Um modelo padronizado de xenotransplante cardíaco heterotópico de porco para macaco

O xenotransplante cardíaco oferece uma nova esperança para pacientes com insuficiência cardíaca em estágio terminal que precisam de um transplante, mas não conseguem receber um órgão de doador adequado devido à escassez de doadores. Em estudos de avaliação pré-clínica, o xenotransplante cardíaco com suporte à vida alcançou durações de sobrevida de até nove meses, atendendo aos critérios de eficácia exigidos para iniciar ensaios clínicos em humanos¹. Com base nessas descobertas, a Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos aprovou o uso de acesso expandido para dois casos clínicos de xenotransplante cardíaco usando corações de doadores geneticamente editados. Embora esses casos clínicos tenham demonstrado a viabilidade do xenotransplante cardíaco, vários desafios não resolvidos surgiram, incluindo hipertrofia cardíaca anormal e rejeição mediada por anticorpos 2,3,4,5. Por conseguinte, são necessários mais estudos pré-clínicos em modelos animais de grande porte em condições de boas práticas laboratoriais para fornecer dados adicionais e desenvolver novos regimes imunossupressores para garantir a segurança de futuros ensaios clínicos em seres humanos.

A sobrevida a longo prazo dos xenoenxertos cardíacos ortotópicos não é limitada apenas pela rejeição, mas também pela disfunção primária do enxerto. A incidência geral de disfunção primária foi relatada como variando de aproximadamente 40% a 60% em diferentes equipes de pesquisa ^4,6,7. Devido à maior suscetibilidade dos corações de doadores suínos à lesão isquêmica, alguns grupos desenvolveram dispositivos de perfusão hipotérmica para reduzir a incidência de disfunção primária do enxerto. No entanto, a hipertrofia cardíaca pós-operatória permanece difícil de controlar. Mesmo com suínos doadores nocauteados para receptor de hormônio do crescimento (GHR), a função cardíaca pode ser comprometida pela ausência de GHR, limitando a viabilidade do enxerto a longo prazo ^2,3. Nesse contexto, o xenotransplante cardíaco heterotópico apresenta várias vantagens: evita pré-carga e pós-carga excessivas, simplifica o procedimento cirúrgico e reduz o tempo isquêmico total ^8,9. Este modelo reflete melhor a lesão do enxerto impulsionada pela rejeição xenogênica e, ao contrário do transplante ortotópico, o xenotransplante cardíaco heterotópico permite a sobrevida do enxerto a longo prazo, laparotomias repetidas para biópsias in vivo e observação prolongada da ativação imune e da função dinâmica das células imunes. Serve como um modelo valioso para investigar mecanismos xenogênicos de rejeição imunológica e para avaliar a eficácia e segurança de novas estratégias imunossupressoras^10,11.

No entanto, a maioria dos modelos de xenotransplante cardíaco heterotópico abdominal utilizou babuínos como receptores, mas a aquisição de babuínos como animais experimentais continua sendo um desafio em muitos países. Em contraste, os macacos são os primatas não humanos mais amplamente utilizados e possuem alta homologia filogenética com os humanos¹², tornando-os uma alternativa prática para a pesquisa de xenotransplante. No entanto, seu tamanho corporal significativamente menor em comparação com os babuínos requer adaptações específicas do protocolo cirúrgico para acomodar suas dimensões anatômicas distintas.

Este estudo apresenta um protocolo passo a passo para xenotransplante cardíaco heterotópico de porco GTKO para macaco. O uso de porcos knockout para α-Gal (GTKO) visa principalmente prevenir a rejeição hiperaguda, o que, de outra forma, levaria à falha do enxerto minutos após o xenotransplante cardíaco. Está estruturado da seguinte forma: (1) princípios de correspondência entre suínos dadores e macacos receptores; (2) otimização do procedimento cirúrgico para xenotransplante cardíaco heterotópico; e (3) manejo perioperatório. Este estudo tem como objetivo disseminar essas técnicas de transplante para facilitar a comparabilidade entre as equipes de pesquisa e aumentar a reprodutibilidade e a relevância translacional dos estudos de xenotransplante cardíaco.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Fuwai (FWAEC-JL-010-1/0-2020). Macacos machos pesando >9 kg e com idade entre 10 e 15 anos, e porcos machos Bama miniatura pesando 5-6 kg (~ 60 dias de idade) foram usados para minimizar a compressão abdominal. Macacos de corpo maior foram priorizados para evitar a compressão abdominal pelo coração do doador e para acomodar o crescimento pós-transplante. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Critérios de seleção de doadores e receptores

