Análises de Proteinúria, Infiltração Renal de Leucócitos e Deposição Renal de Proteínas em Camundongos MRL/lpr propensos a Lúpus

A função primária do rim é a eliminação de substâncias tóxicas através da urina, mantendo a homeostase da água e sais¹. Esta função está ameaçada em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (SLE), levando à chamada nefrite lúpus (LN). A LN é uma consequência do sistema imunológico atacar o rim, levando a inflamações renais persistentes, perdendo assim sua capacidade de limpar resíduos do sangue e regular concentrações de sal e fluidos. Isso eventualmente levará à insuficiência renal, que pode ser fatal. Durante o processo nefrástico, células B circulantes, células T e monócitos são recrutados para o rim, secretando quimiocinas, citocinas e autoanticorpos de formação de complexos imunológicos. Isso resulta em danos nas células endoteliais, lesões membranous, atrofia tubular renal e fibrose².

MRL/Mp-Fas^lpr (MRL/lpr) é um modelo clássico de rato que exibe sinais clínicos semelhantes ao lúpus que se assemelham ao SLE³ humano. Este modelo tem sido fundamental na compreensão de uma das principais causas de mortalidade em pacientes com SLE, a nefrite lúpus (LN)⁴. Tanto no SLE humano quanto no camundongo, a LN é caracterizada por inflamação gradual desencadeada pela deposição renal de complexos imunológicos, seguida de ativação complementar, recrutamento de células inflamatórias e perda da função renal⁵. A deposição do complexo imunológico é o primeiro passo para induzir a produção de quimiocina e citocinas por células renais intrínsecas, o que expande a resposta inflamatória recrutando células imunes⁶. O protocolo atual apresenta várias técnicas para acompanhar a progressão da doença renal que analisam a infiltração celular e a deposição do complexo imunológico.

A urina coletada toda semana permite a detecção e visualização do curso de tempo de proteinúria antes, durante e depois do início do lúpus. Proteinúria como biomarcador pode determinar a progressão biológica da LN. Outras vantagens dessa técnica são que ela é não invasiva, econômica e fácil de implementar⁷. Quando o rim está funcionando perfeitamente, o nível de proteinúria é consistentemente baixo; no entanto, em camundongos MRL/lpr, após 8-9 semanas de idade, observa-se um aumento gradual do nível de proteinúria, que eventualmente é alto o suficiente para causar insuficiência renal⁸. Várias tiras de reagente e reagentes colorimétricos estão disponíveis comercialmente para monitorar o problema. No entanto, o ensaio de Bradford é barato e muito preciso na determinação do aparecimento de proteinúria e o curso de nefrite lúpus. Este ensaio é rápido, e o reagente não é afetado pela presença de solventes, buffers, agentes de redução e agentes de corte de metal que podem estar em sua amostra ^9,10,11.

Um aspecto importante a considerar é a infiltração celular no rim. Esses infiltrados promovem a patogênese desencadeando a secreção de fatores solúveis, como citocinas, para piorar a inflamação¹². Para entender melhor quais populações celulares estão presentes nos infiltrados, um método útil é isolar os leucócitos¹³. Aqui, a detecção de infiltração renal de células B é usada como exemplo. O procedimento começa com um processo de digestão com desoxyribonuclease (DNase) e colagenase, seguido pela separação gradiente de densidade que remove detritos, glóbulos vermelhos e granulócitos densos. A razão para isolar células B (CD19⁺) e células plasmáticas (CD138⁺) é que os rins de lúpus podem concentrar essas células¹⁴. Sugere-se que a presença de células B em pequenos agregados no rim pode indicar expansão clonal e, consequentemente, produção de imunoglobulina (Ig). As células plasmáticas são bem conhecidas por estarem presentes nestes agregados, bem como¹⁵. Uma vez que os leucócitos tenham sido isolados, a triagem celular ativada pela fluorescência (FACS) pode ser usada para analisar as células de interesse ao coloração com diferentes anticorpos conjugados pela fluorescência.

