Um modelo fotopolimerizável de ácido hialurônico-colágeno do microambiente de glioma invasivo com fluxo intersticial

O glioblastoma é uma doença devastadora, marcada por curta sobrevida¹ que é estendida apenas moderadamente por tratamentos clinicamente disponíveis ^2,3. Esse impedimento para uma terapia eficaz é amplamente impulsionado pela natureza altamente infiltrativa das células-tronco de glioma quimiorresistentes (GSCs) que são inacessíveis à ressecção e à semeadura de tumores recorrentes⁴. Concomitantemente, as GSCs são altamente plásticas, respondendo a diversos estímulos no microambiente tumoral (TME) para sobreviver e invadir ^5,6. Especificamente, o tumor densamente povoado e a vasculatura permeável produzem um diferencial de pressão acentuado na borda do tumor, aumentando o fluxo de fluido intersticial (IFF) em regiões distintas que se correlacionam com a invasão de GSC⁷. Este aumento do IFF influencia ^8,9,10 e muitas vezes aumenta a invasão^{de 8,9} GSC por meio de vias moleculares que são passíveis de inibição farmacológica. No entanto, esse processo é confundido pela influência da glia no TME na invasão do glioma; de fato, a glia foi descrita para modular a invasão do glioma em vários contextos¹¹, e evidências preliminares em nosso laboratório indicam uma influência semelhante da glia na invasão do glioma aprimorada por IFF¹². Assim, nosso laboratório desenvolveu um modelo 3D TME ajustável que replica essas regiões invasivas da borda do tumor, incorporando interações IFF e glia-GSC para quantificar a invasão de GSC e outros resultados (ou seja, expressão de proteína de superfície ou intracelular, expressão de RNA, etc.) conforme influenciado por IFF, glia e / ou terapêutica candidata¹² (Figura 1).

O modelo TME é semelhante a outros ensaios de fluxo de fluido intersticial baseados em insertos de cultura de tecidos (ou seja, ensaios estáticos / de fluxo) que foram amplamente publicados 8,9,10,13,14,15,16,17,18. As principais distinções deste modelo são a incorporação de uma matriz de ácido hialurônico colágeno não proprietária e ajustável, a inclusão de astrócitos e micróglia na matriz em proporções representativas de TMEs^{de pacientes 12}, e o sistema é totalmente fechado em uma placa de poço, sem tubulação externa, reservatórios ou bombas. O ácido hialurônico está entre os principais componentes da matriz extracelular cerebral¹⁹, mas não é suficiente para permitir o fluxo de fluidos; assim, o colágeno I é incluído na mistura. A reticulação ocorre em duas etapas: uma polimerização de crescimento em cadeia iniciada por radicais livres em que, após a exposição à luz ultravioleta (UV), os radicais livres são produzidos a partir do fotoiniciador e geram ligações cruzadas químicas entre moléculas de ácido hialurônico^{metacrilato 20} e neutralização do colágeno preservado em ácido e exposição ao calor para formar fibras de colágeno^{21 , 22 , 23} .

Vários parâmetros que foram otimizados para este ensaio foram descritos em trabalhos publicados anteriormente em hidrogéis de hialuronano-colágeno modificados com tiol ^8,12. Especificamente, as células (GSCs humanas primárias²⁴, astrócitos corticais humanos primários e micróglia humana imortalizada) usadas para este ensaio são pelo menos 60% viáveis por 3 dias em géis compostos de meio astrobasal suplementado com fatores de crescimento GSC, 0,5% v/v N-2 e 1% v/v B-27 sem vitamina A¹². Nos casos em que os géis devem ser degradados (por exemplo, para extração de proteínas ou citometria de fluxo), colagenase e dispase são usadas e mantêm viabilidade suficiente (Figura 2).