1. Seleção do macaco receptor
   1. Triagem de anticorpos pré-existentes: Use citometria de fluxo para avaliar o nível de anticorpos xenogênicos pré-formados, permitindo a seleção de receptores com baixo risco imunológico.
      NOTA: Neste ensaio, as células endoteliais suínas GTKO de aortas de porcos GTKO são isoladas por digestão enzimática, conforme descrito anteriormente¹³.
      1. Incubar células endoteliais suínas GTKO com plasma receptor.
      2. Quantifique a ligação de IgM e IgG de macaco a células suínas usando anticorpos secundários marcados com fluorescência contra IgM e IgG de macaco. Selecione receptores com baixos níveis de anticorpos pré-formados.
   2. Avaliação inicial da saúde: Realize bioquímica sérica, hemograma completo e testes de função de coagulação para confirmar a função basal adequada dos órgãos.
2. Critérios de seleção de suínos doadores
   1. Triagem ecocardiográfica: Selecione porcos doadores com função ventricular esquerda e direita normal, sem anormalidades estruturais ou funcionais das válvulas cardíacas, fração de ejeção superior a 65% e sem evidência de hipertensão pulmonar.
   2. Correspondência de sexo: Selecione porcos doadores com o mesmo sexo do receptor.
   3. Tipo sanguíneo: Selecione porcos doadores com tipo sanguíneo O.

2. Preparo pré-operatório

1. Anestesia e sedação
   1. Anestesia: Induzir macacos com cetamina (10 mg/kg) e midazolam (1 mg/kg) (seguindo protocolo aprovado pela instituição). Após a indução, manter a anestesia com isoflurano (2%-3%) mais dexmedetomidina (1 μg/kg/h) e propofol (1-2 mg/kg/h).
   2. Intubação: Intubar o porco doador com um tubo endotraqueal de 5,0 mm. Intubar o macaco receptor com um tubo endotraqueal de 5,5 mm.
   3. Inserção de cateter ureteral: Insira um cateter urinário de duplo lúmen 6-F no macaco; omitir no porco doador.
2. Preparar e desinfetar campos cirúrgicos
   1. Preparação da pele: Corte os pelos do peito, pescoço, abdômen, costas e membros.
   2. Desinfecção: Esfregue as áreas raspadas com iodopovidona, incluindo cascos (porcos) ou mãos e pés (macacos).
3. Colocação de cateter venoso central no receptor
   1. Posicionamento: Posicione o macaco receptor em decúbito lateral esquerdo parcial com elevação do ombro para otimizar a exposição da região cervical direita. Selecione a veia jugular interna direita como o local preferido para o acesso venoso central.
   2. Esterilização e drapeamento: Desinfete e cubra o campo cirúrgico com iodopovidona seguindo os procedimentos assépticos padrão.
   3. Incisão e exposição do vaso: Faça uma incisão de 5 cm aproximadamente 1 cm medial ao músculo esternocleidomastóideo, paralela à sua borda interna. Realize uma dissecção romba da fáscia e retraia o músculo lateralmente.
      1. Identifique a veia jugular externa, que fica superficial e fora da bainha carotídea. Ligue cuidadosamente pequenos ramos comunicantes da veia jugular interna. Abra a bainha carotídea para expor a veia jugular interna, o nervo vago e a artéria carótida.
   4. Inserção do cateter: Insira um cateter venoso central de lúmen triplo 8-F usando uma técnica de tunelamento retrógrado. Conecte a extremidade proximal do cateter à agulha de tunelização em condições estéreis e puxe-a através do túnel para a incisão no pescoço.
      1. Exteriorize a extremidade distal no ponto médio da escápula. Apare o cateter em um comprimento apropriado para garantir que sua ponta alcance a junção da veia cava superior e o átrio direito.
   5. Fechamento da incisão: Feche a ferida em camadas. Feche a fáscia e o tecido subcutâneo usando suturas absorvíveis 3-0 e feche a pele com suturas de seda 1-0. Garanta cobertura completa e fixação segura do cateter abaixo da camada fascial para minimizar o risco de infecção.
      1. Use o cateter venoso central como uma via crítica de acesso a fluidos para administração de medicamentos pós-operatórios e ressuscitação volêmica em macacos. Realize antissepsia diária com iodopovidona e curativo de gaze estéril para preservar a integridade do cateter e prevenir infecções.
      2. Mantenha o cateter venoso central in situ até o procedimento final de sacrifício para garantir um acesso vascular confiável.

