Suspensões aquosas estáveis de aglomerados de ferrite de manganês com dimensão e composição de nanoescala tunable

A inclusão de manganês como dopant em uma rede de óxido de ferro pode, sob as condições adequadas, aumentar a magnetização do material em campos de alta aplicação em comparação com óxidos de ferro puros. Como resultado, as nanopartículas de manganês ferrite (MnxFe3-xO4) são nanomateriais magnéticos altamente desejáveis devido à sua alta magnetização de saturação, forte resposta a campos externos e baixa citotoxicidade1,2,3,4,5. Tanto os nanocristais de domínio único quanto os agrupamentos desses nanocristais, denominados partículas multidomainas, têm sido investigados em diversas aplicações biomédicas, incluindo entrega de medicamentos, hipertermia magnética para tratamento do câncer e ressonância magnética (RM)^6,7,8. Por exemplo, o grupo Hyeon em 2017 usou nanopartículas de ferrite de manganês de domínio único como um catalisador fenton para induzir a hipóxia do câncer e explorou o _T2contrast do material para rastreamento de ressonância ^magnética9. É surpreendente à luz desses e outros estudos positivos de materiais ferritais que há poucas demonstrações in vivo em comparação com nanomateriais de óxido de ferro puro (_Fe3O4), e nenhuma aplicação relatada em ^humanos9,10.

Um imenso desafio enfrentado na tradução das características dos nanomateriais ferrite para a clínica é a geração de aglomerados uniformes, não agregadores e nanoescala11,12,13,14. Embora as abordagens sintéticas convencionais para os nanocristais monodomínios sejam bem desenvolvidas, os aglomerados multidomain do tipo de interesse neste trabalho não são facilmente produzidos de forma uniforme e ^{controlada15,16}. Além disso, a composição ferrita geralmente não é estequiométrica e não apenas está relacionada à concentração inicial dos precursores e isso pode obscurecer ainda mais a caracterização sistemática estrutura-função desses materiais9,12,13,17. Aqui, abordamos essas questões demonstrando uma abordagem sintética que produz controle independente sobre a dimensão do cluster e a composição de nanomateriais de ferrite de manganês.

Este trabalho também fornece um meio de superar a pobre estabilidade coloidal dos nanomateriais ferrite18,19,20. As nanopartículas magnéticas são geralmente propensas à agregação devido à forte atração de partículas de partículas; ferrites sofrem mais com esse problema à medida que sua magnetização líquida maior amplifica a agregação de partículas. Em meios biológicos relevantes, esses materiais produzem grandes agregados suficientes que os materiais coletam rapidamente, limitando assim suas rotas de exposição a animais ou pessoas20,21,22. Hilt et al. encontraram outra consequência da agregação de partículas-partículas em seu estudo de aquecimento magnetotémico e degradação de ^corante23. Em concentrações de partículas ligeiramente maiores, ou aumento do tempo de exposição ao campo, a eficácia dos materiais foi reduzida à medida que os materiais agregados ao longo do tempo e as áreas de superfície de partículas ativas diminuíram. Essas e outras aplicações se beneficiariam de superfícies de cluster projetadas para fornecer barreiras estéricas que impediam interações partículas-partícula24,25.

Aqui relatamos uma abordagem sintética para sintetizar os aglomerados de ferrite de manganês (MFCs) com dimensões e composição controláveis. Essas partículas de multidomaina consistem em um conjunto de nanocristais de ferrite de manganês primários que são agregados duramente; a associação próxima dos nanocristais primários melhora suas propriedades magnéticas e fornece um tamanho total de cluster, 50-300 nm, bem combinado com as dimensões ideais para uma nanomedicina. Alterando a quantidade de água e o precursor do cloreto de manganês, podemos controlar independentemente o diâmetro e a composição globais. O método utiliza reações hidrotérmicas simples e eficientes de um pote que permitem experimentação frequente e otimização de materiais. Esses MFCs podem ser facilmente purificados em uma solução concentrada de produtos, que é ainda modificada por polímeros sulfoados que transmitem estabilidade coloidal. Sua sintonia, uniformidade e estabilidade de fase de solução são características de grande valor nas aplicações de nanomateriais em engenharia biomédica e ambiental.

