Modelo de Oclusão Transitória da Artéria Cerebral Média do Acidente Vascular Encefálico

O AVC é uma doença devastadora que afeta aproximadamente 15 milhões de pessoas em todo o mundo anualmente, de acordo com a OMS. Cerca de um terço dos pacientes sucumbe à condição, enquanto outro terço experimenta incapacidade permanente. O acidente vascular encefálico (AVE) é uma patologia complexa que envolve vários tipos celulares, como células imunes neurais e periféricas, vasculatura e respostas^sistêmicas1. A intrincada rede de reações desencadeadas pelo AVC em nível de sistemas não pode ser replicada atualmente usando modelos in vitro . Assim, modelos animais experimentais são essenciais para aprofundar os mecanismos da doença e desenvolver e testar novas terapias. Atualmente, a reperfusão tecidual precoce é a única intervenção aprovada, seja por meio de trombólise com ativador de plasminogênio tecidual (tPA) ou trombectomia endovascular¹.

Oclusões da artéria cerebral média (ACM) são frequentes em pacientes com acidente vascular encefálico. Consequentemente, modelos roedores de oclusão transitória da MCA (tMCAo) foram inicialmente desenvolvidos em^ratos2,3,4. Atualmente, camundongos geneticamente modificados são os animais mais utilizados em modelos experimentais de AVC. Neste estudo, descrevemos um modelo minimamente invasivo de tMCAo intraluminal em camundongos. A abordagem é realizada através da artéria carótida ao nível do pescoço, sem craniectomia.

A duração do período de oclusão é um fator crítico que determina a extensão da lesão isquêmica. Mesmo oclusões curtas de 10 min podem causar morte neuronal seletiva sem um infarto aparente, enquanto oclusões mais longas, tipicamente com duração de 30 a 60 min, resultam em algum grau de infarto cerebral. Ao contrário dos ramos proximal e distal da ACM que suprem o córtex e possuem colaterais, as artérias lentículo-estriatais que fornecem sangue para o estriado carecem de colaterais⁵. Como consequência, há maior redução do fluxo sanguíneo no estriado do que no córtex após a tMCAo. Assim, oclusões de 30 min ou menos geralmente afetam o estriado, mas não o córtex, enquanto oclusões mais longas, a partir de 45 min, frequentemente geram uma lesão isquêmica em todo o território da ACM, incluindo o estriado e o córtex dorsolateral.

Para garantir o bem-estar dos camundongos, administramos analgésicos antes do procedimento e usamos anestesia durante a cirurgia. No entanto, a anestesia pode potencialmente introduzir alterações artificiais na fisiologia do camundongo e afetar algumas medidas de desfecho⁶. A intervenção cirúrgica, quando realizada por pessoal experiente, geralmente dura cerca de 15 min para indução de MCAo. Posteriormente, o tempo total de anestesia depende do período de oclusão. Para experimentos em que minimizar a anestesia é crucial, uma etapa alternativa do procedimento envolve a interrupção da anestesia durante o período de oclusão e limitá-la apenas às etapas cirúrgicas para inserir e retirar o filamento que oclui a ACM. Essa abordagem reduz a duração da anestesia e minimiza seus potenciais efeitos artefatuais no modelo experimental ^7,8. Portanto, o método de indução de isquemia focal transitória é apresentado pela oclusão intraluminal da ACM com duas variantes: com o camundongo anestesiado durante todo o período de oclusão ou com o camundongo acordado durante esse período. Em ambos os casos, uma cirurgia simulada deve ser realizada em paralelo com a intervenção realizada nos camundongos isquêmicos. Além disso, dados sobre a avaliação do desfecho são fornecidos medidos por testes comportamentais e ressonância magnética em vários momentos após a reperfusão. Finalmente, os principais fatores a serem considerados na implementação do procedimento experimental são discutidos.

O trabalho com animais foi realizado seguindo as leis catalãs e espanholas (Real Decreto 53/2013) e as diretivas europeias, com aprovação do comitê de ética (Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA) da Universidade de Barcelona, e dos órgãos reguladores locais da Generalitat de Catalunya. Os estudos são reportados em conformidade com as diretrizes ARRIVE. Este procedimento foi projetado para ser realizado em camundongos adultos, a partir de 8 semanas de idade, sem limite de idade. Exemplos do procedimento cirúrgico desenvolvido em camundongos C57BL/6 de 10-12 semanas de idade são fornecidos aqui. Diferenças anatômicas dependendo da cepa do camundongo devem ser consideradas.