A imunofluorescência é um dos métodos de detecção de imunohistoquímica (IHC) que permite a visualização fluorescente de proteínas em amostras de tecido renal de 4 μm de espessura. Outros métodos de detecção de IHC dependem da natureza dos analitos, química de vinculação e outros fatores¹⁶. A imunofluorescência é um método de identificação rápida que expõe o antígeno ao seu anticorpo de contrapartida rotulado com um fluorocromo específico (ou um corante fluorescente). Quando excitado, produz luz que um microscópio de fluorescência pode detectar. Esta técnica pode ser usada para observar a deposição do complemento C3 e IgG2a¹⁷. A ativação excessiva da cascata de complementos pode estar associada a uma resposta imune descontrolada e perda de função¹⁸. A deposição imune de autoanticorpos de DNA anti-dsDNA (anti-dsDNA) no rim é uma grande preocupação¹⁹, onde aqueles com isótipo IgG2a foram associados com LN²⁰. Especificamente, anticorpos anti-dsDNA apresentam mais patogenicidade e afinidade com materiais nucleares, formando complexos imunológicos²¹. Quando o IgG2a está presente, a cascata complementar, incluindo c3, é ativada para limpar os complexos imunológicos²². Os marcadores C3 e IgG2a podem ser quantificados individualmente ou sobrepostos para estabelecer sua correlação.

Notavelmente, a medição da creatinina sé serum é outra técnica confiável que pode ser usada em conjunto com hematuria microscópica e biópsias renais para diagnosticar LN²³. No entanto, a presença de proteinúria é um forte indicador de danos glomerulares. Nesse sentido, o monitoramento do nível de proteinúria durante o lúpus pode detectar o aparecimento da doença e complementar outros métodos para o diagnóstico de lúpus. Além disso, os complexos imunológicos depositados em glomeruli podem induzir uma resposta inflamatória, ativar o sistema complementar e recrutar mais células inflamatórias. Outro ponto importante deste protocolo é a infiltração de células B no rim. Isso, juntamente com as células T infiltradas, amplifica as respostas imunes locais que desencadeiam danos nos órgãos. É importante ressaltar que a classificação da LN não se baseia apenas em alterações morfológicas glomerulares vistas na microscopia, mas também depósitos imunológicos observados com imunofluorescência. Portanto, neste protocolo, métodos precisos e econômicos para a análise da função renal são oferecidos em ambientes laboratoriais.

O presente protocolo é aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Virginia Tech. Como a doença de lúpus tem maior incidência em fêmeas, apenas os camundongos femininos mrl/lpr foram utilizados. A coleta de amostras foi iniciada com 4 semanas de idade e terminada com 15 semanas. Os camundongos foram obtidos a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) e foram criados e mantidos em um ambiente específico livre de patógenos seguindo as diretrizes institucionais.

