisse os valores do ROI para fluorescência verde. Digite os valores em uma planilha. Tabular os valores médios e de intensidade de fluorescência (a.u.) do ROI.

6. Avaliação de histologia

1. Eutanize o mouse usando um método aprovado pelo IACUC local.
2. Enuclear o olho e fixar o olho em 1 mL de 4% de formaldeído ou 10% de solução formalina durante a noite.
3. Corte as gorduras em excesso e incorpore o olho no composto de Temperatura de Corte Ideal (OCT) e mantenha-o congelado em um congelador de -80 °C por pelo menos um dia.
4. Corte seções de 5 μm de espessura no criostato com temperatura de corte mantida em 20 °C. Transfira a seção para um slide de microscópio revestido de Poly-L-Lysine.
   NOTA: A histologia pode servir como validação adicional da distribuição de DDS. No entanto, requer otimização adicional, conhecimento técnico e sacrifício de animais que o estudo pretende reduzir usando CLM.

O protocolo demonstra a utilidade da CLM para avaliar a distribuição ocular esposo-temporal de lipossomos fluorescentes verdes administrados através de injeção subconjuntival. Para fazer uso da capacidade de cor dupla (comprimentos de onda de excitação de 488 nm e 660 nm) do sistema CLM, lipossomos POPC neutros de 100 nm a serem injetados foram dopados com 5% de Fl-DHPE (dados de composição e caracterização são mostrados na Figura 1B), e o EB foi injetado IV para identificar marcos no olho. A presença de uma fina camada de episclera e a conjuntiva, ambas altamente vascularizadas, permite que a região da esclera seja manchada de vermelho com EB (Figura 4A, rotulada como S), enquanto a córnea que não contém nenhuma vasculatura (Figura 4A, rotulada como C), não fica manchada e parece negra. Isso permite uma diferenciação distinta entre ambas as regiões durante a imagem de fluorescência.

Os resultados representativos são de um estudo de distribuição que abrange mais de 7 dias (n = 4 camundongos). Como as intensidades de fluorescência nas imagens para o primeiro dia e o 3º dia eram altas (Figura 5B), as intensidades dos pixels foram reduzidas para melhor visualização. Os valores reais da intensidade da fluorescência são refletidos nos gráficos (Figura 6). Para garantir que as observações das imagens fossem devido à fluorescência dos lipossomos e não ao corante livre, que poderia ter se desalojado dos lipossomos, foram incluídos ratos de controle injetados com corante de fluoresceína (Fl) (Figura 5A).

Observou-se redução dos lipossomos (por procuração da diminuição do sinal fluorescente verde) nas regiões de limbus e esclera ao longo do tempo. Como os lipossomos foram injetados do temporal para a região superior do espaço subconjuntivo (Figura 3), eles foram naturalmente colocados bem em cima da esclera temporal e superior (Figura 4B) antes de atingir outras regiões do espaço subconjuntivo. No primeiro dia pós-injeção, a fluorescência detectada na esclera foi até 6 vezes maior que o limbus para regiões temporais e superiores (Figura 6). No dia 3 e dia 7, observou-se redução significativa dos lipossomos na esclera (60% do dia 1 ao dia 3 (dia 1→3) e 88% do dia 3 ao dia 7 (dia 3→7)) na região temporal, com redução de 66% e 93% para o dia 1→3 e dia 3→7 na região temporal superior, com redução de 66% e 93% para o dia1→3 e dia 3→7 na região temporal superior, respectivamente, p < 0,001) (Figura 6). Essa redução foi atribuída aos mecanismos de desembaraço ocular através de vasos sanguíneos e/ou linfáticos encontrados na conjuntiva e episclera. Os lipossomos também poderiam ter difundido através da esclera e ser limpo pelo coroide, que também é altamente vascularizado.