1. Preparo dos animais

1. Antes de iniciar o procedimento cirúrgico, reúna e esterilize todos os materiais e ferramentas necessários. Monte a mesa cirúrgica com todos os materiais cirúrgicos necessários (listados na Tabela de Materiais).
2. Anestesiar o animal por inalação de isoflurano em mistura de oxigênio e óxido nitroso (30%/70%).
3. Administrar buprenorfina (ver Tabela de Materiais) por via subcutânea na dose de 0,05 mg/kg PV para proporcionar analgesia e aliviar qualquer dor e desconforto.
   NOTA: A analgesia é obrigatória, mas protocolos diferentes são aceitos. Os sinais de dor e desconforto também devem ser controlados durante os primeiros dias após a MCAo (ver passo 4). Aplicar soluções corretivas quando necessário.
4. Colocar o animal em caixa de indução anestésica (ver Tabela de Materiais) com isoflurano a 5% até atingir um estado de anestesia profunda (perda do reflexo na punção da pata e reflexo ocular).
5. Posicione o mouse sobre a mesa cirúrgica e diminua o nível de isoflurano para 1,5%, administrado por máscara facial. Aplique pomada veterinária para evitar o ressecamento dos olhos durante o procedimento.
6. Manter a temperatura corporal em 37 ± 0,5 °C controlada por uma sonda retal conectada a uma almofada de aquecimento (ver Tabela de Materiais).
7. Faça a barba na parte ventral do pescoço e na cabeça (calvária) com uma navalha elétrica. Remova cuidadosamente os restos de pelos e desinfete as áreas da pele três vezes em movimentos circulares com desinfetante à base de iodo e álcool a 70%.
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2. Avaliação do fluxo sanguíneo cerebral (FSC) com Dopplerfluxometria a laser (FDL)

1. Com tesoura, faça uma incisão na pele da cabeça, na direção da sutura sagital, das orelhas até a área entre os olhos.
2. Retrair a pele e remover o periósteo do lado direito do crânio.
3. Encontre as coordenadas (2,5 mm laterais do Bregma) e fixe o suporte Doppler (ver Tabela de Materiais) usando cianoacrilato. Depois que a cola secar, conecte a sonda Doppler e verifique a leitura correta do sinal.

3. Oclusão transitória da artéria cerebral média (tMCAo)

1. Vire o mouse para a posição supina e fixe-o na mesa cirúrgica com fita adesiva.
2. Faça uma incisão na linha média do pescoço. Recuar lateralmente a pele e as glândulas salivares usando afastadores (ver Tabela de Materiais) para expor o território carotídeo.
3. Identificar a anatomia vascular da artéria carótida comum (ACC), da ACI e da ECA, bem como as diferentes artérias delas derivadas (maxilar e lingual, tireoide superior, occipital e pterigopalatina) (Figura 1A).
4. Desprenda as artérias principais do tecido conjuntivo adjacente para que possam ser manuseadas.
   NOTA: Tome cuidado especial para não danificar os nervos, especialmente o nervo vago, que corre paralelamente ao CCA.
5. Envolver uma sutura de seda 6-0 (ver Tabela de Materiais) ao redor da ECA na bifurcação maxilar/lingual. Aperte bem um nó para interromper permanentemente a circulação.
6. Passar uma segunda sutura ao redor da mesma artéria, entre o primeiro nó e a bifurcação da ACC, e manter esse nó solto.
7. Coloque um terceiro fio ao redor do CCA e amarre um nó deslizante que pode ser facilmente desatado.
   OBS: Isso também pode ser realizado com um clipe vascular, mas o fio permite mais movimento e flexibilidade. Nesta etapa é possível observar uma primeira diminuição do FSC no sinal da FDL.
8. Coloque um clipe vascular (ver Tabela de Materiais) interrompendo a circulação sanguínea a partir do ICA.
9. Faça uma pequena incisão na ECA, próximo à área onde o nó apertado está localizado.
10. Insira o monofilamento até que o revestimento espesso tenha entrado completamente na luz arterial.
11. Aperte o segundo nó para segurar o monofilamento dentro da artéria e evitar que a pressão exercida pelo sangue o empurre para fora (Figura 1B).
12. Remova o clipe vascular do ICA.
13. Corte o ECA abaixo do primeiro nó e gire o coto para orientá-lo em direção à ACI (Figura 1C).
14. Avançar o monofilamento através do ICA até o ponto onde o MCA se ramifica.
    NOTA: A oclusão é refletida em uma queda abrupta do fluxo sanguíneo na leitura do LDF. Consideramos sucesso a oclusão quando a queda do FSC for maior que 70% do valor basal. Se os sistemas de medição do FSC não estiverem disponíveis, o ponto de oclusão pode ser notado pela resistência ao avanço, que em camundongos adultos geralmente está a cerca de 11 mm da bifurcação da CCA.
    1. Se a anestesia for continuada durante o período de oclusão, monitorar o camundongo e mantê-lo sob observação constante por 45 min.
    2. Caso o camundongo seja acordado durante o período de oclusão, suture a pele do pescoço com vários pontos. Sem desconectar a sonda de FDL, coloque o mouse na caixa com temperatura controlada, permitindo a recuperação da anestesia.
       NOTA: É comum que o camundongo apresente comportamento de circular espontâneo durante esse período, indicativo de oclusão bem-sucedida.
    3. Após 40 min, anestesiar novamente o rato seguindo os mesmos procedimentos de anestesia e desinfecção indicados nos pontos 1.4, 1.5 e 1.7. Coloque-o de volta na mesa cirúrgica e retire os pontos do pescoço.
15. Após 45 min de oclusão, solte o nó mantendo o monofilamento no lugar. Puxe lenta e suavemente o filamento e verifique se ocorre a recanalização do tecido.
16. Puxe o filamento e aperte o nó para evitar a perda de sangue.
17. Desamarre o nó do CCA. Certifique-se de que não há danos na parede arterial.
18. Remova os afastadores e reposicione os músculos, glândulas e pele. Sutura a pele (6-0) e aplicação de desinfetante.
19. Desconecte a sonda Doppler e retire o suporte. Sutura e desinfecção da pele da cabeça.
20. Durante o período de recuperação da anestesia, deixe o rato numa gaiola equipada com um aquecedor para manter a temperatura. Mantenha-o sob observação constante até que esteja totalmente recuperado da anestesia. Após a recuperação, o rato pode ser devolvido à sua gaiola.
    NOTA: Habitação com enriquecimento social é altamente recomendada. No entanto, nunca misture camundongos operados com camundongos não operados na mesma gaiola sem qualquer separação física, a fim de evitar agressão.