1. Síntese de MFCs com controle sobre o diâmetro geral dos MFCs e composição ferrita

1. Lave e seque completamente todos os vidros para serem usados na síntese. A quantidade de água na síntese impacta as dimensões dos MFCs, por isso é crucial garantir que o vidro não tenha água residual ^nele16,26.
   1. Para lavar os vidros, enxágue com água e detergente e esfregue com uma escova de frasco para remover os detritos. Enxágue bem para remover todo o detergente e finalize com uma lavagem de água deionizada.
   2. Para secar os vidros, retire as gotículas de água da superfície do vidro e coloque em um forno a 60°C até secar completamente.
   3. Enxágüe os reatores revestidos de polifeneno (PPL) com 37% de ácido clorídrico para remover quaisquer detritos do uso anterior. Para isso, coloque os reatores e suas tampas em um grande béquer e encha com ácido clorídrico até que os reatores estejam completamente submersos. Deixe isso descansar por 30 minutos antes de derramar o ácido clorídrico. Enxágue continuamente o béquer contendo os reatores com água por 1-2 min e, em seguida, coloque os reatores no forno para secar.
2. Use uma pipeta automática para transferir 20 mL de etileno glicol em um béquer de 50 mL com uma barra de agitação magnética.
3. Pesar a quantidade necessária de cloreto de ferro (III) (_FeCl3·_6H2O, sólido) para alcançar uma concentração final de 1,3 mM e adicioná-lo ao béquer. Coloque o béquer em uma placa de agitação e ligue-o a 480 rpm para começar a agitação contínua do béquer.
   NOTA: Como se trata de um hidrato, deve ser medido e adicionado rapidamente para evitar a absorção indesejada de água do ar ambiente.
4. Pese 250 mg de ácido poliacrílico (PAA, Mw ~6.000, pó) e adicione-o ao béquer. Após a adição do PAA, a solução se torna opaca e ligeiramente mais clara na cor.
5. Pesar 1,2 g de ureia (CO(_NH2)₂, pó) e adicioná-lo ao béquer.
6. Usando uma pipeta, adicione cloreto de manganês de 0,7 mM (II) (_MnCl2·_6H2O aq, 3,5 M, 0,2 mL) ao béquer.
7. Por fim, usando uma pipeta adicione a quantidade necessária (0,5 mL) de água ultra-pura ao béquer.
8. Deixe a solução mexer por 30 minutos e observe a mudança de cor. Ele se apresentará como uma cor laranja translúcida e escura.
9. Transfira a mistura de reação para o reator forrado de polifeneno (PPL). Note que depois que a solução mexeu alguns sólidos podem ter se acumulado nas laterais do béquer.
   1. Use um ímã (ímã de terra rara permanente cúbica, 40 x 40 x 20 mm, doravante chamado de "ímã" para todos os procedimentos de separação e coleta magnética) para arrastar a barra de agitação ao redor das paredes do béquer para garantir que quaisquer sólidos que tenham se acumulado nas laterais sejam dispersados na solução de reação.
   2. Uma vez que a solução esteja mista e pronta, transfira-a para o reator forrado PPL de 50 mL.
   3. Use um grampo e uma alavanca para selar o reator na autoclave de aço inoxidável o mais firmemente possível. Fixar o vaso do reator em uma superfície estável, e usando uma haste inserida na tampa como alavanca, empurre o reator para selar. Observe que o reator selado não deve ser capaz de ser aberto manualmente. Isso é crucial, pois o ambiente de alta pressão do forno requer uma vedação apertada no reator.
10. Coloque o reator em forno por 20 h a 215 °C.
11. Depois que a reação hidrotérmica for feita, remova o reator do forno e deixe esfriar até a temperatura ambiente. A pressão do forno permitirá que o reator seja aberto manualmente. Observe que neste ponto, o reator conterá o produto MFC dispersado em etileno glicol com outras impurezas, como polímero não redigido, e será uma solução preta opaca. O produto será isolado nas etapas seguintes.

