Extração por sonicação de biomarcadores lipídicos de sedimentos

O primeiro passo na paleoclimatologia é coletar, ou extrair, os biomarcadores do sedimento em que são encontrados. As amostras ambientais são compostas de componentes não orgânicos, como minerais, água e metais, e componentes orgânicos que são criados por organismos vivos na área. Antes que esses componentes orgânicos possam ser usados pelos cientistas para elucidar informações sobre o passado, eles devem ser removidos de seu ambiente. A sonicação, que utiliza ondas ultrassônicas, é a mais simples e menos cara dessas técnicas.

Este vídeo faz parte de uma série sobre extração lipídica, purificação e análise de sedimentos. Ilustrará a extração lipídica por ultrassom e apresentará algumas aplicações do método.

Devido à ampla gama de biomarcadores, não há um único solvente otimizado para extrair todos eles. Isso é resumido pela regra chamada “como dissolve como as”, pela qual moléculas relativamente apolares se dissolvem em solventes apolares, como o diclorometano, e mais moléculas polares se dissolvem em solventes mais polares, como o metanol. Misturas de solventes para a extração de lipídios específicos ou grupos de lipídios são geralmente otimizadas empiricamente.

Para acelerar a extração e aumentar o rendimento, um sistema de sônica é usado para aplicar ultrassom – ondas com frequências superiores a 20 kHz, em conjunto com a mistura de solventes. Quando essas ondas entram em contato com a fase orgânica líquida, causam a formação de microbolhas de curta duração de vapores solventes que crescem rapidamente e entram em colapso. Em colapso, essas bolhas liberam uma enorme quantidade de energia como tesoura mecânica, facilitando a solubilização lipídica e aumentando drasticamente a eficiência da extração.

Após o processo de extração assistida por solventes, o resultado é uma preparação de extrato bruto, chamada extrato lipídudo total, que é submetida a uma purificação adicional para permitir o exame qualitativo e quantitativo de assinaturas lipídicas. Agora que você entende alguns dos principais princípios por trás da extração lipídica por sônica, vamos dar uma olhada em um protocolo de como o procedimento é realizado.

Colete os materiais amostrais necessários a partir de um local escolhido. Alguns exemplos são lacotrinas e sedimentos marinhos, solos terrestres, culturas microbianas ou folhas de plantas. O material coletado é congelado durante a noite. Depois disso, é congelado em uma secadora congelante por 2 a 3 dias. Esmague e homogeneize as amostras congeladas antes da extração com argamassa e pilão de solvente. Para remover contaminantes orgânicos, combustão as pipetas de vidro borossilicatas necessárias, frascos e latas de pesagem em um forno. Depois de permitir que o vidro esfrie no forno, enxágue as ferramentas metálicas com uma mistura de diclorometano e metanol. Uma vez que a amostra e os vidros são preparados, o procedimento de sônica pode começar.

A partir deste passo, todos os recipientes e vidros devem ser queimados antes de serem usados. Coloque a lata de pesagem em uma balança e tare. Enxágüe a espátula de laboratório com a mistura de solventes, então, use-a para transferir uma massa apropriada de amostra congelada e homogeneizada para a lata de pesagem e registe a massa. Transfira cuidadosamente a amostra pesada para um frasco rotulado. Usando a garrafa de esguicho de DCM:MeOH, adicione o suficiente para que a amostra esteja coberta por 1 a 2 cm de solvente e tampa o frasco. Coloque o frasco em um rack impermeável, agora pronto para a sônicação. Coloque o rack diretamente no banho de sônica. Verifique se o nível de água no banho de sônica é apenas profundo o suficiente para submergir os frascos de amostra até o topo do solvente de extração. Sonicate por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a sônicação, remova o rack do sonicator. Deixe os frascos sentarem-se para permitir que a fixação de sedimentos ocorra.

Remova a fase superior de diclorometano-metanol do frasco de extração usando uma pipeta e lâmpada, e transfira para outro frasco pré-pesado e rotulado. Repita o processo de sônica um total de três vezes para cada amostra. Colete os extratos em um frasco. Deixe as amostras extraídas secarem em seus frascos, tampas fora, e no capô, cobertos livremente com um pedaço de papel alumínio. Rotular como ‘resíduo extraído’ e armazenar no solvente de extração. Agora que os biomarcadores foram extraídos, eles devem ser purificados antes que a análise possa ocorrer.

A sônica acelera vários processos de extração de solventes e é amplamente utilizada em estudos geoquímicos. Muitos arqueólogos trabalham com geoquímicos para reconstruir as circunstâncias ambientais e culturais sob as quais as civilizações humanas primitivas viviam. A cerâmica, uma das mais antigas invenções humanas, quando desenterrada, pode ser encontrada para conter fósseis moleculares residuais de vinho, arroz ou outros conteúdos que já foram armazenados dentro.

Para desenterrar evidências químicas de substâncias absorvidas nas superfícies, pequenas amostras de cerâmica são sônicas na presença de solventes orgânicos e compostos extraídos podem ser posteriormente identificados rio abaixo por métodos espectroscópicos. Esse tipo de análise ajuda os arqueólogos a detectar os tipos de recursos disponíveis para populações antigas e reconstruir as condições de seu habitat.

Microalgas fotossintéticas são encontradas em ecossistemas marinhos e de água doce. Como crescem na mídia baseada em água do mar e sua cultura ocupa áreas significativamente menores, eles agora estão sendo amplamente estudados como uma alternativa promissora às plantas terrestres para a produção de biocombustíveis.

Para extrair lipídios de uma biomassa microálgica, esses pesquisadores descrevem uma extração de solvente assistida por sônica. A cavitação acústica durante a sônica efetivamente interrompe paredes de células microánguas rígidas, a fim de liberar lipídios. Tais técnicas auxiliam na caracterização de novas microalgas do meio ambiente para a produção de fontes de energia não petrolíferas.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à Extração Assistida por Biomarcadores de Sedimentos. Os vídeos a seguir explicarão como o extrato é purificado para análise.

Obrigado por assistir!