O presente protocolo descreve um método para rastrear a progressão do lúpus em camundongos. Dois procedimentos adicionais são apresentados para caracterizar a nefrite lúpus com base na infiltração celular e na deposição de proteínas nos rins.
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Artigo de método
Análises de Proteinúria, Infiltração Renal de Leucócitos e Deposição Renal de Proteínas em Camundongos MRL/lpr propensos a Lúpus
Neste artigo
Resumo
Resumo
O lúpus eritematoso sistêmico (SLE) é uma doença autoimune sem cura conhecida e é caracterizada por inflamação persistente em muitos órgãos, incluindo os rins. Sob tais circunstâncias, o rim perde sua capacidade de limpar resíduos do sangue e regular concentrações de sal e fluidos, eventualmente levando à insuficiência renal. As mulheres, particularmente as em idade fértil, são diagnosticadas nove vezes mais frequentemente do que os homens. A doença renal é a principal causa de mortalidade em pacientes com SLE. O presente protocolo descreve um método rápido e simples para medir os níveis de proteína excretada na urina coletada, acompanhando a progressão do lúpus ao longo do tempo. Além disso, uma abordagem para isolar as células mononucleares renais é fornecida com base na seleção de tamanho e densidade para investigar a infiltração renal de leucócitos. Além disso, um método imunohistoquímico foi desenvolvido para caracterizar a deposição proteica na infiltração glomeruli e leucócito no espaço tubulointersticial. Juntos, esses métodos podem ajudar a investigar a progressão da inflamação crônica associada aos rins de camundongos mrl/lpr propensos ao lúpus.
Introdução
A função primária do rim é a eliminação de substâncias tóxicas através da urina, mantendo a homeostase da água e sais1. Esta função está ameaçada em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (SLE), levando à chamada nefrite lúpus (LN). A LN é uma consequência do sistema imunológico atacar o rim, levando a inflamações renais persistentes, perdendo assim sua capacidade de limpar resíduos do sangue e regular concentrações de sal e fluidos. Isso eventualmente levará à insuficiência renal, que pode ser fatal. Durante o processo nefrástico, células B circulantes, células T e monócitos são recrutados para o rim, secretando quimiocinas, citocinas e aut....
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Protocolo
O presente protocolo é aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Virginia Tech. Como a doença de lúpus tem maior incidência em fêmeas, apenas os camundongos femininos mrl/lpr foram utilizados. A coleta de amostras foi iniciada com 4 semanas de idade e terminada com 15 semanas. Os camundongos foram obtidos a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) e foram criados e mantidos em um ambiente específico livre de patógenos seguindo as diretrizes institucionais.
1. Teste de proteinúria
- Coletar urina seguindo os passos abaixo.
- Esterilize o capô pulveri....
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Resultados
O protocolo utiliza vários métodos para avaliar camundongos MRL/lpr para nefrite lúpus. Primeiro, um procedimento é descrito para estudar o aumento dos níveis de proteinúria devido à disfunção renal ao longo do tempo. Como mostrado na Figura 1, os camundongos fêmeas foram tratados com gavage oral de 200 μL de soro fisco tamponado (1x PBS) como o grupo controle e o probiótico Lactobacillus reuteri como o grupo de tratamento, numa concentração de 109 cfu/mL, duas vezes por .......
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Discussão
A LN é uma das principais causas de mortalidade em pacientes com SLE, e os fatores que agravam a doença permanecem incertos. A aplicação deste protocolo é caracterizar a função renal utilizando múltiplos métodos, incluindo medição de proteinúria, análise FACS de leucócitos renais isolados e coloração de imunofluorescência de seções renais congeladas.
Um ponto importante a considerar durante a coleta de urina é que é preciso ser consistente com a hora do dia e a localização da coleta de urina. .......
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Divulgações
Os autores declaram que não há conflito de interesses.
Agradecimentos
Agradecemos ao Centro de Citometria de Fluxo, ao Laboratório de Histopatologia, ao Centro de Imagem Fralin do Instituto Politécnico da Virgínia e à Universidade Estadual pelo apoio técnico. Este trabalho é apoiado por várias subvenções internas e do NIH.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10x Tris-Buffered Saline (TBS) | Thermo Fisher Scientific | J60764. K2 | |
| 2-mercaptoetanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Anti-Humano/Rato C3 | Cedarlane | CL7632F | |
| Anti-Rato CD138 BV711 | Biolegend | 142519 | |
| Anti-Rato CD45 AF700 | Biolegend | 103127 | |
| Soro Bovino Albumina | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Microscópio | 11088882001 | Sigma-Aldrich | |
| LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
| Frasco de Coplin | Fisher Scientific | 50-212-281 | |
| Cryomold | Fisher Scientific | NC9511236 | |
| Gradiente de densidade médio | GE Healthcare | 17-1440-02 | Percoll |
| DEPC-Água | tratada Thermo Fisher Scientific | AM9906 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| dsDNA-EC | InvivoGen | tlrl-ecdna | |
| Ácido etilenodiaminotetracético | Fisher Scientific | S311-500 | EDTA |
| EVOS M5000 Sistema de imagem de microscópio | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | |
| FACS Fusion Cell classificador | BD Biosciences | FACS Fusion | |
| Fetal Soro Bovino - Premium, Inativado por Calor | R& D systems | S11150H | |
| Placas de Poliestireno de 96 Poços Fisherbrand | Prisma Graphpad Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| GraphPad N | /A | ||
| Hank' s Solução salina balanceada | Thermo Fisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Software ImageJ | National Institutes of Health | N/A | |
| Lactobacillus reuteri Kandler et al. | ATCC | 23272 | |
| MEM aminoácidos não essenciais | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| MRL/MpJ-Fas lpr /J Ratos (MRL/lpr) | Jackson Lab | 485 | |
| Esmalte de unhas | N/A | N/A | Qualquer loja convencional |
| O.C.T composto | Tisse-Tek | 4583 | |
| PAP caneta | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Moldes de incorporação descartáveis Peel-A-Way | Polysciences | R-30 | |
| Penicilina-estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 70011069 | |
| Pierce 20x TBS Buffer | Thermo Fisher Scientific | 28358 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Kit | de ensaioThermo Fisher Scientific | 23236 | Padrão de albumina incluído |
| ProLon Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Purificado Rato Anti-Rato CD16/CD32 | BD Biosciences | 553141 | bloco FcR |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Piruvato de sódio | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.1 software |
| Filtros de células estéreis 100 µ M | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Cloridrato de Vancomicina | Goldbio | V-200-1 | |
| Zombie Aqua | Biolegend | Corante | fluorescente 423102 para análise de citometria de fluxo |
Referências
- Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
- Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
- Maldonado, M. A., et al.
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Reimpressões e permissões