2. Separação magnética e purificação de MFCs

1. Coloque 200 mg de lã de aço em um frasco de vidro. Encha o frasco de vidro no meio do caminho com a mistura de reação do reator. Encha o resto do frasco com acetona e agite bem. Observe que a lã de aço aumenta a força do campo magnético no frasco e ajudará a separação magnética dos nanoaglomerados da solução.
2. Coloque o frasco em um ímã para que a coleta magnética ocorra. O resultado será uma solução translúcida com precipitação na parte inferior.
   1. Despeje a solução sobrenante enquanto os MFCs são magneticamente presos pela lã de aço, segurando o ímã até o fundo do frasco enquanto derramam. O etileno glicol será removido principalmente nesta etapa.
   2. Comece a lavar com a baixa proporção de acetona para água e aumente a proporção em lavagens subsequentes até ficar pura. Faça isso 3-4 vezes.
3. Retire o frasco do ímã e encha-o com água. Agite bem para dissolver os MFCs. Agora o produto estará totalmente disperso na água.
4. Repita as duas etapas anteriores várias vezes até que a solução aquosa dos MFCs não produz bolhas quando abalada. O resultado será um ferrofluido escuro e opaco que responderá fortemente aos ímãs.
   NOTA: Em uma síntese típica com 20 mL de etileno glicol, aproximadamente 80 mg de produto MFC serão obtidos.

3. Funcionalidade superficial de MFCs em direção à estabilidade coloidal ultra-alta

NOTA: A síntese de nitro-dopamina e Poly (AA-co-AMPS-co-PEG) pode ser encontrada em nosso trabalho ^anterior16. O copolímero é feito através da polimerização radical livre. Adicionar 0,20 g de 2,2′-Azobis(2-metilpropionitrilo) (AIBN), 0,25 g de ácido acrílico (AA), 0,75 g de 2-Acrilamido-2-ácido sulfônico de metilpropano (AMPS) e 1,00 g de Polítil glicol (etileno glicol) acrilato de metila (PEG) em 10 mL de N,N-Dimetilformamida (DMF). Aqueça a mistura em um banho de água de 70 °C por 1h e transfira para um saco de diálise (Membrana de Celulose, 3 kDa) na água. A razão de peso de AA, AMPS e PEG é de 1:3:4. A polimerização desses monômeros tem uma taxa de conversão de 100%, confirmada pela secagem e pesagem congelantes.

1. Combine 10 mL de nanopartículas purificadas (cerca de 100 mg) em um frasco de 20 mL com 10 mL de solução de N-[2-(3,4-dihidroxilfenil)etil]niramida (nitro-dopamina) (~1 mg/mL). Espere por 5 min.
2. Lave os MFCs revestidos de nitro-dopamina usando separação magnética. Despeje o supernatante amarelo-pálido. Adicione água e agite vigorosamente. Em seguida, despeje água usando o ímã para reter o produto. Repita esta lavagem várias vezes deixando a coleção marrom escura no frasco.
   NOTA: Prepare uma solução aquosa com concentração de 20 mg/mL, uma solução tampão com concentração de 100 mg/mL, e uma solução polímera poli (AA-co-AMPS-co-PEG) com concentração de 20 mg/mL.
3. Misture 1 mL de solução EDC, 1 mL de tampão MES e 3 mL da solução de polímero. Mexa levemente girando a mistura, e deixe descansar por aproximadamente 5 minutos. Deve ser uma solução clara e incolor quando totalmente combinada.
4. Adicione essa mistura à coleção MFC e coloque o frasco em um banho de gelo. Abaixe o sonicator da sonda na solução e ligue-o (250 watts de potência a 20 kHz).
   1. Após um tratamento de sonicação de 5 minutos, adicione cerca de 5 mL de água ultra-pura ao frasco enquanto o sonicator ainda está funcionando. Continue monitorando a embarcação para garantir que nenhum produto derrame. Mantenha o gelo na mistura de água gelada, pois parte do gelo inicial derreterá devido à intensidade e calor da sônicação.
   2. Deixe a mistura sonicar por mais 25 minutos, totalizando 30 min.
5. Coloque o frasco em cima de um ímã para separar os MFCs e despeje a solução sobrenatante.
6. Lave os MFCs modificados com água desionizada várias vezes.
7. Encha o frasco contendo os MFCs com água ultra-pura. Pipeta este fluido em um sistema de filtragem de vácuo com um filtro de membrana de polietroéfone de 0,1 μm para remover quaisquer MFCs irreversivelmente agregados. Certifique-se de lavar as paredes do funil para minimizar qualquer perda do produto.
8. Filtro de vácuo a solução. Repita este processo 2-3 vezes. O resultado será uma solução aquosa purificada de MFCs monodispersed.
   NOTA: Cerca de 10% do produto será irreversivelmente agregado e este material permanecerá no filtro e deve ser descartado.

