Desvendando os meandros da xenofagia: lições de Legionella pneumophila

A prevalência de cepas bacterianas resistentes a medicamentos tornou imperativo buscar novas abordagens antibacterianas para combater doenças infecciosas. A autofagia, um processo eucariótico fundamental pelo qual as células desenvolvem vesículas fagocíticas contendo proteínas ou organelas celulares, desempenha um papel essencial na regulação da homeostase celular e de vários processos metabólicos¹. À medida que o conhecimento da autofagia se aprofunda, os pesquisadores descobriram que as vesículas autofágicas podem atingir seletivamente organelas, proteínas ou patógenos específicos². Xenofagia refere-se ao processo pelo qual as células reconhecem seletivamente patógenos intracelulares por meio da autofagia e os entregam aos lisossomos para depuração³. Este processo é crítico para o mecanismo de defesa do sistema imunológico inato em organismos eucarióticos⁴. Consequentemente, elucidar seus mecanismos e regulação é uma área essencial de pesquisa, com implicações significativas para o desenvolvimento de novas estratégias anti-infecciosas.

Legionella pneumophila é um patógeno intracelular Gram-negativo que geralmente infecta protistas unicelulares aquáticos. No entanto, os seres humanos podem desenvolver infecções oportunistas pelo contato com água contaminada, levando à doença do legionário, uma forma grave de pneumonia⁵. Ao entrar na célula hospedeira, a Legionella emprega o sistema de secreção tipo IV (T4SS) para transportar cerca de 330 proteínas efetoras, auxiliando na evasão da resposta imune do hospedeiro e garantindo a sobrevivência e proliferação bacteriana dentro das células. A Legionella, como a Salmonella, dificulta a xenofagia do hospedeiro usando proteínas efetoras, embora o mecanismo molecular preciso ainda não tenha sido estabelecido⁶. Por exemplo, Salmonella Typhimurium fornece efetores de secreção tipo III (por exemplo, SopF) que ADP-ribosilato a V-ATPase vacuolar e bloqueia o início da autofagia⁷, enquanto L. pneumophila usa o T4SS e efetores como RavZ e SidE para interferir nos estágios posteriores da xenofagia ^6,8. Apesar dessas táticas diferentes, ambos os patógenos acabam escapando da depuração xenófágica, destacando estratégias convergentes na evasão da autofagia. Portanto, investigar essas proteínas de virulência não apenas contribui para o desenvolvimento de terapias anti-infecciosas específicas, mas também tem o potencial de lançar luz sobre os meandros moleculares da xenofagia.

Mecanismos de xenofagia na depuração de patógenos

Em 1984, Rikihisa et al. fizeram uma descoberta significativa de que neutrófilos infectados por Rickettsia produzem autofagossomos, marcando o primeiro caso de envolvimento de autofagia em infecções bacterianas⁹. Um estudo mais aprofundado descobriu que a indução de autofagia em macrófagos por meio da rapamicina resulta na co-localização das proteínas relacionadas à autofagia LC-3 e Beclin-1 com vesículas contendo Mycobacterium tuberculosis , impedindo a proliferação bacteriana dentro das células¹⁰. Além disso, sabe-se que patógenos intracelulares como Salmonella typhi, Listeria, Shigella flexneri e Burkholderia mallei induzem autofagia, que subsequentemente controla seu crescimento dentro das células hospedeiras¹¹.