Para quantificar a invasão, os GSCs devem ser marcados com fluorescência antes de serem combinados com a glia na matriz. Isso pode ser obtido marcando com Hoechst 33342 (conforme descrito abaixo), rastreadores celulares¹², modificação genética ou transdução. Independentemente disso, a viabilidade das células marcadas com novos marcadores deve ser medida antes de incorporá-las ao modelo TME. Alternativamente, se a invasão não for quantificada, mas os géis forem colhidos para extrações de proteínas, extrações de RNA ou outros resultados, as células geralmente não precisam ser marcadas com fluorescência durante o processo de preparação do gel. Nesse caso, os géis podem ser fixados em formalina para imagem, degradados e lisados por células para extração de RNA ou degradados usando proteases para citometria de fluxo e subsequentemente lisados com tampões de lise de proteínas para Western blots ou outro trabalho de proteína.

Aqui, apresentamos um protocolo para incorporar astrócitos humanos, microglia e GSCs derivados de pacientes em uma proporção definida pelo paciente, 4:1:1¹², em uma matriz hialurônica de colágeno I de 1,2 mg/mL e 4 mg/mL sob condições estáticas de fluxo. Os parâmetros específicos usados para um ensaio (ou seja, proporções celulares, rigidez, tipos de células, etc.) podem ser alterados para representar diferentes contextos se a viabilidade for adequada.

Figura 1: Diagrama do modelo TME composto por GSCs, astrócitos e microglia em um hidrogel sob uma cabeça de pressão de fluido. As células são incorporadas em um hidrogel de ácido hialurônico de colágeno dentro de uma inserção de cultura de tecidos. A força gravitacional impulsiona o fluxo líquido para baixo. Os poros na membrana da inserção da cultura de tecidos permitem que as células que invadem para baixo se fixem na superfície inferior da inserção da cultura de tecidos, e essas células podem ser fixadas, visualizadas e quantificadas. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Viabilidade celular após degradação do hidrogel. G34s (GSCs), astrócitos e microglia foram semeados no modelo TME a 4:1:1 e incubados por 21 h a 37 °C. Os géis foram removidos e degradados usando 0,3 mg / mL de colagenase + 0,02 mg / mL de dispase por um total de 30, 45 ou 60 min, pipetando para misturar a cada 15 min (condição de 30 min) ou a 30 min e depois a cada 15 min (condições de 45 min e 60 min). Depois que os géis foram degradados, as células foram coradas com laranja de acridina (todas as células) e iodeto de propídio (células mortas) e contadas usando um contador de células automatizado. A viabilidade é relatada para todas as células dentro do modelo TME. As células mantiveram pelo menos 70% de viabilidade em 30-60 min. Os dados são apresentados como média ± EPM; n = 3 réplicas biológicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo foi desenvolvido em conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Biossegurança da Virginia Tech.

NOTA: Execute todos os procedimentos em um gabinete de cultura de células BSL-2, a menos que especificado de outra forma. Consulte o comitê de biossegurança da instituição para obter orientação sobre o uso de células humanas.