Após o tratamento hidrotérmico, a mistura de reação se transforma em uma dispersão negra viscosa como pode ser visto na Figura 1. O que resulta após a purificação é uma solução MFC altamente concentrada que se comporta como um ferrofluido. O fluido no frasco responde em segundos quando colocado perto de um ímã portátil (<0,5 T), formando uma massa negra macroscópica que pode ser movida à medida que o ímã é colocado em diferentes locais.

Esta síntese produz produtos cuja dimensão e composição ferrita dependem da quantidade de água adicionada e da razão de manganês ao precursor de ferro na mistura de reação. A Figura 2 ilustra como a morfologia do cluster depende da água e da concentração precursora; também detalha as condições de reação utilizadas para obter as amostras listadas na Tabela 1. Descobrimos que o diâmetro do MFC é afetado pela quantidade de água adicionada, e a composição do MFC depende da razão de ferro e manganês nos precursores. Ambos os parâmetros podem, portanto, ser controlados independentemente para fazer uma biblioteca de MFCs com dimensões distintas e conteúdo de manganês.

Embora este seja um procedimento sintético muito simples, erros na execução do método podem levar a produtos com falha. A Figura 3 retrata amostras com morfologias irregulares de MFC. Na Figura 3A, os MFCs de forma ímpar resultam se a água for completamente excluída do ambiente de reação. A falta de água dificulta a montagem dinâmica dos nanocristais primários e resulta em uma distribuição muito ampla da dimensão do nanocíster e formas não esféricas16. As amostras apresentadas na Figura 3B apresentaram tempo de reação insuficiente (6-12 h) e, como resultado, não apresentaram crescimento nanocristal primário suficiente. Esses resultados ruins demonstram que uma quantidade adequada do reagente, bem como o tempo de reação, é necessária para alcançar clusters consistentes e uniformes.

Após a conclusão da síntese hidrotérmica, os MFCs ferrita foram separados e purificados por meio da separação magnética. Um ímã foi colocado sob a solução para forçar sua coleta no fundo do vaso. Impurezas e subprodutos não magnéticos formados na síntese, juntamente com o excesso de solvente, poderiam então ser decantados para produzir MFCs 27 puros e monodispersados. A Figura 4 ilustra o tempo necessário para uma coleta magnética quase completa dos MFCs com e sem a adição de lã de aço. A lã de aço colocada no frasco durante a separação magnética aumenta o gradiente do campo magnético dentro do frasco, permitindo uma separação muito mais rápida28.

Os MFCs purificados usando separação magnética mostram um alto grau de uniformidade em comparação com aqueles purificados usando um processo de ultracentrifugação mais convencional. A Figura 5 mostra a distribuição de tamanho dos MFCs obtidos por meio da separação magnética (A e B) em comparação com aqueles que usam ultracentrifugação (5.000 g por 30 min) (C e D). A separação magnética resulta em uma distribuição mais estreita do diâmetro do cluster em comparação com a ultracentrifugação e é a estratégia de purificação preferida para os MFCs.

Os MFCs sintetizados são revestidos com poliacrilato (PAA), que fornece uma superfície carregada negativamente e algum grau de repulsão interpartícula que impede a agregação interparticulas (Figura 6A). No entanto, realizando uma reação de substituição de ligantes com nitrodopamina (Figura 6B), podemos substituir o revestimento PAA por um revestimento copolímero de P(AA-co-AMPS-co-PEG), o que permite maior estabilidade em soluções de maior resistência iônica. A Figura 7 mostra o esquema deste processo de funcionalização superficial. A estabilidade coloidal dos MFCs dispersos em um tampão PBS é aparente na Figura 8. MFCs sintetizados revestidos com PAA rapidamente agregados e separados da solução dentro de 30 minutos e são de pouca utilidade em aplicações biológicas. Em contrapartida, os MFCs funcionais com um revestimento polissulfonato permaneceram bem dispersos nesta solução por mais de 2 dias sem qualquer sinal de agregação. A modificação da superfície pós-síntese descrita aqui fornece uma rota para a formação de soluções homogêneas de MFCs apropriadas para introdução em ambientes biológicos.