A xenofagia, uma forma de autofagia seletiva, compreende três processos distintos: reconhecimento de carga, recrutamento de receptores de autofagia e degradação mediada por lisossomos (conforme ilustrado na Figura 1). No entanto, o mecanismo pelo qual as células reconhecem patógenos invasores (reconhecimento de carga) e iniciam a autofagia permanece obscuro. Estudos sugerem que, quando as bactérias se infiltram no citoplasma, a ubiquitina ligase liga a ubiquitina a vacúolos ou proteínas infectados por patógenos presentes na superfície dos patógenos 12,13,14. Essas proteínas marcadas então se reúnem em uma camada de ubiquitina, envolvendo o patógeno e atuando como uma plataforma de sinalização para o recrutamento de adaptadores de autofagia, incluindo principalmente p62 / SQSTM1, NDP52, NBR1 e optineurina. Os adaptadores de autofagia facilitam a xenofagia interagindo com proteínas através do domínio de interação LC3 (LIR), além do domínio de ligação à ubiquitina (UBD) que medeia a ligação de proteínas ubiquitinadas¹⁵. Por exemplo, ligases hospedeiros E3 como LRSAM1 e Parkin ligam ubiquitina a bactérias invasoras, gerando assim o sinal do revestimento de ubiquitina que as sinaliza para depuração xenófagica^16,17. Além disso, os receptores de xenofagia também podem iniciar a xenofagia ligando-se à galectina na superfície do fagossomo bacteriano ou interagindo diretamente com proteínas da superfície bacteriana^18,19. Outra perspectiva propõe que as bactérias dentro do fagossomo podem alterar os gradientes iônicos da vesícula por meio de danos à membrana, levando a alterações conformacionais nas V-ATPases na membrana fagossômica, que recrutam o complexo Atg5-Atg12-Atg16L1 por meio da ligação ao domínio WD40 do ATG16L1 ^7,20. ATG16L1 também pode se ligar ao complemento C3 que reveste as bactérias engolfadas por meio de seu domínio WD40, recrutando o complexo Atg5-Atg12-Atg16L1 para o fagossomo bacteriano²¹. Ainda não está claro se esses diferentes mecanismos de reconhecimento têm como alvo espécies bacterianas distintas ou se ocorrem em diferentes estágios da infecção. Mais pesquisas e explorações são necessárias para entender completamente esses mecanismos.

Estratégias de patógenos para evitar a xenofagia

Durante a coevolução com seu hospedeiro, os patógenos intracelulares desenvolveram vários mecanismos para inibir a xenofagia^{22 , 23 , 24} . Isso resulta em uma resposta xenógica fraca durante as infecções, dificultando a observação²⁵. Por exemplo, o Streptococcus beta-hemolítico secreta uma cisteína protease chamada SpeB que tem como alvo p62, NDP52 e NBR1 para degradação. Mutantes com deleção de SpeB foram incapazes de resistir à autofagia e seu crescimento dentro das células foi suprimido. Esses achados confirmam o papel essencial desses adaptadores de autofagia na xenofagia. Descobriu-se que a proteína de virulência VirG de Shigella flexneri induz xenofagia recrutando Atg5 para a superfície bacteriana¹⁹. No entanto, a bactéria também emprega o sistema de secreção tipo III para transportar a proteína efetora IcsB, que inibe a ligação de ATG5 a VirG¹⁹. Consequentemente, a autofagia é impedida de ocorrer¹⁹. Essa competição entre proteínas bacterianas e maquinário de autofagia sugere que as proteínas Atg podem reconhecer diretamente as proteínas de superfície bacteriana para iniciar a xenofagia. Da mesma forma, a proteína de virulência CpbC de Streptococcus pneumoniae induz a degradação autofágica de Atg14 formando um complexo p62-CpbC-Atg14, que por sua vez diminui o nível de Atg14. Isso afeta o complexo Atg14-STX17, que medeia a interação lisossomo, inibindo assim a xenofagia²⁶.

Em um estudo utilizando Salmonella como bactéria modelo, Xu et al. descobriram que o dano da vesícula de membrana causado pela infecção é detectado pela V-ATPase, que leva à ativação da xenofagia por meio da ligação ao domínio WD40 do ATG16L1⁷. Essa ativação não faz parte da via típica da autofagia. Além disso, a proteína de virulência SopF tem a capacidade de mediar a ADP-ribosilação (ADPRilação) de V-ATPases e inibir sua capacidade de iniciar a xenofagia⁷. Isso ilustra como as bactérias e suas proteínas de virulência secretadas podem ser usadas como ferramentas valiosas para investigar e compreender o complexo fenômeno e os mecanismos da autofagia, que muitas vezes são difíceis de explorar em condições fisiológicas normais.