1. Cálculos para preparação de gel

1. Calcule o número de condições necessárias para o experimento.
   NOTA: Uma "condição" é definida pelo conteúdo da solução (por exemplo, concentrações de células, concentrações de colágeno, etc.), não por variáveis aplicadas externamente, como a carga de pressão do fluido usada neste exemplo.
2. Calcule o volume total de gel necessário para cada solução de condição.
   NOTA: O volume necessário para géis de 12 poços que usam inserções de cultura de tecidos de 12 mm de diâmetro é de 100-150 μL por inserção. Pelo menos três réplicas técnicas são recomendadas para quantificar a invasão. Além disso, para contabilizar a perda de volume por erro de pipetagem, adicione o volume de uma réplica adicional a cada solução de condição.
3. Calcular o volume total de solução de gel necessário para a experiência a partir do passo 1.2.
4. Calcule o volume total de 3 mg/mL de solução de colágeno necessário para o experimento. Adicione pelo menos 10% a esse volume para contabilizar a perda de volume ao pipetar.
   Volume total 3 mg/mL de colágeno = 0,4 × Volume total da solução de gel
5. Calcule os volumes de colágeno I de cauda de rato de alta concentração, NaOH 1 N estéril, PBS 10x estéril e água estéril para cada componente na solução de colágeno 3 mg / mL nas concentrações finais fornecidas (c_f): colágeno I c_f = 3 mg / mL, NaOH c_f = 2,3% v / v do volume de colágeno I e PBS c_f = 1x. Diluir as soluções em água ultrapura estéril (18,2 MΩ·cm).
6. Calcular os volumes de solução de colagénio a 3 mg/ml, ácido hialurónico metacrilato a 1% p/v e o fotoiniciador, fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio (LAP) a 17 mg/ml e meios de cultura celular para cada uma das soluções de condição nas concentrações finais indicadas (c_f): colagénio c_f = 1,2 mg/ml, ácido hialurónico c_f = 0,4% p/v, LAP c_f = 2% v/v do volume de ácido hialurônico. Diluir as soluções em meios de cultura de células que contenham células.
7. Calcule o número de células para cada solução de condição na proporção desejada (por exemplo, 100.000 GSCs por 100 uL de hidrogel na proporção de 4:1:1 GSCs:astrócitos:microglia).

2. Preparação de materiais

1. Na semana anterior ao experimento, placas GSCs, astrócitos e microglia.
   NOTA: A placa deve produzir aproximadamente o dobro do número de células do que o necessário para que os géis sejam responsáveis pela passagem e pela perda de células durante o procedimento.
2. Preparar uma solução de trabalho do fotoiniciador, LAP, a 17 mg/ml em 1x PBS estéril. Proteja-o da luz.
3. Reconstitua o ácido hialurônico metacrilato em 1x PBS de acordo com as instruções do fabricante. Feche a tampa e agite a suspensão suavemente por 1 h, ou até dissolver, a 4 °C.
   NOTA: O ácido hialurônico metacrilato usado neste protocolo é estável por aproximadamente 1 mês a 4 °C, conforme especificado pelo fabricante. Proteja-o da luz.
4. Instale uma lâmpada UV usando um diodo emissor de luz (LED) colimado com comprimento de onda nominal de 385 nm a uma intensidade de 50 mW/cm² na superfície do gel. Coloque a lâmpada no armário de cultura de células.
   CUIDADO: A luz UV pode danificar os olhos. Use óculos de proteção e não olhe diretamente para a lâmpada.
   NOTA: Realize experimentos separados para garantir que a viabilidade ou o resultado funcional que está sendo medido não seja significativamente afetado pela exposição à luz de 385 nm a 50 mW / cm² durante o período de exposição (45 s).
5. Prepare meios (meios astrobasais + 0,5% v / v N-2 + 1% v / v B-27 sem vitamina A) para o experimento.
   NOTA: Combine os componentes do meio e filtre através de um sistema de vácuo de poros de 0,22 μm para garantir a esterilidade. Evitar ciclos de congelamento e descongelamento dos fatores de crescimento (N-2 e B-27) para evitar a degradação.
6. Prepare 1 N NaOH em uma hotte com a proteção contra respingos no lugar.
   CUIDADO: 1 N NaOH é altamente corrosivo. Manuseie com cuidado, use proteção para os olhos ou use uma proteção contra respingos e mantenha a solução sob um exaustor.
7. Prepare água ultrapura estéril (18,2 MΩ · cm).