1. Teste de proteinúria

1. Coletar urina seguindo os passos abaixo.
   1. Esterilize o capô pulverizando 70% de etanol. Coloque uma folha de plástico estéril na superfície. Prepare dicas, tubos de 1,5 mL e uma pipeta para coletar cerca de 20 μL do líquido.
      NOTA: As pontas e os tubos devem ser estéreis e sem qualquer pré-tratamento.
   2. Pegue a gaiola e pulverize 70% de etanol antes de colocá-lo dentro do capô.
   3. Segure o mouse com uma mão e use a outra mão para massagear a área ventral de cima para baixo suavemente.
   4. Use um tubo de 1,5 mL ou pipeta para coletar a urina diretamente, ou se a amostra cair, recolhê-la da folha de plástico. Use luvas frescas, lençóis e dicas para cada amostra.
      NOTA: Se isso não funcionar, use um béquer estéril para isolar o mouse e, em seguida, coletar a urina do béquer depois que o rato urinar.
   5. Coloque o rato de volta na jaula. Pegue outro mouse e repita as etapas 1.1.3-1.1.4.
      NOTA: Limpe sempre a folha de plástico e o béquer com 70% de etanol após a coleta da amostra para cada rato. Pelo menos cinco camundongos por grupo são necessários para significância estatística. As amostras de urina podem ser armazenadas a -80 °C até o uso por até 12 meses.
2. Quantifique as proteínas pelo método Bradford²⁴.
   1. Permita que amostras de urina, padrão Albumina e o reagente bradford cheguem à temperatura ambiente (RT) mantendo-as fora do congelador por 10-20 minutos.
      NOTA: O reagente de Bradford e o padrão Albumin estão incluídos em um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). A concentração inicial do padrão Albumin é de 2 mg/mL. Diluições seriais (1:2 seis vezes) devem ser feitas com água.
   2. Adicione o reagente bradford a uma placa de 96 poços (200 μL/well), não diluída.
   3. Pipeta 5 μL de amostra de urina não diluída por poço e use a ponta para pipetar para cima e para baixo várias vezes para misturar corretamente.
   4. Adicionar padrões (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg/dL) em duplicatas. Deixe alguns poços como espaços em branco.
      NOTA: A adição de amostras e normas precisa ser feita rapidamente.
   5. Deixe-o ficar por 5-10 min na RT.
   6. Leia a placa a 595 nm em um leitor de placas de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais).

2. Isolamento das células renais

1. Eutanize o camundongo com CO₂ (taxa de fluxo: 30%-70% de volume/min, para alcançar inconsciência ou morte) em uma câmara seguida de deslocamento cervical. Prossiga com a dissecação para coletar os dois rins. Coloque um rim e meio em um meio C10 gelado. Coloque a outra metade do rim em OUTUBRO (etapa 3.1.1).
   NOTA: C10 é feito com RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal de 10%, 1 mM de piruvato de sódio, 1% de aminoácidos não essenciais mem de 100x, 10 mM de HEPES, 55 μM de 2-mercaptoetanol e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina (ver Tabela de Materiais).
2. Corte os rins em tamanho de grão (1-2 mm³ pedaços) e digerir em 5 mL de tampão de digestão contendo 1 mg/mL de colagenase e 0,2 mg/mL de DNase I (ver Tabela de Materiais) em RPMI 1640 médio contendo 10 mmol/L de HEPES para 1h com agitação suave contínua a 37 °C.
   NOTA: Adicione 1 mL de tampão de digestão em um tubo estéril de 2 mL e use uma tesoura estéril para cortar o rim.
3. Adicione 10 mL de PBS gelado de 1x contendo 10 mM de ácido etilenodiaminatotraacético (EDTA) e incubar por 10 minutos no gelo. Em seguida, vórtice a suspensão duas vezes.
4. Filtre a suspensão da célula através de um coador de 100 μM e lave com 10 mL de HBSS cheio.
   NOTA: O HBSS completo contém 5 mM de EDTA, 0,1% BSA e 10 mM de HEPES.
5. Centrifugar a 350 x g por 10 min no RT.
6. Prepare 30%, 37% e 70% solução Isotônica Percoll (SIP).
   NOTA: Misture 1 parte do volume de 10x PBS e 9 partes de volume de Percoll para preparar OIP (ver Tabela de Materiais); usar HBSS-full para diluir SIP para 30%, 37% e 70% SIP.
7. Resuspend células em 5 mL de 30% SIP e carga 37% de 5 mL (superior) e 70% de 5 mL (inferior), fazendo gradiente SIP, lentamente com uma pipeta pasta.
8. Centrifugar com Up9 down0 (ou freio 0) a 1000 x g por 30 min no RT.
9. Colete leucócitos da interface 37%-70% e resuspensá-los em 5 mL de C10.
10. Centrifugar a 350 x g por 10 min a 4 °C.
11. Resuspenda a pelota de célula em 3 mL de tampão FACS. As células estão prontas para coloração FACS.
    NOTA: O buffer FACS contém 1x PBS e 0,1% Bovine Serum Albumin (BSA).
12. Centrifugar a 350 x g por 5 min a 4 °C e descartar o supernadante (SN), deixando cerca de 50 μL.
    NOTA: Para remover o supernaspe, despeje cuidadosamente ou pipeta a solução longe do sólido ou use um vácuo semiautomático para aspirar o supernaspe.
13. Adicionar 50 μL de bloco FcR (ver Tabela de Materiais) por tubo (prediluted 1/50 em 1x PBS); misturar e incubar no gelo no escuro por 10 minutos.
14. Adicione 2 mL de tampão FACS para lavar.
15. Centrifugar a 350 x g por 5 min a 4 °C e descartar SN, deixando cerca de 50 μL.
16. Adicione 20 μL do corante fluorescente apropriado (diluir 1/100 com 1x PBS, ver Tabela de Materiais) e deixe-o ficar por 15-30 min no gelo.
17. Adicione 50 μL de anticorpo¹⁵ mix por tubo: CD138-BV711 (1/200 em 1x PBS) e CD45-AF700 (1/200 em 1x PBS) (ver Tabela de Materiais).
18. Incubar no gelo no escuro por 15-30 min e adicionar 3 mL de tampão FACS.
19. Centrifugar a 350 x g por 5 min a 4 °C e aspirar SN, deixando cerca de 50 μL. Resuspend em 200 μL de 1x PBS. Isso agora está pronto para ser analisado por citometria de fluxo.

