Este protocolo descreve o modelo de isquemia cerebral focal transitória em camundongos através da oclusão intraluminal da artéria cerebral média. Além disso, exemplos de avaliação de resultados são mostrados usando ressonância magnética e testes comportamentais.
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Artigo de método
Modelo de Oclusão Transitória da Artéria Cerebral Média do Acidente Vascular Encefálico
Neste artigo
Resumo
Resumo
O AVC é uma das principais causas de morte ou incapacidade crônica em todo o mundo. No entanto, os tratamentos ideais existentes são limitados às terapias de reperfusão durante a fase aguda do acidente vascular cerebral isquêmico. Para obter informações sobre a fisiopatologia do AVC e desenvolver abordagens terapêuticas inovadoras, modelos in vivo de roedores de AVC desempenham um papel fundamental. A disponibilidade de animais geneticamente modificados tem impulsionado particularmente o uso de camundongos como modelos experimentais de AVC.
Em pacientes com acidente vascular encefálico, a oclusão da artéria cerebral média (ACM) é uma ocorrência comum. Consequentemente, o modelo experimental mais prevalente envolve a oclusão intraluminal da ACM, uma técnica minimamente invasiva que não requer craniectomia. Esse procedimento consiste em inserir um monofilamento através da artéria carótida externa (ECA) e avançá-lo através da artéria carótida interna (ACI) até atingir o ponto de ramificação da ACM. Após 45 min de oclusão arterial, o monofilamento é removido para permitir a reperfusão. Durante todo o processo, o fluxo sanguíneo cerebral é monitorado para confirmar a redução durante a oclusão e posterior recuperação após a reperfusão. Os resultados neurológicos e teciduais são avaliados por meio de testes comportamentais e estudos de ressonância magnética (RM).
Introdução
O AVC é uma doença devastadora que afeta aproximadamente 15 milhões de pessoas em todo o mundo anualmente, de acordo com a OMS. Cerca de um terço dos pacientes sucumbe à condição, enquanto outro terço experimenta incapacidade permanente. O acidente vascular encefálico (AVE) é uma patologia complexa que envolve vários tipos celulares, como células imunes neurais e periféricas, vasculatura e respostassistêmicas1. A intrincada rede de reações desencadeadas pelo AVC em nível de sistemas não pode ser replicada atualmente usando modelos in vitro . Assim, modelos animais experimentais são essenciais para aprofundar os mecanismos da doença e desenvolver e testar novas terapias. Atualmente, a reperfusão tecidual precoce é a única intervenção aprovada, seja por meio de trombólise com ativador de plasminogênio tecidual (tPA) ou trombectomia endovascular1.
Oclusões da artéria cerebral média (ACM) são frequentes em pacientes com acidente vascular encefálico. Consequentemente, modelos roedores de oclusão transitória da MCA (tMCAo) foram inicialmente desenvolvidos emratos2,3,4. Atualmente, camundongos geneticamente modificados são os animais mais utilizados em modelos experimentais de AVC. Neste estudo, descrevemos um modelo minimamente invasivo de tMCAo intraluminal em camundongos. A abordagem é realizada através da artéria carótida ao nível do pescoço, sem craniectomia.
A duração do período de oclusão é um fator crítico que determina a extensão da lesão isquêmica. Mesmo oclusões curtas de 10 min podem causar morte neuronal seletiva sem um infarto aparente, enquanto oclusões mais longas, tipicamente com duração de 30 a 60 min, resultam em algum grau de infarto cerebral. Ao contrário dos ramos proximal e distal da ACM que suprem o córtex e possuem colaterais, as artérias lentículo-estriatais que fornecem sangue para o estriado carecem de colaterais5. Como consequência, há maior redução do fluxo sanguíneo no estriado do que no córtex após a tMCAo. Assim, oclusões de 30 min ou menos geralmente afetam o estriado, mas não o córtex, enquanto oclusões mais longas, a partir de 45 min, frequentemente geram uma lesão isquêmica em todo o território da ACM, incluindo o estriado e o córtex dorsolateral.