3. Células de passagem e marcação de GSCs

1. Passagem de astrócitos, microglia e GSCs de acordo com as instruções do fabricante.
2. Rotule os GSCs com Hoechst 33342 seguindo a recomendação do fabricante.
   CUIDADO: Hoescht 33342 pode causar irritação ocular grave e pode induzir danos ao DNA. Manuseie com cuidado.
3. Centrifugue todas as células a 200 x g por 5 min em RT.
4. Despeje suavemente o sobrenadante e remova o excesso de meio com uma pipeta.
5. Ressuspenda os GSCs em 1x PBS.
6. Centrifugue os GSCs a 200 x g por 5 min.
7. Ressuspenda todas as células no meio (meio astrobasal + 0,5% N-2 v / v + 1% v / v B-27) para o experimento.
8. Conte todas as células.
9. Adicione o número absoluto de células necessárias para cada solução de condição em um frasco para injetáveis por solução de condição. Coloque-os a 37 °C, 5% de CO₂ até o uso.

4. Preparação de hidrogéis

NOTA: Execute as etapas após abrir o ácido hialurônico metacrilato e o fotoiniciador no escuro até que os géis tenham sido fotoreticulados.

1. Coloque o colágeno 8-11 mg / mL (alta concentração), NaOH 1 N, água ultrapura estéril (18,2 MΩ · cm), PBS estéril 10x, um tubo de microcentrífuga (para a solução de colágeno de 3 mg / mL), ácido hialurônico metacrilato e o fotoiniciador no gelo.
   NOTA: Todos os materiais que entram em contato com a solução de colágeno devem ser mantidos no gelo para evitar a reticulação prematura.
2. Coloque as inserções de cultura de tecidos na placa e rotule a placa.
3. Usando os valores calculados, prepare a solução de colágeno 3 mg / mL combinando colágeno de alta concentração, NaOH 1 N, água ultrapura (18,2 MΩ · cm) e PBS 10x. Adicione componentes gota a gota e mantenha a ponta da pipeta submersa ao misturar para evitar a formação de bolhas.
   NOTA: Se as bolhas se formarem, a centrifugação ou batida do tubo em uma superfície dura geralmente remove as bolhas. Além disso, os meios contendo vermelho de fenol serão amarelos se o pH for muito ácido; mais NaOH deve ser adicionado neste caso.
4. Centrifugar as células a 200 x g durante 5 min à RT.
5. Remova cuidadosamente o excesso de mídia da parte superior de cada solução de condição celular, deixando o volume de mídia necessário para a condição. Coloque essas soluções no gelo.
   NOTA: Não transfira as células para fora deste frasco para evitar a perda de células. Em vez disso, adicione todos os componentes da condição do gel a este frasco, misture delicadamente e distribua os géis na placa.
6. Adicione o volume calculado de 3 mg/ml de solução de colagénio para uma concentração final de 1,2 mg/ml a cada solução de condição celular do passo 4.5.
7. Adicione o volume calculado de ácido hialurônico metacrilato a 1% p/v para uma concentração final de 0,4% p/v a cada solução de condição celular da etapa 4.5.
8. Adicione o volume calculado de 17 mg/ml de LAP a cada solução de condição celular do passo 4.5.
   NOTA: Adicione esta solução antes de distribuir géis na placa para maximizar a viabilidade; O LAP na forma líquida é citotóxico.
9. Um de cada vez, misture cada tubo de condição e adicione 100-150 μL a cada inserto de cultura de tecidos. Mantenha a ponta da pipeta submersa para evitar a formação de bolhas.
10. Ligue a lâmpada UV de 385 nm (configurada em 50 mW/cm²) a uma corrente constante.
11. Foto-reticulação de cada gel, um de cada vez, expondo cada poço à luz UV por 45 s cada.
12. Reticule o colágeno colocando a placa a 37 °C por 30-45 min.
13. Aplique a cabeça de pressão do fluido aos géis usando astrobasal + 0.5% N-2 v / v + 1% v / v B-27.
    1. Fluxo líquido zero (estático): Adicione 700 μL de meio na placa do poço e 100 μL no inserto de cultura de tecidos.
    2. Fluxo líquido: Adicione 100 μL de meio na placa do poço e 700 μL no inserto de cultura de tecidos.
       NOTA: Use ação capilar para adicionar 100 μL sob o inserto de cultura de tecidos; Este volume não preencherá a placa do poço.
14. Coloque a placa a 37 °C, 5% CO_2, por pelo menos 18 h ou até 5 dias.
    NOTA: Os sistemas podem incubar por até 5 dias, dependendo das necessidades do ensaio, mas um ponto de tempo de 18 a 24 horas é suficiente para experimentos iniciais de invasão, viabilidade ou proliferação.