3. Coloração imunofluorescente

1. Faça a coleta de amostras.
   1. Incorpore o meio rim no pequeno criomold plástico com o composto de temperatura de corte ideal (OCT) (ver Tabela de Materiais).
   2. Adicione gelo seco em uma caixa de espuma de poliestireno (ver Tabela de Materiais), e coloque cuidadosamente o criomold em cima do gelo seco. Certifique-se de que os criomoldes sejam colocados em terra.
      NOTA: Leva de 3 a 4 minutos para o composto OCT se solidificar e ficar branco.
   3. Pegue o criomold e enrole-o em papel alumínio. Armazene-o a -80 °C até que seja mais útil.
      NOTA: Este pode ser armazenado a -80 °C por pelo menos 1 ano.
2. Realizar a secção e fixação da amostra.
   1. Corte as amostras em seções de 4 μm, espere pelo menos 2-3 h para secar e, em seguida, fixe com acetona fria (a 4 °C) por 10 minutos.
      NOTA: Tenha cuidado ao usar acetona, que requer uma capa química especializada.
   2. Depois de fixar os slides, o ar seque por 0,5-1 h e armazene-os por um curto período de tempo a -20 °C, ou por um longo tempo a -80 °C.
3. Manche as amostras.
   1. Refixe os slides em acetona fria por 5-10 min.
   2. Deixe as seções aquecerem para RT. Use uma caneta PAP (ver Tabela de Materiais) ao redor da seção e deixe secar.
      NOTA: O esmalte de unha também pode ser usado. Esta etapa evita que a diluição de anticorpos flutuasse por todo o escorregador.
   3. Coloque slides em 1x Salina tamponada tris (TBS) no frasco coplin (ver Tabela de Materiais) por 20 minutos, coloque o frasco no shaker e agite suavemente.
   4. Despeje 1x TBS e encha o frasco com 1x TBS, 5% BSA e 0,1% Tween 20. Incubar por 20 minutos no shaker, agite suavemente.
   5. Leve os slides para fora e limpe a parte inferior dos slides seco. Se necessário, agite as lâminas secas. Adicione 100 μL de anticorpos conjugados²⁵ C3-FITC (1/100) e IgG2a-PE (1/100) à seção (ver Tabela de Materiais). Incubar na RT em uma câmara umidificada por 1 h.
   6. Lave a seção 3 vezes em 1x TBS, 5% BSA e 0,1 % Tween 20 por 10 min no shaker.
   7. Agite os slides e monte a seção com um reagente antifade (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, um deslizamento de tampa.
   8. Armazene os slides a 4 °C até visualizar sob o microscópio (por exemplo, microscópio confocal ou microscópio do sistema de imagem). Quantifique imagens usando software e subtraia sinais de fundo ao comparar a intensidade de fluorescência entre regiões.
   9. Para análise de imagens usando o software ImageJ (ver Tabela de Materiais), delineie a região desejada.
   10. Defina parâmetros padrão clicando em Analisar e, em seguida, definir medidas e área de medida para obter os resultados.
   11. Transfira os dados obtidos das janelas de medida para uma planilha.
       NOTA: Uma pequena área pode ser selecionada a partir da imagem como um fundo; não deve ter fluorescência.
   12. Uma vez feito, clique em Analisar para medir a região e transferir dados novamente para a planilha anterior.
   13. Repetição de passos 3.3.11-3.3.12 para várias regiões.
   14. Calcule a fluorescência média como Fluorescência celular corrigida (CCF) = Densidade integrada - (Região celular selecionada x Fluorescência de fundo média).
   15. Calcule cada região e analise os dados utilizando o software de gráficos e estatísticas (ver Tabela de Materiais).