3. Cirurgia do receptor (fase pré-implantação)

1. Incisão abdominal na linha média
   1. Seleção de incisão: Faça uma incisão abdominal na linha média com aproximadamente 12-15 cm de comprimento (Figura 1A).
   2. Detalhes da incisão: Incisar sequencialmente através da pele, fáscia superficial, linha alba, fáscia transversal e fáscia subperitoneal (incluindo gordura extraperitoneal) e, em seguida, incisar o peritônio parietal para acessar a cavidade abdominal. Use uma lâmina cirúrgica #23 para a incisão da pele e eletrocautério para uma dissecção mais profunda do tecido para obter corte e hemostasia simultâneos.
2. Exploração abdominal e manejo intestinal
   1. Adesiólise: Explore a cavidade abdominal para avaliar aderências, concentrando-se na presença de aderências entre os intestinos e a parede abdominal. Se presente, disseque cuidadosamente as aderências usando eletrocautério para minimizar a lesão tecidual e reduzir o risco de obstrução intestinal mecânica pós-operatória.
   2. Proteção intestinal: Exteriorize suavemente o intestino delgado e coloque-o em gaze úmida estéril para proteção para expor a aorta abdominal e a veia cava inferior.
3. Exposição da aorta abdominal e veia cava inferior
   1. Mobilize a aorta abdominal e a veia cava inferior: Disseque cuidadosamente os tecidos circundantes da aorta abdominal e da veia cava inferior, minimizando o risco de lesão vascular e sangramento. Exponha a aorta abdominal e a veia cava inferior entre as origens das artérias renais e a bifurcação das artérias ilíacas o mais completamente possível.
   2. Lidar com ramos vasculares: Preserve a artéria mesentérica inferior e sua veia acompanhante durante a dissecção. Preserve meticulosamente todos os ramos lombares.