4. Cuidados pós-operatórios

1. Supervisionar periodicamente os animais seguindo os procedimentos e normas estabelecidas de acordo com as normas locais. Fornecer tratamento analgésico no horário adequado para minimizar a dor após a cirurgia.
   LEGENDA: No presente estudo, o mesmo analgésico foi aplicado no início da intervenção (Buprenorfina 0,05mg/kg PV) 6 h e 24 h após a cirurgia.
2. Realizar a eutanásia quando os parâmetros de supervisão assim o indicarem, seguindo os protocolos aprovados institucionalmente.
3. Monitorar diariamente o peso dos animais. Fornecer ração macia aos animais durante os primeiros dias após a cirurgia. Além disso, hidratá-los por injeção subcutânea de soro fisiológico (200 μL) imediatamente após a cirurgia e periodicamente depois se for observado que o camundongo não se hidrata sozinho. Organize comida e água de forma que seja facilmente acessível ao animal.
4. Uma vez concluído o estudo in vivo , anestesiar os camundongos, eutanasiá-los e remover o tecido cerebral para análise histopatológica adicional (se necessário).

Existem diferentes abordagens para avaliar o resultado do procedimento de tMCAo. Métodos de neuroimagem (RM) in vivo e testes comportamentais são utilizados aqui.

Camundongos desenvolvem lesões isquêmicas no cérebro, afetando principalmente o território suprido pela ACM ipsilateral à oclusão, como o estriado e o córtex dorsolateral. Existem vários métodos para determinar a extensão da lesão, incluindo a coloração tecidual com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC), coloração histológica (hematoxilina/eosina, acetato de tionina) e modalidades de neuroimagem in vivo , como a RM. A RM foi escolhida aqui devido à sua natureza não invasiva e à capacidade de usar o mesmo tecido para outros estudos, fornecendo uma avaliação abrangente da lesão em cada camundongo. Além disso, a RM permite medidas repetidas nos mesmos animais, aumentando a reprodutibilidade dos resultados e, muitas vezes, reduzindo o número de animais necessários para um estudo.

O mesmo protocolo de anestesia com isoflurano (indução 5%, manutenção 1,5%) foi utilizado nas sessões de RM. Para a avaliação do volume de lesão, utilizou-se uma sequência rápida ponderada em T2 (T2w turbo RARE fast spin-echo)9 para minimizar o tempo de anestesia do animal, o que é importante quando estudos longitudinais com aquisições de RM em tempos diferentes devem ser realizados nos mesmos camundongos. Esse procedimento permite avaliar alterações na lesão ao longo do tempo nos mesmos animais, sendo muito útil quando aplicado para estudos de neuroproteção ou para testar a eficácia de drogas, entre outros. Os experimentos de imagem foram realizados em um scanner horizontal de 7T. As especificações técnicas da sequência anatômica (podem diferir dependendo da intensidade do campo magnético): T2_TurboRARE; 22 cortes coronais; 0,5 mm de espessura; tempo de eco (TE) = 33 ms; tempo de repetição (TR) = 2336,39 ms. 2 médias. Ângulo de inclinação, 90°; campo de visão (FOV) = 20 mm x 20 mm, com tamanho de matriz de 256 x 256. A Figura 2A mostra um exemplo representativo de imagens de RM da evolução da lesão no mesmo camundongo, avaliadas 40 min, 6 h, 24 h e 48 h após a reperfusão. A progressão do volume da lesão leva de horas a aproximadamente dois dias para ser completada. A quantificação do volume da lesão mostra essa evolução ao longo do tempo (Figura 2B).