5. Fixação de células para análise de invasão

NOTA: Não permita que a membrana da inserção da cultura de tecidos seque e não aplique as soluções diretamente na membrana para evitar o desprendimento das células da membrana.

1. Aspire os meios das inserções de cultura de tecidos e da placa do poço.
2. Sugue os géis das inserções de cultura de tecidos com uma ponta P1000.
   NOTA: Os géis podem ser retidos para aquisição de imagens deixando-os no poço durante esta etapa e seguindo o protocolo de fixação alternativo na nota da etapa 5.4.
3. Lave suavemente o poço com 1x PBS para que cada membrana de inserção de cultura de tecidos seja coberta.
4. Adicione 4% de formalina v / v em PBS à placa do poço para que cada membrana de inserção de cultura de tecidos seja coberta e incube por 15-20 min em RT.
   CUIDADO: A formalina é suspeita de ser cancerígena e pode causar sérios danos aos olhos. Use formalina em um exaustor com a proteção contra respingos no lugar.
   NOTA: Este comprimento de incubação fixará apenas as células na membrana da inserção da cultura de tecidos. Se os géis forem mantidos para imagem, fixe-os por 1 h a 4 °C, balançando suavemente e adicione formalina suficiente à inserção de cultura de tecidos para permear o gel. Após a fixação, lave bem os géis com PBS por pelo menos 20 min.
5. Lave cada poço com 1x PBS. Depois, adicione mais 1x PBS a cada poço de placa de poço e inserção de cultura de tecidos.
6. Use um cotonete para remover fragmentos de gel, limpando a parte superior de cada membrana de inserção de cultura de tecidos. Devolva qualquer 1x PBS perdido para cada poço após a limpeza para evitar o ressecamento das membranas.
7. Lave cada poço e inserção de cultura de tecidos em 1x PBS.
   NOTA: A placa pode ser selada e colocada a 4 °C, se necessário, mas as membranas de imagem o mais rápido possível para evitar a perda de fluorescência.

6. Imagem e quantificação

1. No canal DAPI, crie uma imagem de cada membrana. Se possível, tire uma imagem de fluorescência lado a lado de todo o poço. Se isso não for possível, em 20x, imagine o centro do poço e quatro regiões em uma formação cruzada que cruza o ponto central.
   NOTA: Exclua as bordas do poço para evitar fragmentos de gel e não sobreponha regiões de interesse (ROIs).
2. Conte o número de células em cada imagem.
3. Calcule a porcentagem de GSCs semeados que invadiram para cada poço:
   
4. Calcule a média e o desvio padrão da porcentagem de invasão entre réplicas técnicas.

7. Parâmetro alternativo: citometria de fluxo

NOTA: Além ou em vez de analisar a invasão, os géis não fixados podem ser degradados e as células colhidas para citometria de fluxo ou outras análises de endpoint. Um exemplo de protocolo que analisa a viabilidade celular (coloração viva/morta corrigível), proliferação (anticorpo Ki67) e estaminalidade (anticorpo CD71) é fornecido. Outros marcadores de interesse podem ser substituídos neste protocolo após a validação da eficácia da coloração. Em particular, existe uma grande variedade de marcadores que visam os GSCs (revisados em²⁵). Este protocolo começa após a etapa 4.14.