Para garantir o bem-estar dos camundongos, administramos analgésicos antes do procedimento e usamos anestesia durante a cirurgia. No entanto, a anestesia pode potencialmente introduzir alterações artificiais na fisiologia do camundongo e afetar algumas medidas de desfecho6. A intervenção cirúrgica, quando realizada por pessoal experiente, geralmente dura cerca de 15 min para indução de MCAo. Posteriormente, o tempo total de anestesia depende do período de oclusão. Para experimentos em que minimizar a anestesia é crucial, uma etapa alternativa do procedimento envolve a interrupção da anestesia durante o período de oclusão e limitá-la apenas às etapas cirúrgicas para inserir e retirar o filamento que oclui a ACM. Essa abordagem reduz a duração da anestesia e minimiza seus potenciais efeitos artefatuais no modelo experimental 7,8. Portanto, o método de indução de isquemia focal transitória é apresentado pela oclusão intraluminal da ACM com duas variantes: com o camundongo anestesiado durante todo o período de oclusão ou com o camundongo acordado durante esse período. Em ambos os casos, uma cirurgia simulada deve ser realizada em paralelo com a intervenção realizada nos camundongos isquêmicos. Além disso, dados sobre a avaliação do desfecho são fornecidos medidos por testes comportamentais e ressonância magnética em vários momentos após a reperfusão. Finalmente, os principais fatores a serem considerados na implementação do procedimento experimental são discutidos.
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Protocolo
O trabalho com animais foi realizado seguindo as leis catalãs e espanholas (Real Decreto 53/2013) e as diretivas europeias, com aprovação do comitê de ética (Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA) da Universidade de Barcelona, e dos órgãos reguladores locais da Generalitat de Catalunya. Os estudos são reportados em conformidade com as diretrizes ARRIVE. Este procedimento foi projetado para ser realizado em camundongos adultos, a partir de 8 semanas de idade, sem limite de idade. Exemplos do procedimento cirúrgico desenvolvido em camundongos C57BL/6 de 10-12 semanas de idade são fornecidos aqui. Diferenças anatômicas dependendo da cepa do camundongo devem ser consideradas.
1. Preparo dos animais
- Antes de iniciar o procedimento cirúrgico, reúna e esterilize todos os materiais e ferramentas necessários. Monte a mesa cirúrgica com todos os materiais cirúrgicos necessários (listados na Tabela de Materiais).
- Anestesiar o animal por inalação de isoflurano em mistura de oxigênio e óxido nitroso (30%/70%).
- Administrar buprenorfina (ver Tabela de Materiais) por via subcutânea na dose de 0,05 mg/kg PV para proporcionar analgesia e aliviar qualquer dor e desconforto.
NOTA: A analgesia é obrigatória, mas protocolos diferentes são aceitos. Os sinais de dor e desconforto também devem ser controlados durante os primeiros dias após a MCAo (ver passo 4). Aplicar soluções corretivas quando necessário. - Colocar o animal em caixa de indução anestésica (ver Tabela de Materiais) com isoflurano a 5% até atingir um estado de anestesia profunda (perda do reflexo na punção da pata e reflexo ocular).
- Posicione o mouse sobre a mesa cirúrgica e diminua o nível de isoflurano para 1,5%, administrado por máscara facial. Aplique pomada veterinária para evitar o ressecamento dos olhos durante o procedimento.
- Manter a temperatura corporal em 37 ± 0,5 °C controlada por uma sonda retal conectada a uma almofada de aquecimento (ver Tabela de Materiais).
- Faça a barba na parte ventral do pescoço e na cabeça (calvária) com uma navalha elétrica. Remova cuidadosamente os restos de pelos e desinfete as áreas da pele três vezes em movimentos circulares com desinfetante à base de iodo e álcool a 70%.
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2. Avaliação do fluxo sanguíneo cerebral (FSC) com Dopplerfluxometria a laser (FDL)
- Com tesoura, faça uma incisão na pele da cabeça, na direção da sutura sagital, das orelhas até a área entre os olhos.
- Retrair a pele e remover o periósteo do lado direito do crânio.
- Encontre as coordenadas (2,5 mm laterais do Bregma) e fixe o suporte Doppler (ver Tabela de Materiais) usando cianoacrilato. Depois que a cola secar, conecte a sonda Doppler e verifique a leitura correta do sinal.
3. Oclusão transitória da artéria cerebral média (tMCAo)
- Vire o mouse para a posição supina e fixe-o na mesa cirúrgica com fita adesiva.