Figura 1: O esquema para a síntese de nanoaglomerados de ferrite de manganês. Os reagentes, cloreto de ferro(III), cloreto de manganês(II), ácido poliacrílico (PAA), ureia, água e etileno glicol são combinados em condições hidrotermais para produzir os nanoaglomerados de ferrite de manganês. Este produto forma uma solução coloidal estável em água pura, como mostrado no meio. A quantidade de água adicionada na síntese e a razão entre manganês e ferro nos precursores são usadas para ajustar o tamanho do cluster e a composição do ferrite, respectivamente. Após a separação magnética, os nanoaglomerados formam um ferrofluido como mostrado à direita, indicando que são altamente responsivos até mesmo pequenos campos magnéticos aplicados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens do microscópio eletrônico de transmissão (TEM) dos nanoaglomerados de ferrite de manganês e suas distribuições de diâmetro. Nas imagens A-D, o diâmetro do cluster (Dc) aumenta como resultado da redução da quantidade de água adicionada na síntese. O diâmetro médio do cluster é de 31, 56, 74 e 120 nm para A, B, C e D, respectivamente, com composição constante de Mn0.15Fe2.85O4. Nas imagens E-H, a composição da ferrita muda monotonicamente em proporção à razão Mn/Fe dos precursores. Apesar de suas diferentes composições, um diâmetro de cluster quase equivalente é alcançado. Nossa síntese permite controle independente sobre o diâmetro do cluster e a composição ferrita, ambas características que são importantes para as propriedades magnéticas dos ferrites nanoescala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Condições de reação para a síntese das amostras de nanoaglomerados mostradas na Figura 2. Outros parâmetros de síntese são: 20 mL glicol de etileno, 250 mg de PAA e 1,2 g de ureia. As misturas de reação são hidrotermicamente aquecidas a 200 °C por 20 h. Para A, B, C e D, diminuir o teor de água, mantendo outros parâmetros constantes resultou em aglomerados de diâmetros maiores. Para E, F, G e H, o aumento da razão de MnCl2to FeCl3in a mistura de reação inicial resultou em clusters com maiores proporções de manganês na estrutura do cluster. Variar a quantidade de água E, F, G e H ao mesmo tempo permite agrupamentos de diferentes composições, mas diâmetros quase equivalentes.

Figura 3: Imagens TEM de reações falhadas e incompletas. As pequenas características de contraste baixas observadas nessas imagens são nanocristais primários que não se desenvolveram em nanoglomerados. A amostra na Figura 3A foi preparada sem água adicional, enquanto o material mostrado na Figura 3B teve um tempo de reação insuficiente, de quatro horas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Comparação da separação magnética dos nanoaglomerados. Comparação da separação magnética de nanoaglomerados sem (A) e com (B) a adição de lã de aço no recipiente. A lã de aço aumenta o gradiente do campo magnético dentro do frasco para permitir uma separação magnética mais rápida dos nanoaglomerados. Como resultado, é possível ampliar a produção de nanoaglomerados de forma eficiente sem sacrificar a qualidade da amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Comparação da ultracentrifugação e separação magnética. Comparação da ultracentrifugação (A,B) e separação magnética (C,D) e seu impacto na uniformidade dos aglomerados purificados. A e C são as imagens TEM dos clusters purificados, e B e D são as distribuições de tamanho dos clusters em A e C, respectivamente. O eixo y representa o número de clusters contados, e para cada amostra, foram pesquisados um total de 150 clusters. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: A estrutura de poli(ácido acrílico) (PAA) (A) e nitro-dopamina (B) utilizada na etapa de modificação da superfície. O revestimento inicial de PAA usado na síntese não é ideal em mídia biológica ou ácida devido, pois o ácido carboxílico é facilmente protoado. Nitro-dopamina é usado para substituir o revestimento PAA criando um grupo funcional para ancorar um copolímero sulfoto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Esquemas do processo de modificação da superfície do cluster. (A) revestimento PAA original, (B) revestimento intermediário de nitro-dopamina e (C) o revestimento P (AA-co-AMPS-co-PEG). Em (C), as curvas azul, vermelha e verde representam as unidades AA, AMPS e PEG, respectivamente. A composição do cluster pode ser Fe3O4 ou MnxFe3-xO4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: A funcionalidade superficial dos nanoaglomerados com polisulfonato leva a materiais que são coloidalmente estáveis sob muitas condições aquosas diferentes. Os clusters com dois revestimentos de superfície diferentes, como sintetizado, a superfície revestida de PAA (A) e P(AA-co-AMPS-co-PEG) são dissolvidas na solução tampão PBS que é relevante para configurações biológicas e observada para sua estabilidade coloidal ao longo do tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.