Legionella e xenofagia

L. pneumophila estabelece um nicho replicativo chamado vacúolo contendo Legionella (LCV) manipulando atividades biológicas essenciais, como ubiquitinação do hospedeiro²⁷, transporte de vesículas²⁸, metabolismo energético²⁹ e motilidade celular³⁰. Apesar da presença de numerosas proteínas ubiquitinadas dentro das bactérias intracelulares³¹, a Legionella desenvolveu vários mecanismos para neutralizar a autofagia, impedindo a fusão do LCV com os lisossomos ^6,8.

RavZ inibe a autofagia clivando LC3-II

A primeira proteína efetora de Legionella encontrada para regular a autofagia é RavZ (Lpg1683). Como uma cisteína protease, RavZ cliva a ligação amida entre a glicina terminal de carbono e o resíduo de aminoácido anterior de LC3, levando a um comprometimento irreversível da lipização de LC3⁸. Em comparação com a Legionella do tipo selvagem, a cepa mutante com deleção de RavZ (ΔravZ) mostrou um aumento significativo nos níveis de LC3-II e no número de pontos LC3 nas células hospedeiras após a infecção⁸. Uma cepa de Listeria geneticamente modificada (ΔhlyΔprfAcLLO) pode desencadear uma forte resposta xenógica ao entrar nas células. Ao co-infectar células, a Legionella do tipo selvagem pode suprimir o acúmulo de LC3 ao redor da cepa ΔhlyΔ prfAcLLO, mas ΔravZ perde sua capacidade de inibir a indução de xenofagia da cepa⁶. Além disso, a expressão transitória de RavZ nas células hospedeiras inibe a autofagia induzida pela fome⁸. Esses resultados sugerem que o RavZ exerce um amplo efeito de ação trans (ou seja, agindo difusamente no citosol) para antagonizar a autofagia. Surpreendentemente, a replicação do mutante ΔravZ não foi afetada nas células hospedeiras, e não houve recrutamento aparente de LC3 na membrana LCV contendo o mutante ΔravZ ^6,8. Esses achados sugerem que a Legionella pode utilizar outras proteínas efetoras, além da RavZ, para evitar a xenofagia do hospedeiro.

Família SidE e xenofagia

A família SidE consiste em quatro proteínas homólogas com mais de 170 kDa de tamanho, denominadas SdeA, SdeB, SdeC e SidE³². Essas proteínas de virulência são estruturalmente semelhantes com redundância funcional, todas contendo um domínio mono ADP-ribosiltransferase (mART) e um domínio fosfodiesterase (PDE). Estudos descobriram que, na ausência da enzima ativadora de ubiquitina (E1) e da enzima conjugadora de ubiquitina (E2), a família SidE funciona como uma ubiquitina ligase independente (E3), catalisando a modificação única da ubiquitinação da fosforibosil (PR-Ub) de substratos^{33 , 34 , 35} . Esse processo ocorre em duas etapas. Tomando SdeA como exemplo, primeiro, SdeA modifica o resíduo Arg42 da ubiquitina (Ub) com o grupo adenosina difosfato ribose (ADPR) derivado de NAD+ usando seu domínio mART, gerando um produto intermediário de ADPR-Ub^33,36. Em seguida, a ligação fosfodiéster de ADPR-Ub é clivada pelo domínio PDE funcional de SdeA, resultando na liberação de AMP e na conexão de PR-Ub com o resíduo de serina da proteína substrato³⁶.