1. Degradar os hidrogéis.
   NOTA: Uma concentração de 2x de soluções de colagenase e dispase é preparada primeiro com meio experimental (astrobasal + 0,5% v / v N-2 + 1% v / v B-27 sem vitamina A), que é então adicionado a um volume igual de hidrogel para atingir uma concentração final de 1x. Como células diferentes têm respostas diferentes à degradação enzimática, é altamente recomendável verificar a viabilidade e o rendimento celular (Figura 2). A faixa da concentração final de colagenase deve ser de 0,2-0,4 mg/mL, e a faixa de concentração final de dispase deve ser de 0,01-0,04 mg/mL; neste exemplo, 0,3 mg/mL de colagenase e 0,02 mg/mL de dispase são usados para degradar os hidrogéis.
   1. Prepare 2x soluções de colagenase e dispase (solução de meio de degradação em gel). Dilua a colagenase estoque a 0,6 mg / mL e a dispase estoque a 0,04 mg / mL com meios experimentais (astrobasal + 0,5% N-2 v / v + 1% v / v B-27 sem vitamina A).
   2. Remova os géis das inserções de cultura de tecidos e transfira-os para uma placa de 96 poços com fundo em V.
   3. Adicionar o volume equivalente de solução de meio de degradação em gel por hidrogel a cada poço. Por exemplo, adicione 100 μL de solução de meio de degradação de gel a 100 μL de hidrogel.
   4. Incubar a placa num agitador a 300-500 RPM (órbita: 2 mm) a 37 °C durante 15-30 min.
      NOTA: Tente o intervalo mínimo, 15 min de incubação, se as células forem sensíveis à degradação enzimática.
   5. Pipete cada hidrogel para cima e para baixo 30-50 vezes para quebrar os hidrogéis.
      NOTA: Os hidrogéis serão fáceis de pipetar quando estiverem completamente degradados. Se os géis não puderem ser facilmente pipetados, devem ser incubados num agitador a 300-500 RPM (órbita: 2 mm) a 37 °C durante mais 15 minutos. Em seguida, pipete cada hidrogel para cima e para baixo 30-50 vezes para quebrar os géis.É importante ressaltar que o tempo de incubação para a degradação de hidrogéis não deve exceder 1 h; Isso pode levar a uma baixa viabilidade celular.
   6. Centrifugar a placa a 625 x g durante 1 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
      NOTA: O sobrenadante pode ser removido pipetando ou invertendo rapidamente a placa sobre uma bandeja de resíduos.
   7. Ressuspenda as células com 50 μL de 1x PBS e agrupe três réplicas técnicas em um poço para produzir uma única réplica biológica.
   8. Centrifugar a placa a 625 x g durante 1 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante para continuar a citometria de fluxo.
2. Bloquear associação não específica.
   1. Lave as células com 200 μL de PBS 1x / poço, centrifugue a placa a 625 x g por 1 min a 4 ° C e descarte o sobrenadante. Execute todas as etapas a seguir no gelo, a menos que especificado de outra forma.
   2. Ressuspenda as células com 200 μL de solução de bloqueio (1x PBS com 10% v/v FBS) e incube a placa por 15 min em RT.
   3. Lave as células com 200 μL de PBS 1x / poço, centrifugue a placa a 625 x g por 1 min a 4 ° C e descarte o sobrenadante.
3. Rotule as células com uma mancha viva/morta.
   1. Teste a viabilidade celular usando uma coloração de infravermelho próximo vivo/morto corrigível. Dilua a mancha viva/morta com 1x PBS para 1:1000.
   2. Ressuspenda as células em um poço com 200 μL de etanol a 70% para um controle negativo.
   3. Ressuspenda as células nos poços restantes com 200 μL de 1x PBS.
   4. Incubar a placa durante 5-10 min no gelo, centrifugar a placa a 625 x g durante 1 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
   5. Adicione 50 μL de solução viva/morta aos respectivos poços e incube a placa no gelo por 15 min.
   6. Centrifugar a placa a 625 x g durante 1 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
   7. Lave as células duas vezes com 200 μL de tampão de fluxo (HBSS com 2% p / v BSA) por poço.
   8. Centrifugar a placa a 625 x g durante 1 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
4. Realize imunocoloração de superfície para marcadores celulares de interesse (anticorpo CD71).
   1. Diluir o anticorpo CD71 com tampão de fluxo (HBSS com 2% p/v BSA) a 1:50.
   2. Adicione 50 μL de solução de anticorpos aos respectivos poços e incube a placa em gelo por 15 min.
   3. Centrifugar a placa a 625 x g durante 1 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
   4. Lave as células uma vez com 200 μL de tampão de fluxo (HBSS com 2% p / v BSA) por poço.
   5. Centrifugar a placa a 625 x g durante 1 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
5. Realize imunomarcação intracelular para marcadores celulares de interesse (anticorpo Ki67).
   1. Use o conjunto de tampão de coloração do fator de transcrição Foxp3 para fixar e permeabilizar as células. Adicione 100 μL de solução de trabalho de fixação/permeabilização Foxp3 a cada poço. Ressuspenda os grânulos celulares pipetando para cima e para baixo.
   2. Incube a placa no gelo ou em RT por 30-60 min no escuro.
   3. Centrifugar a placa a 625 x g durante 1 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
   4. Lave as células duas vezes com 200 μL de tampão de permeabilização 1x por poço.
   5. Centrifugar a placa a 625 x g durante 1 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
   6. Adicione 100 μL de solução de bloqueio (1x PBS com 2% v / v FBS) por 15 min em RT.
   7. Centrifugar a placa a 625 x g durante 1 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
   8. Dilua o anticorpo Ki67 com solução de bloqueio (1x PBS com 2% v/v FBS) a 1:25.
   9. Adicione 50 μL de solução de anticorpo 1:25 Ki67 aos respectivos poços e incube a placa por 30 min em RT no escuro.
   10. Centrifugar a placa a 625 x g durante 1 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
   11. Lave as células duas vezes com 200 μL de tampão de permeabilização 1x por poço.
   12. Ressuspenda as células com 200 μL de tampão de fluxo.
6. Processar as amostras usando um citômetro de fluxo. Um exemplo de estratégia de gating é detalhado em Cornelison et al. 2022¹².