4. Aquisição do coração do doador

1. Esternotomia mediana e mobilização do vaso
   1. Esternotomia mediana: Realizar esternotomia na linha média para acessar a cavidade torácica (Figura 1B). Divida cuidadosamente o esterno doador usando uma faca de esterno Lebsche.
   2. Mobilização do vaso: Depois de expor a cavidade torácica, incisar o pericárdio e dissecar meticulosamente para separar a aorta ascendente e a artéria pulmonar principal.
2. Pinçamento de vasos e resfriamento cardíaco
   1. Pinçamento do vaso: Coloque uma sutura em bolsa 4-0 na raiz da aorta e, em seguida, insira uma cânula de cardioplegia anterógrada de uso único para cardioplegia (Figura 1C). Pinçar sequencialmente as veias cava superior e inferior, seguido de pinçamento cruzado da aorta ascendente.
      1. Imediatamente após o pinçamento aórtico, faça uma incisão nas veias pulmonares e na veia cava inferior para descompressão, garantindo que as incisões sejam grandes o suficiente para drenagem suficiente.
   2. Resfriamento cardíaco: aspire a cavidade pericárdica para evacuar o sangue residual e, em seguida, mergulhe imediatamente o coração em solução salina gelada estéril para obter um ambiente hipotérmico (0-4 °C).
3. Monitorização de cardioplegia e perfusão
   1. Cardioplegia: Mantenha a pressão de perfusão em 150 mmHg usando uma bolsa de pressão. Perfundir o coração do doador com 30 mL/kg de peso corporal de solução HTK (por exemplo, 150 mL para um porco de 5 kg).
   2. Monitoramento da perfusão: palpar simultaneamente a raiz da aorta e o ventrículo esquerdo para verificar a pressão adequada de entrega da cardioplegia e evitar distensão ventricular. Após completar a infusão de cardioplegia, confirme a parada cardíaca por palpação e inspeção visual. Certifique-se da ausência de qualquer fibrilação miocárdica e, em seguida, prossiga com a excisão do coração do doador.
4. Ressecção e preservação cardíaca
   1. Ressecção cardíaca: Após a cardioplegia, aplique gelo adicional na cavidade pericárdica (Figura 1D). Eleve suavemente o coração e corte sequencialmente a veia cava inferior e as veias pulmonares usando uma tesoura cirúrgica. Tome cuidado especial para evitar lesões na veia cava superior e no átrio direito ao dividir a veia pulmonar superior direita.
      1. Proteja a traqueia enquanto dissocia a parede posterior do átrio esquerdo. Quando a dissecção atingir o nível do teto atrial esquerdo e das artérias pulmonares, coloque temporariamente o coração de volta na cavidade pericárdica.
      2. Dissocie e corte o arco aórtico proximal e a veia cava superior para expor o tronco pulmonar. Continue a dissecção ao longo dos planos de tecido em direção ao teto atrial esquerdo, permitindo a remoção do coração e seus grandes vasos.
         NOTA: Ligue com segurança o coto da veia ázigos após a ressecção cardíaca para evitar sangramento.
   2. Preservação cardíaca: Mergulhe imediatamente o coração explantado em solução salina gelada para preservação. Além disso, perfundir o coração do doador com outra solução da Universidade de Wisconsin (UW) a um volume de 30 mL/kg, pois a solução UW fornece proteção miocárdica superior (Figura 1E).
5. Principais diferenças da aquisição de coração de doadores humanos
   1. Configurações de pressão de infusão: Defina a pressão de perfusão na bolsa de pressão para 150 mmHg, o que é considerado ideal para perfusão miocárdica.
   2. Posição do grampo cruzado aórtico: Como os porcos têm apenas dois ramos principais do arco aórtico, os troncos braquiocefálicos esquerdo e direito, coloque o grampo cruzado entre esses ramos. Ligue o tronco braquiocefálico direito com suturas de seda antes do pinçamento cruzado para preservar um comprimento maior da aorta doadora.
   3. Estratégia de descompressão ventricular: Para minimizar a hiperdistensão ventricular e limitar o tempo isquêmico, descomprima apenas o ventrículo esquerdo rotineiramente. Se o ventrículo direito começar a inchar, abra a veia cava superior acima da veia ázigos. Se o ventrículo esquerdo inchar, faça uma incisão na veia pulmonar direita e estenda o corte em direção ao hilo pulmonar direito.