A família SidE possui numerosos substratos proteicos eucarióticos. Além de mediar a ubiquitinação fosforibosil de GTPases como Rab1A, Rab6A e Rab33B para interferir no transporte vesicular ^33,37, estudos recentes descobriram que a família SidE também tem funções antagônicas contra a xenofagia 6,38,39,40. Em comparação com a Legionella do tipo selvagem, as cepas mutantes sem os genes codificadores da família SidE (ΔsidEs) mostram um aumento significativo no recrutamento de p62 no LCV⁶. Ao contrário do RavZ, que atua em trans, a família SidE trabalha em cis (atuando localmente no LCV) para proteger o próprio vacúolo de Legionella da xenofagia. As proteínas da família SidE que transportam Legionella não podem suprimir o recrutamento de p62 em torno de cepas co-infectadas de ΔhlyΔprfAcLLO^{Listeria 6}. Semelhante à cepa ΔravZ, o mutante ΔsidEs também pode escapar da xenofagia do hospedeiro. O mecanismo pelo qual SidE antagoniza a xenofagia não é claro e pode estar relacionado à sua interferência no sistema de ubiquitinação do hospedeiro mediado pela ubiquitinação fosforibosil. Por exemplo, a fosforribosilação da ubiquitina por SidE pode impedir o reconhecimento do LCV por receptores de ligação à ubiquitina, bloqueando assim o recrutamento de adaptadores como NDP52 ou optineurina para o vacúolo.

Outros efetores envolvidos em xenofagia

Além de RavZ e SidE, L. pneumophila codifica outros efetores - incluindo LpSpl, Lpg1137 e Lpg2936 - que visam vários estágios da via da autofagia. LpSpl é uma enzima secretada que imita a esfingosina-1-fosfato liase, clivando a esfingosina-1-fosfato (S1P) em metabólitos⁴¹. Essa depleção de S1P por LpSpl previne o acúmulo de esfingosina e resulta na ativação de mTORC1, inibindo assim o início da autofagia⁴¹. Lpg1137 é uma protease que cliva a proteína SNARE Sintaxina 17 (Stx17), que é necessária para a fusão autofagossomo-lisossomo⁴². Ao degradar Stx17, Lpg1137 interfere na maturação do autofagossomo e bloqueia a etapa final de fusão da xenofagia⁴². O Lpg2936 é um efetor nuclear que causa modificações epigenéticas de genes relacionados à autofagia (como ATG7 e LC3B), levando à sua expressão reduzida⁴³. Essa regulação negativa dos principais componentes da autofagia inibe a biogênese dos autofagossomos no nível transcricional⁴³. No entanto, pouco se sabe sobre os papéis de LpSpl, Lpg1137 e Lpg2936 na infecção por Legionella ; suas contribuições para a evasão da xenofagia in vivo ainda precisam ser totalmente elucidadas.

A Tabela 1 resume os principais efetores de L. pneumophila envolvidos na supressão da xenofagia, seus alvos e funções e os estágios da xenofagia que eles afetam.