Dados representativos para invasão (Figura 3), viabilidade e expressão de Ki67 e CD71 via citometria de fluxo (Figura 4) são fornecidos para linhas de GSC, conforme publicado anteriormente para um hidrogel de hialuronano-colágeno modificado com tio-modificado12. A presença de astrócitos e micróglias no modelo TME tem um efeito diferencial na invasão de GSC dependente da linhagem celular (Figura 4). Especificamente, os GSCs G44 e G6224 foram semeados no modelo TME com e sem astrócitos e micróglia e expostos a uma carga de pressão de fluido (fluxo) ou fluxo líquido zero (estático).

A presença versus ausência de astrócitos e micróglia dentro do modelo TME foi associada a uma redução na invasão de G44 dentro da condição estática (Figura 3; p < 0,05). Em contraste, nem o fluxo nem a presença de astrócitos e micróglia afetaram significativamente a invasão do G62. Esses diferentes efeitos do microambiente tumoral e do fluxo na invasão foram descritos para linhagens celulares adicionais12 e devem ser investigados para novas linhagens celulares incorporadas ao sistema modelo.

Para analisar a viabilidade, proliferação de Ki67+ e stemness CD71+ de GSCs no modelo TME, a linhagem G3424 de GSC foi semeada com astrócitos e micróglias marcados com corante fluorescente, e foi aplicado estático ou fluxo. Em seguida, os géis foram degradados para isolar as células para citometria de fluxo. As células foram coradas com vivos/mortos fixáveis, depois fixadas e marcadas com anticorpos Ki67 ou CD7112. A Figura 4A mostra o protocolo geral de gating para CD71 + vivo, Ki67 + G34s diferenciados de astrócitos e micróglia. A proliferação de G34 (Ki67) foi significativamente aumentada no fluxo em relação à estática quando isolada nos géis (p < 0,001) e na presença versus ausência de glia dentro da condição estática (p < 0,05) (Figura 4B). Embora estatisticamente não significativo, o G34 tendeu a aumentar a expressão de CD71 durante o fluxo quando sozinho nos géis; essa tendência não foi observada na presença de glia (Figura 4C). Este método pode ser usado para quantificar outros marcadores de interesse para cada tipo de célula dentro do modelo TME.