- Faça uma incisão na linha média do pescoço. Recuar lateralmente a pele e as glândulas salivares usando afastadores (ver Tabela de Materiais) para expor o território carotídeo.
- Identificar a anatomia vascular da artéria carótida comum (ACC), da ACI e da ECA, bem como as diferentes artérias delas derivadas (maxilar e lingual, tireoide superior, occipital e pterigopalatina) (Figura 1A).
- Desprenda as artérias principais do tecido conjuntivo adjacente para que possam ser manuseadas.
NOTA: Tome cuidado especial para não danificar os nervos, especialmente o nervo vago, que corre paralelamente ao CCA. - Envolver uma sutura de seda 6-0 (ver Tabela de Materiais) ao redor da ECA na bifurcação maxilar/lingual. Aperte bem um nó para interromper permanentemente a circulação.
- Passar uma segunda sutura ao redor da mesma artéria, entre o primeiro nó e a bifurcação da ACC, e manter esse nó solto.
- Coloque um terceiro fio ao redor do CCA e amarre um nó deslizante que pode ser facilmente desatado.
OBS: Isso também pode ser realizado com um clipe vascular, mas o fio permite mais movimento e flexibilidade. Nesta etapa é possível observar uma primeira diminuição do FSC no sinal da FDL. - Coloque um clipe vascular (ver Tabela de Materiais) interrompendo a circulação sanguínea a partir do ICA.
- Faça uma pequena incisão na ECA, próximo à área onde o nó apertado está localizado.
- Insira o monofilamento até que o revestimento espesso tenha entrado completamente na luz arterial.
- Aperte o segundo nó para segurar o monofilamento dentro da artéria e evitar que a pressão exercida pelo sangue o empurre para fora (Figura 1B).
- Remova o clipe vascular do ICA.
- Corte o ECA abaixo do primeiro nó e gire o coto para orientá-lo em direção à ACI (Figura 1C).
- Avançar o monofilamento através do ICA até o ponto onde o MCA se ramifica.
NOTA: A oclusão é refletida em uma queda abrupta do fluxo sanguíneo na leitura do LDF. Consideramos sucesso a oclusão quando a queda do FSC for maior que 70% do valor basal. Se os sistemas de medição do FSC não estiverem disponíveis, o ponto de oclusão pode ser notado pela resistência ao avanço, que em camundongos adultos geralmente está a cerca de 11 mm da bifurcação da CCA.- Se a anestesia for continuada durante o período de oclusão, monitorar o camundongo e mantê-lo sob observação constante por 45 min.
- Caso o camundongo seja acordado durante o período de oclusão, suture a pele do pescoço com vários pontos. Sem desconectar a sonda de FDL, coloque o mouse na caixa com temperatura controlada, permitindo a recuperação da anestesia.
NOTA: É comum que o camundongo apresente comportamento de circular espontâneo durante esse período, indicativo de oclusão bem-sucedida. - Após 40 min, anestesiar novamente o rato seguindo os mesmos procedimentos de anestesia e desinfecção indicados nos pontos 1.4, 1.5 e 1.7. Coloque-o de volta na mesa cirúrgica e retire os pontos do pescoço.
- Após 45 min de oclusão, solte o nó mantendo o monofilamento no lugar. Puxe lenta e suavemente o filamento e verifique se ocorre a recanalização do tecido.
- Puxe o filamento e aperte o nó para evitar a perda de sangue.
- Desamarre o nó do CCA. Certifique-se de que não há danos na parede arterial.
- Remova os afastadores e reposicione os músculos, glândulas e pele. Sutura a pele (6-0) e aplicação de desinfetante.
- Desconecte a sonda Doppler e retire o suporte. Sutura e desinfecção da pele da cabeça.
- Durante o período de recuperação da anestesia, deixe o rato numa gaiola equipada com um aquecedor para manter a temperatura. Mantenha-o sob observação constante até que esteja totalmente recuperado da anestesia. Após a recuperação, o rato pode ser devolvido à sua gaiola.
NOTA: Habitação com enriquecimento social é altamente recomendada. No entanto, nunca misture camundongos operados com camundongos não operados na mesma gaiola sem qualquer separação física, a fim de evitar agressão.