Perspectiva futura

As principais incertezas permanecem e sugerem próximos passos concretos. Primeiro, a hierarquia temporal dos efetores de Legionella que atuam na xenofagia não foi resolvida (LpSpl / mTORC1 inicial versus RavZ médio / tardio, SidE); segundo, vários efetores moduladores de autofagia (por exemplo, LpSpl, Lpg2936) carecem de validação in vivo ; terceiro, a heterogeneidade do tipo celular das respostas xenógicas entre subconjuntos de macrófagos, epitélio e neutrófilos é mal mapeada. Propomos atlas de infecção resolvidos no tempo (pulse-chase, lipidômica LC3, proteômica PR-ubiquitina, repórteres ao vivo) para ordenar ações efetoras; cepas pareadas de deleção efetora (ΔravZ / ΔsidE / ΔlpSpl / Δlpg2936) em modelos de camundongos específicos do tipo de célula para estabelecer causalidade; e multi-ômica de célula única/espacial mais CRISPR/perturb-seq com foco no eixo V-ATPase-ATG16L1, marcação LRSAM1/Parkin e módulos adaptadores (OPTN/NDP52/p62). Translacionalmente, prevemos inibidores direcionados ao efetor que bloqueiam RavZ (sítio ativo da cisteína protease) ou SidE (mART/PDE PR-ubiquitinação) para restaurar pools de LC3-II e recrutamento de adaptadores no LCV, juntamente com boosters direcionados ao hospedeiro que melhoram a marcação de carga (ativam LRSAM1/Parkin), estabilizam o engajamento do adaptador-LC3 e ajustam transitoriamente o fluxo (ativação TFEB, mTORC1 moderado). A entrega direcionada ao pulmão (por exemplo, nanopartículas inaladas combinando um agente anti-RavZ/SidE com um agonista TFEB) deve ser comparada por leituras resolvidas por tipo de célula com registro de data e hora (fluxo LC3, ocupação de PR-Ub, recrutamento de adaptadores, métricas de fusão) e eficácia in vivo (carga bacteriana, patologia, sobrevivência).

L. pneumophila desenvolveu uma impressionante variedade de estratégias para evitar a xenofagia, principalmente por meio de suas diversas proteínas efetoras que interferem no reconhecimento de carga, ubiquitinação, maturação autofagossômica e fusão lisossômica. Esses mecanismos não apenas permitem que o patógeno sobreviva e se replique dentro das células hospedeiras, mas também revelam novos aspectos da regulação da autofagia. Compreender essas táticas de evasão fornece informações valiosas sobre a complexa interação entre a defesa do hospedeiro e a adaptação microbiana. Pesquisas futuras devem se concentrar na identificação de efetores adicionais, elucidando seus alvos moleculares e esclarecendo sua regulação temporal durante a infecção. Além disso, alavancar esses insights mecanicistas pode orientar o desenvolvimento de terapias direcionadas ao hospedeiro ou novos agentes antimicrobianos que restauram a função da xenofagia A integração contínua de imagens avançadas, biologia estrutural e abordagens ômicas será crucial para dissecar as interações dinâmicas entre L. pneumophila e a maquinaria de autofagia, potencialmente levando a estratégias inovadoras para combater patógenos intracelulares.

Finalmente, muitos efetores de Legionella são multifuncionais, afetando vários processos do hospedeiro além da autofagia. Os mesmos efetores que ajudam L. pneumophila a evitar a xenofagia também podem modular a morte da célula hospedeira (apoptose) e as vias de sinalização imunológica, promovendo ainda mais a sobrevivência bacteriana 23,30,35,44,45. Essa conversa cruzada entre a evasão da autofagia e outros mecanismos de defesa do hospedeiro ressalta a necessidade de estudar as táticas de virulência da Legionella de forma holística. Explorar como os efetores direcionados à autofagia influenciam simultaneamente a apoptose e a inflamação fornecerá uma compreensão mais abrangente das interações patógeno-hospedeiro e poderá revelar novos alvos para intervenção terapêutica.

Figura 1: Representação esquemática do mecanismo de xenofagia Quando as bactérias invadem o citoplasma, a ubiquitina é conjugada pela ubiquitina ligase a proteínas presentes na superfície do patógeno ou vacúolos infectados pelo patógeno, seguida pela formação de um revestimento de ubiquitina que envolve o patógeno. Este revestimento de ubiquitina atua como uma plataforma de sinalização para o recrutamento de adaptadores de autofagia. Além disso, os receptores de autofagia podem iniciar a xenofagia ligando-se à galectina de superfície do fagossomo bacteriano ou interagindo diretamente com proteínas de superfície bacteriana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Estratégias de xenofagia-evasão de efetores de L. pneumophila. Esta tabela lista proteínas efetoras selecionadas de L. pneumophila, seus alvos ou atividades moleculares e o estágio da via de xenofagia que elas interrompem.