Uma variedade de escalas neurológicas tem sido descrita para avaliar o comprometimento neurológico causado pelo insulto isquêmico. Sugerimos o uso de testes de neuroescore que foram extensivamente descritos em manuscritos anteriores. Por exemplo, recomenda-se o teste relatado detalhadamente por Orsini et al (2012)10 .

Uma grande variedade de testes comportamentais está disponível, principalmente para detectar diferenças no comprometimento da função motora e sensorial. Para tanto, foram utilizados os testes de força de preensão manual e de canto. O teste de força de preensão manual é utilizado para avaliar a função motora. A força dos membros anteriores é medida com um medidor de força de preensão conectado a um transdutor de força digital (consulte a Tabela de Materiais). O mouse segura uma barra horizontal com ambas as patas dianteiras enquanto a puxa suavemente para trás através da cauda. A força máxima da preensão antes da liberação das patas dianteiras é observada. São realizados cinco ensaios por animal, sendo o valor principal calculado após a exclusão dos valores máximo e mínimo. O teste de canto é usado para detectar anormalidades unilaterais das funções sensoriais e motoras. O aparelho consiste em um canto com duas tábuas (30 cm × 20 cm × 1 cm) fixadas com um ângulo de 30° e uma pequena abertura na extremidade. O mouse é colocado no meio do caminho de frente para o canto. Quando o rato entra profundamente no canto, ambos os lados das vibrissas são estimulados juntos. O mouse então vira para trás para encarar a extremidade aberta. Um total de 10 ensaios são realizados por animal, e os lados escolhidos são anotados. 50% das voltas à esquerda e à direita são esperadas em condições fisiológicas, enquanto uma preferência à direita é esperada em camundongos com MCAo direita. Um teste é considerado válido quando uma volta completa é alcançada ou quando o mouse vira a cabeça ≥ 90º. Os resultados são apresentados como a porcentagem de giros à direita (ipsilateral).

São apresentados os resultados representativos que mostram a perda de força exibida pelos camundongos 24h após a tMCAo medida pelo teste de força de preensão manual (Figura 3A), bem como sua preferência em virar para o lado ipsilateral à lesão quando estimulados no teste de canto (Figura 3B). A realização de testes comportamentais no mesmo dia da cirurgia pode ser menos precisa, uma vez que alguns parâmetros podem estar alterados devido à proximidade da anestesia com o pós-operatório.

Figura 1: Representação esquemática da árvore vascular do pescoço (lado direito). (A) A imagem mostra as artérias principais (artéria carótida comum-ACC, artéria carótida externa-ECA, artéria carótida interna-ACI) e os diferentes ramos (artéria pterigopalatina Pt; Occipital artéria Occ; Artéria tireoidiana superior St; Artérias maxilares e linguais Max/Lin). (B) Nos primeiros passos do procedimento cirúrgico, com a CCA ligada por sutura, a circulação da ACI é interrompida por uma pinça vascular e o monofilamento é introduzido via ECA. (C) Reorientação do ECA para empurrar o monofilamento para a zona de oclusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens representativas de RM. (A) Imagens em T2-w do mesmo camundongo em diferentes momentos após a reperfusão mostram a evolução da lesão na fase aguda. A área afetada pelo infarto aumenta rapidamente nas primeiras horas e experimenta pouca variação depois disso. (B) Evolução do volume da lesão na fase aguda após MCAo. Cada barra representa a média ± DP da porcentagem (%) do volume da lesão. O volume da lesão aumenta significativamente durante as primeiras 24 h após a reperfusão (*p = 0,0182; **p = 0,0088; ANOVA de 1 via/ teste de Kruskal-Wallis). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Testes comportamentais antes (basal) e 24 h após a tMCAo (n = 16 camundongos). (A) O teste de força de preensão mostra a força máxima (máx.) por mouse. (B) O teste de canto mostra a porcentagem (%) de curvas à direita. Os gráficos mostram caixa e bigodes (valores mínimo a máximo) por grupo, e os pontos correspondem a camundongos individuais (****p < 0,0001; Teste de classificação de pares pareados de Wilcoxon). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.