5. Implante cardíaco de doador

1. Preparação do coração do doador
   1. Preparo do coração do doador: Feche com segurança os orifícios da veia cava superior, da veia cava inferior e da veia pulmonar do átrio esquerdo usando pontos de prolene 4-0.
   2. Preservação do linfonodo sinoatrial: Preservar a veia cava superior do doador e o linfonodo sinoatrial localizado próximo ao apêndice atrial direito.
2. Anastomose término-lateral da artéria pulmonar com a veia cava inferior
   1. Heparinização: Administre 5.000 unidades de heparina sódica por via intravenosa ao macaco receptor antes da anastomose do coração do doador para evitar a formação de trombos.
   2. Anastomose da artéria pulmonar: Coloque uma pinça tangencial atraumática de DeBakey na veia cava inferior do receptor. Crie uma incisão longitudinal ligeiramente maior que a artéria pulmonar doadora para minimizar a estenose pós-operatória.
      1. Usando uma sutura de prolene 5-0 de braço duplo, inicie a anastomose na posição de 12 horas, inserindo uma agulha de dentro (lado luminal) do vaso receptor para fora. Insira a outra agulha do lado da artéria pulmonar doadora, passando do lúmen para o exterior na posição correspondente de 12 horas.
      2. Dê o nó inicial na parede externa do vaso. Inverta a direção da agulha, passando de fora para o lúmen da artéria pulmonar doadora. Continue a sutura contínua no sentido horário em direção à posição de 6 horas, usando um gancho de nervo para manter a tensão da sutura.
      3. Gire o coração para expor o lado oposto, mude para a outra agulha e suture a parede contralateral das 12 às 6 horas com um padrão de entrada da agulha de fora para dentro no vaso receptor e de dentro para fora no vaso doador, completando a anastomose término-lateral.
   3. Evacuação de ar: Antes de fixar o nó final, injete solução salina no local da anastomose para garantir a evacuação completa do ar. Oclua a artéria pulmonar doadora usando uma pinça vascular atraumática e, em seguida, libere sequencialmente a pinça vascular da veia cava inferior (Figura 1F).
3. Anastomose término-lateral da aorta doadora com a aorta abdominal receptora
   1. Anastomose aórtica: Pinçar parcialmente a aorta abdominal receptora usando uma pinça tangencial atraumática de DeBakey. Faça uma incisão longitudinal ligeiramente maior que o diâmetro da aorta doadora para evitar estenose pós-operatória.
      1. Usando uma sutura de prolene 5-0 de braço duplo, inicie a anastomose inserindo a agulha na posição de 12 horas de dentro (lado luminal) da aorta receptora para fora. Insira a outra agulha da aorta doadora na posição de 12 horas, também de dentro para fora, e amarre o primeiro ponto na parede externa do vaso.
      2. Inverta a direção da agulha, passando de fora para dentro no vaso doador, e suture continuamente no sentido horário até a posição de 6 horas, mantendo a tensão da sutura com um gancho nervoso. Vire o coração para expor o lado oposto, inverta a direção da agulha de acordo (de fora para dentro no vaso doador, de dentro para fora no vaso receptor) e suture continuamente das 12 às 6 horas, completando a anastomose término-lateral.
   2. Evacuação de ar: Antes de dar o nó final, injete solução salina na anastomose para remover o ar. Libere sequencialmente a pinça vascular da aorta abdominal para restaurar a circulação (Figura 1G).
4. Reperfusão e desfibrilação
   1. Prevenção da fibrilação ventricular: Administre 3 mg / kg de lidocaína por via intravenosa antes da reperfusão para prevenir a fibrilação ventricular. Observe o coração doador quanto a contrações espontâneas em 2 min.
   2. Desfibrilação: Se ocorrer fibrilação ventricular, aplique desfibrilação direta colocando as pás em contato direto com ambas as superfícies ventriculares (esquerda e direita) e aplique um choque bifásico de 5 Joules. O tempo isquêmico total do coração doador foi de aproximadamente 57,5 min ± 6,1 min (Tabela 1).
5. Colocação do dreno
   1. Drenagem por pressão negativa: Coloque um tubo de drenagem por pressão negativa na cavidade abdominal para evitar o acúmulo de líquido pós-operatório e monitore a hemorragia ativa.
   2. Indicação para remoção do dreno: Monitore o volume de drenagem pós-operatória e remova o dreno abdominal quando o débito de 24 horas cair abaixo de 25 mL.
6. Fechamento abdominal
   1. Fechamento abdominal e exame de ultrassom: Fechar a parede abdominal em camadas, aproximando a fáscia e o tecido subcutâneo com pontos absorvíveis 3-0, e fechar a pele com pontos de seda 1-0. Realizar ultrassonografia abdominal pós-operatória para avaliar a atividade cardíaca (Figura 1H).