Os lipossomos foram encontrados para limpar de forma mais lenta no limbus. Para limbus temporal e limbus superior, as alterações nos sinais de fluorescência do dia 1 ao dia 3 pós-injeção não foram significativas, indicando que lipossomos neutros têm preferência para a região do limbus, particularmente a periferia da córnea (Figura 5B). Os lipossomos na região dos limbus começaram a ser limpos a partir do dia 3 (d3→7: -89% para temporal (p < 0,01) e -53% para superior (p < 0,05)). Até o dia 7, mais de 90% dos lipossomos foram retirados de todas as regiões de limbus (p < 0,05) com exceção do limbus superior 1S, onde 50% dos lipossomos ainda poderiam ser detectados (p > 0,05). Isso indica que o tempo de residência para lipossomos neutros é muito maior na periferia superior de limbus/córnea (Figura 5 e Figura 6) quando comparado com outras regiões. A menor quantidade de fluorescência foi detectada nas regiões nasais e inferiores em todos os pontos de tempo devido à distância do local da injeção (Figura 6A,B).

Em estudos mais abrangentes de liberação de lipossomos no olho relatados anteriormente1, discutimos algumas rotas em que lipossomos poderiam ser retirados de tecidos oculares após injeção subconjunta. Enquanto os lipossomos podem ser limpos pela circulação sistêmica e liberação linfática através da conjuntiva, episclera e coroide, que são altamente vascularizados, eles também podem alcançar tecidos intraoculares mais profundos por difusão passiva através da esclera. O fluxo de fluidos também pode transportar os lipossomos através da malha trabecular ou do fluxo de uveosclera, o que pode trazer os lipossomos de volta para a esclera. A eliminação através de lágrimas também é possível, e pequenos vazamentos no local da injeção podem permitir a penetração da córnea através da difusão passiva.

Figura 1: Injeção subconjuntival de lipossomos no olho. (A) Representação gráfica de lipossomos verde-fluorescentes e injeção subconjuntival. (B) Composição e propriedades da fl-DHPE doparam formulação liposômica para imagem clm ocular. (C) Lipossomos verde-fluorescentes formando uma bleb sobre injeção subconjunta. Este valor foi adaptado com permissão de Chaw S.Y. et al.1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Linha do tempo do procedimento CLM ocular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Mapa dos olhos para tomografias clm. A área 1 refere-se à região do limbus, enquanto a área 2 refere-se à região da esclera. Vídeos e imagens foram tiradas do 1T no sentido anti-horário, seguidos pelo 2T em sentido anti-horário semelhante. Como a agulha foi inserida para injeção de 2T para 2S, as áreas de interesse são principalmente 1T, 1S, 2T e 2S. A inserção mostra o tamanho da sonda em relação ao olho do mouse. Este valor foi adaptado com permissão de Chaw S.Y. et al.1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise de Imagem. (A) A análise de ImageJ de lipossomos fluorescentes foi feita utilizando regiões de interesse (ROI) definidas para as regiões oculares de limbus (L) e esclera (S) (B) quantificadas na região do limbus para presença liposa. Os possíveis locais de lipossomos detectados no limbus são 1) periferia córnea, 2) limbus ou 3) periferia de esclera. Este valor foi adaptado com permissão de Chaw S.Y. et al.1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Distribuições de contraste no limbus e esclera. Distribuição de contraste no limbus (1S: Superior, 1N: Nasal, 1I: Inferior, 1T: Temporal) e esclera (2S: Superior, 2N: Nasal, 2I: Inferior, 2T: Temporal) regiões de um rato representativo de cada coorte (n=4) ao longo de 7 dias para (A) controle fluoresceína (Fl) A cor vermelha indica coloração EB. Barra de escala = 50 μm. (C) As imagens tiradas são montadas no mapa dos olhos para melhor compreensão. Este valor foi adaptado com permissão de Chaw S.Y. et al.1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Liberação cinética de lipossomos POPC neutros de 100 nm nas regiões esclera (A) e limbus (B) ao longo de 7 dias (n=4 ratos por grupo). A intensidade média da fluorescência foi comparada pela ANOVA de 2 vias com múltiplas comparações em relação ao ponto de tempo anterior; d1→3 e d3→7; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Imagens representativas de histologia de seções transversais (5 μm) do olho do rato um dia após a injeção de lipossomos Fl-DHPE. Linhas pontilhadas indicam onde os lipossomos podem ser observados, indicados pela cor verde. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.