4. Cuidados pós-operatórios
- Supervisionar periodicamente os animais seguindo os procedimentos e normas estabelecidas de acordo com as normas locais. Fornecer tratamento analgésico no horário adequado para minimizar a dor após a cirurgia.
LEGENDA: No presente estudo, o mesmo analgésico foi aplicado no início da intervenção (Buprenorfina 0,05mg/kg PV) 6 h e 24 h após a cirurgia. - Realizar a eutanásia quando os parâmetros de supervisão assim o indicarem, seguindo os protocolos aprovados institucionalmente.
- Monitorar diariamente o peso dos animais. Fornecer ração macia aos animais durante os primeiros dias após a cirurgia. Além disso, hidratá-los por injeção subcutânea de soro fisiológico (200 μL) imediatamente após a cirurgia e periodicamente depois se for observado que o camundongo não se hidrata sozinho. Organize comida e água de forma que seja facilmente acessível ao animal.
- Uma vez concluído o estudo in vivo , anestesiar os camundongos, eutanasiá-los e remover o tecido cerebral para análise histopatológica adicional (se necessário).
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Resultados
Existem diferentes abordagens para avaliar o resultado do procedimento de tMCAo. Métodos de neuroimagem (RM) in vivo e testes comportamentais são utilizados aqui.
Camundongos desenvolvem lesões isquêmicas no cérebro, afetando principalmente o território suprido pela ACM ipsilateral à oclusão, como o estriado e o córtex dorsolateral. Existem vários métodos para determinar a extensão da lesão, incluindo a coloração tecidual com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC), coloração histol...
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Discussão
O procedimento de tMCAo intraluminal é o modelo mais comumente utilizado de isquemia cerebral focal com reperfusão em pesquisa básica. Atualmente, camundongos são o modelo animal preferido devido à disponibilidade de linhagens geneticamente modificadas. No entanto, é essencial reconhecer que camundongos geneticamente modificados e suas origens genéticas podem afetar a vascularização cerebral. A presença de circulação colateral e anastomoses entre diferentes territórios arteriais pode influenciar significativamente os res...
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Estudo apoiado pela subvenção PID2020-113202RB-I00 financiado pelo Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 e "Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER). Uma forma de fazer a Europa". NCC e MAR tiveram bolsas de pré-doutorado (PRE2021-099481 e PRE2018-085737, respectivamente) financiadas pelo MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 e pelo "Fundo Social Europeu (FSE) Investir no seu futuro". Agradecemos a Francisca Ruiz-Jaén e Leonardo Márquez-Kisinousky pelo apoio técnico. Agradecemos o apoio do serviço de imagem por RM do Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). O Programa Centres de Recerca de Catalunya (CERCA) da Generalitat de Catalunya apoia o IDIBAPS.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sutura 6/0 | Arago | Ligaduras vasculares | |
| 6/0 sutura com agulha curva | Arago | Pontos de pele | |
| 9 mg/mL Solução salina | Fresenius Kabi | CN616003 EC | Para hidratação |
| Sistema de anestesia | Afastadores SurgiVet | ||
| Blunt, 1 mm de largura | Ferramentas de Fine Science | 18200-09 | |
| Buprenorfina | Buprex | Para alívio da dor | |
| braçadeira aplicação fórceps | Fine Science Tools | S & T CAF4 | |
| Dumont mini fórceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Fórceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Cola | Loctite | Para colar a sonda LDF no crânio | |
| Medidor de força de preensão | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurano | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed Perimed | Sistema Periflux 5000 | ||
| Suportes de Sonda LDF | Perimed | PH 07-4 | |
| Fita | |||
| Ímã de ressonância magnética | Bruker BioSpin, Ettlingen, Alemanha | BioSpec 70/30 scanner horizontal para animais | |
| Porta-agulha com cortador de sutura | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Filamento de nylon | Doccol | 701912PK5Re | |
| Gaiola de recuperação com almofada | |||
| Tesoura Sirgical | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Kit de cauterizador de vaso pequeno | Ferramentas Fine Science | 18000-00 | |
| Estereomicroscópio e luz fria | Leica | M60 | |
| Pinça de amarração de sutura | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Termostato, sonda retal e mouse pad | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Tesouras de mola Vannas (aresta de corte de 4 mm) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Grampos vasculares | Fine Science Tools | 00396-01 |
Referências
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Reimpressões e permissões