6. Manejo pós-operatório e monitoramento do enxerto

1. Diretrizes de monitoramento e cuidados gerais
   1. Monitoramento comportamental e de sintomas: Monitore continuamente o status do receptor durante as duas primeiras semanas pós-operatórias usando vigilância por vídeo. Realize avaliações diárias de comportamento, apetite, distensão abdominal, dispneia, edema e defecação e micção normais.
      1. Monitore o peso corporal, a condição física geral, a cicatrização da incisão cirúrgica, a possível infecção do cateter venoso central, a aparência da mucosa e o acúmulo de líquido intra-abdominal.
   2. Avaliação ultrassonográfica: Use o ultrassom para avaliar a função do coração transplantado heterotopicamente e detectar qualquer derrame circundante se houver anormalidades. A Figura 2 apresenta imagens ecocardiográficas do xenoenxerto durante a diástole e sístole no dia 1 de pós-operatório (DPO), juntamente com a falha do enxerto observada no Experimento M3. A linha vermelha indica hipertrofia acentuada da parede do ventrículo esquerdo no xenoenxerto com falha.

Com base nas etapas processuais ilustradas na Figura 1, um modelo de xenotransplante cardíaco heterotópico reprodutível de porco para macaco foi estabelecido com sucesso. O processo cirúrgico incluiu uma laparotomia de linha média no macaco receptor para acessar a cavidade abdominal e uma esternotomia mediana no porco doador para aquisição cardíaca. Após pericardiotomia, o coração do doador foi interrompido com solução de HTK e posteriormente preservado com solução de UW sob hipotermia tópica. As anastomoses vasculares foram realizadas término-lateralmente entre a artéria pulmonar doadora e a veia cava inferior do receptor, e entre a aorta doadora e a aorta abdominal receptora. A avaliação ecocardiográfica pós-operatória confirmou que o coração doador retomou a atividade contrátil com função sistólica e diastólica preservada, indicando sucesso na reperfusão e viabilidade do enxerto. Esses resultados demonstram a viabilidade técnica do modelo e seu potencial para monitoramento funcional de longo prazo de xenoenxertos em primatas não humanos.

Figura 1: Transplante cardíaco heterotópico de porco para macaco: etapas cirúrgicas e ultrassonografia pós-operatória. (A) A cavidade abdominal do macaco foi inserida por meio de laparotomia mediana com dissecção em camadas. (B) Foi realizada esternotomia mediana para acesso à cavidade torácica do doador suíno, seguida de pericardiotomia. (C) Uma cânula de perfusão foi inserida na raiz aórtica do coração doador. (D) Após parada cardíaca induzida por perfusão em solução HTK, o coração do doador foi resfriado topicamente com lama salina. (E) Foi realizada perfusão subsequente com solução de preservação da Universidade de Wisconsin (UW). (F) A anastomose término-lateral foi criada entre a artéria pulmonar porcina e a veia cava inferior do receptor. (G) A anastomose término-lateral foi realizada entre a aorta suína e a aorta abdominal do receptor. (H) Foi realizada ecocardiografia pós-operatória para avaliar a função sistólica e diastólica do coração do doador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens ecocardiográficas de séries temporais de M3. (A) Imagens ecocardiográficas do xenoenxerto durante a diástole e sístole no pós-operatório (DPO) 1. (B) Imagens ecocardiográficas do xenoenxerto durante a diástole e sístole no DPO 3. (C) Imagens ecocardiográficas do xenoenxerto durante a diástole e sístole no DPO 10. (D) Imagens ecocardiográficas do xenoenxerto durante a diástole e sístole na falha do enxerto. A linha vermelha indica um aumento significativo na espessura da parede do ventrículo esquerdo durante a diástole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Tempo isquêmico total do coração doador.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.