Notavelmente, devido à variabilidade introduzida por múltiplos fatores que podem potencialmente influenciar a invasão do glioma (rigidez do gel, gliose reativa, alterações fenotípicas devido à seleção e passagem, etc.), muitas vezes é útil relatar o tamanho do efeito, e é necessário gerar réplicas técnicas e realizar uma análise de poder para réplicas biológicas antes de testar novas linhagens celulares. Geralmente, n = 3-6 réplicas biológicas são aceitáveis. Para minimizar a variabilidade e maximizar a potência, as condições devem ser executadas dentro do mesmo experimento, incluindo comparações entre diferentes linhas GSC, quando possível.

Figura 3: Influência diferencial do microambiente tumoral na invasão estimulada por fluxo em duas linhas de GSC. As GSCs marcadas com fluorescência (G44 e G62) foram semeadas apenas em hidrogéis (-A/M) ou com astrócitos e micróglia (+A/M). Uma cabeça de pressão de fluido foi aplicada às condições de "fluxo"; O fluxo líquido de fluido zero foi aplicado a condições "estáticas". As GSCs invadidas foram fixadas na membrana da inserção da cultura de tecidos, contadas e calculadas as médias entre as repetições técnicas. A invasão média foi plotada para cada réplica biológica. A invasão do G44 foi significativamente reduzida pela presença de A/M dentro da condição estática (p < 0,05). Em contraste, nem o fluxo nem a presença de A/M influenciaram a invasão em G62. A proporção de GSCs semeados que invadiram é representada graficamente como média ± SEM; n = 3 repetições biológicas; *p < 0,05 para uma ANOVA de 2 vias pareada seguida de comparações múltiplas de Tukey. Os dados são reformatados e reimpressos com permissão de Cornelison et al. 202212. A análise estatística foi revisada para incluir apenas as linhagens celulares de interesse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Medindo a viabilidade, proliferação (Ki67) e stemness (CD71) em GSCs dentro do modelo TME. As GSCs foram semeadas com ou sem astrócitos marcados com corante fluorescente (verde) e micróglia (vermelho escuro) no modelo TME e expostas a fluxo líquido zero de fluido (estático) ou fluxo líquido (fluxo). Os géis foram degradados e corados com corante de infravermelho próximo vivo/morto e com anticorpos Ki67 ou CD71 para citometria de fluxo. Os controles de isotipo são mostrados em cinza. (A) Os tipos de células foram fechados e as células viáveis quantificadas por meio de coloração de infravermelho próximo vivo / morto. (B) A proliferação de Ki67 em G34s é significativamente aumentada no fluxo em relação à estática quando isolada no hidrogel (p < 0,001) e na presença de astrócitos e micróglias (A/M) dentro da condição estática (p < 0,05). (C) Em contraste, embora estatisticamente não significativa, a stemness G34, representada pela expressão de CD71, é mantida nas condições estáticas pela inclusão de astrócitos e micróglias no modelo TME. Os dados são apresentados como média ± EPM; n = 3 réplicas biológicas. *p < 0,05 e ***p < 0,0001 para uma ANOVA de duas vias seguida pelas comparações múltiplas de Tukey. A figura é reformatada e reimpressa com permissão de Cornelison et al. 202212; dados adicionais estão incluídos demonstrando as condições estáticas nos painéis B e C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm conflitos de interesse relevantes a divulgar.