O protocolo utiliza vários métodos para avaliar camundongos MRL/lpr para nefrite lúpus. Primeiro, um procedimento é descrito para estudar o aumento dos níveis de proteinúria devido à disfunção renal ao longo do tempo. Como mostrado na Figura 1, os camundongos fêmeas foram tratados com gavage oral de 200 μL de soro fisco tamponado (1x PBS) como o grupo controle e o probiótico Lactobacillus reuteri como o grupo de tratamento, numa concentração de 109 cfu/mL, duas vezes por semana. O tratamento começou com 3 semanas de idade e terminou com 15 semanas de idade. O grupo de camundongos tratados com L. reuteri teve uma progressão de proteinúria mais agressiva do que o grupo controle.

Figura 1: Detecção de níveis de proteína na urina de camundongos MRL/lpr ao longo do tempo. n = 5 camundongos por grupo. As estatísticas foram realizadas com o simples teste de regressão linear. *P < 0,05, **P < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 2 mostra a análise FACS dos leucócitos renais isolados. Os camundongos foram tratados com vancomicina (2 g/L) ou vancomicina mais E. coli dsDNA (80 μg) neste experimento. A vancomicina foi dada juntamente com a água potável durante o período indicado. Gavage oral de DNA bacteriano foi administrado aos camundongos tratados com vancomicina uma vez por semana durante quatro semanas consecutivas aos 4, 5, 6 e 7 semanas de idade. Esperava-se que e. coli dsDNA desencadeasse a infiltração renal de células plasmáticas levando à função renal comprometida, mas nenhuma diferença significativa foi encontrada.

Figura 2: Análise de células plasmáticas em leucócitos renais isolados. (A) Estratégia de gating sequencial: células totais, células únicas, células vivas, células CD45+ e, finalmente, células CD138+ . (B) Percentual de células plasmáticas após tratamento com van (Vancomicina) ou van + DNA (Vancomicina + E. coli dsDNA) por 3 semanas (n ≥ 5 ratos por grupo). Não foi observada significância estatística ('ns'). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 3 mostra a coloração da imunofluorescência do complemento C3 e IgG2a em seções de rim mrl/lpr femininos. Neste experimento, o efeito dos fatores ambientais foi comparado quanto à deposição renal de C3 e IgG2a. Ratos internos foram criados na instalação de animais por várias gerações, e eles foram comparados com ratos recentemente comprados de um vendedor. A análise imunohistoquímica não mostrou diferença entre diferentes instalações.

Figura 3: Detecção de complemento C3 e IgG2a em seções renais via coloração de imunofluorescência. (A) Fotos representativas de seções renais manchadas com anti-C3-FITC (Verde) e anti-IgG2a-PE (Vermelho). (B) Comparação da fluorescência celular corrigida (CCF) entre os dois grupos (n ≥ 5 camundongos por grupo). Barra de escala = 100 μM. Não foi observada significância estatística ('ns'). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram que não há conflito de interesses.