2.11: Isolamento de bactérias fecais de amostras de água por filtração

1. Coleta e Processamento de Amostras de Água

1. Coletar várias amostras de água 1-L da fonte de água de teste (por exemplo, fontes de água, piscinas, reservatórios, sistemas de distribuição de água, esgoto bruto ou tratado), e transportar gelo para o laboratório para análise microbiana.
2. Esterilize ou higienize o conjunto de coletores de filtragem de membrana antes do uso por autoclaving, exposição à radiação UV (2 min) ou ignição por etanol-chama.
3. Após o resfriamento de todas as peças, conecte corretamente o coletor a uma bomba de vácuo e frasco de resíduo de filtragem de vácuo contendo alvejante.
4. A chama de etanol esteriliza um par de fórceps e, com eles, remove um filtro de membrana estéril e gridded de sua embalagem. São tipicamente utilizadas membranas de 47 mm de diâmetro com tamanho de poros de 0,45 μm. No entanto, diâmetros alternativos e tamanhos de poros podem ser empregados desde que o tamanho dos poros possa prender suficientemente os microrganismos alvo, e pelo menos 70% da área do filtro é composta por espaço poroso.
5. Coloque o filtro no centro da área de filtragem da membrana do coletor, e aplique um funil de filtro estéril na unidade e fixá-lo no lugar.
6. Meça um volume desejado de água de teste (por exemplo, 100 mL) e adicione-a ao funil (uma marca de linha de 100 mL é visível no funil).
7. Aplique um vácuo parcial [diferencial de pressão de 34 a 51 kPa (kiloPascals)] para desenhar a amostra de ensaio através do filtro. Material sólido total suspenso, incluindo bactérias e matéria orgânica em decomposição, maior do que o tamanho médio do poros do filtro de 0,45 μm estão presos no filtro. Partículas menores, incluindo vírus e sólidos dissolvidos, como pequenas quantidades de matéria orgânica e sais, passarão pela membrana e pelo frasco de vácuo do recipiente de resíduos contendo alvejante.
8. Após a passagem completa da amostra através do filtro, enxágue o interior do funil com volumes de 20 a 30 mL de água estéril.
9. Desligo o vácuo e remova o funil do coletor após o fechamento da lavagem final.
10. Com fórceps esterilizados com chama de etanol, remova imediatamente o filtro de membrana da unidade e coloque-o prontamente no meio de agarose de crescimento adequado para o microrganismo alvo (a Tabela 1 lista as condições recomendadas de mídia de crescimento e incubação para cada um).
11. Aplique o filtro de membrana na superfície da ágarose com um movimento tipo rolo para garantir o contato completo da membrana com o meio de crescimento e evitar a armadilha das bolhas de ar.
12. Substitua o funil de filtragem usado por uma unidade estéril entre o processamento de cada amostra e o etanol-higienize o coletor de aço inoxidável, a fim de evitar a contaminação cruzada.

2. Enumeração da Colônia

1. Após o período de incubação, remova as placas de crescimento da incubadora para enumeração.
2. Idealmente, realizar a contagem da colônia sob baixa ampliação de energia usando uma fonte de luz branca fria.
3. Coliformes totais
   1. Colônias coliformes totais são tipicamente rosa a vermelho-escuro na cor com um brilho de superfície metálica. O brilho em si pode cobrir parcial ou completamente a colônia. Morfologias totais de colônia coliformes atípicas podem ser vermelhas, mucoides ou nucleadas sem brilho.
   2. Colônias que são rosa, azul, branca ou incolor enquanto sem brilho são consideradas não coliformes.
4. Coliformes fecais
   1. Colônias coliformes fecais aparecem como vários tons de azul.
   2. Colônias coliformes não-africanas são cinza para creme na cor.
5. Enterococci fecal
   1. As colônias de enterococci fecal variam de cor rosa a vermelho escuro.

3. Verificação da Colônia

1. Coliformes totais
   1. Para uma verificação presença-ausência, cotonete toda a membrana usando um laço inoculante estéril. Para colônias, é preferível verificar pelo menos cinco de morfologias típicas e atípicas.
   2. Transfira a colônia selecionada para um vaso de vidro contendo caldo de lauryl tryptose com um tubo durham. Incubar os tubos inoculados a 35±0,5 °C por 48 h. A presença de turbidez indicando crescimento em conjunto com a produção de gás verifica a colônia como um coliforme.
2. Coliformes fecais
   1. Transfira colônias de cor azul asepticamente em vasos de vidro contendo meio EC estéril com um tubo durham. Incubar os tubos inoculados a 44,5 ± 0,2 °C por 24 h. A presença de turbidez indicando crescimento em conjunto com a produção de gás verifica a colônia como coliforme fecal.
3. Enterococci fecal
   1. Colônias de greve tipificando a morfologia de enterococci fecal para isolamento asepticamente no Ágar de Infusão Cérebro-Coração (BHIA), e incubam a 35 ± 0,5 °C por 24 a 48 h.
   2. Transfira o crescimento de uma colônia isolada na BHIA para dois slides de vidro pré-limpos.
   3. Adicione duas a três gotas de peróxido de hidrogênio de 3% para manchas preparadas nos slides. O aparecimento rápido de bolhas indica um resultado "catalase positivo", e o isolado não é uma bactéria estreptococo fecal.
   4. Realize uma mancha gram para testes isolados como "catalase negativo" (sem bolhas observadas). Enterococci fecal são Gram-positivos, vazios, e aparecem principalmente em pares ou cadeias curtas.

Mesa 1. Mídia de crescimento cultural comumente utilizada para a detecção de indicadores bacterianos fecais em amostras ambientais
¹ Conforme recomendado pelos Métodos Padrão para o Exame de Água e Esgoto (American Public Health Asssociation and the American Water Works Association, 22ª Edição, 2012)

A filtração por membrana e a subsequente cultura de bactérias coletadas é uma técnica útil para avaliar a qualidade e a limpeza de uma fonte de água.

A qualidade da água destinada ao uso em ambientes agrícolas, recreativos ou domésticos é de grande importância, devido ao potencial de surtos de doenças transmitidas pela água. Se a água estiver contaminada com matéria fecal de animais ou humanos, parasitas, bactérias ou vírus patogênicos podem se espalhar para novos hospedeiros após sua ingestão. O monitoramento das fontes de água para esses organismos causadores de doenças é, portanto, fundamental para garantir a saúde pública.

O grande número e variedade de patógenos feco-orais que podem estar presentes em uma fonte de água torna impraticável testar cada um de forma independente e regular. Em vez disso, os ensaios microbiológicos comuns para a qualidade da água utilizam bactérias indicadoras de coliformes. Para mais informações sobre este processo, ver o vídeo desta coleção sobre organismos indicadores.

Este vídeo ilustrará o processo de filtração por membrana em uma amostra de água ambiental, demonstrará como cultivar vários tipos de bactérias indicadoras fecais, incluindo coliformes totais, coliformes fecais e entercocos fecais, e descreverá como verificar a presença de contaminação fecal.

A técnica de filtração por membrana utiliza pressão negativa para coletar amostras de água através de um filtro e capturar bactérias. O filtro é uma membrana especializada com um tamanho médio mínimo de poros de 0,45 μm que permite a captura de bactérias, que normalmente têm cerca de 1 μm de tamanho. Após a filtração, a membrana é aplicada ao meio de crescimento de agarose e incubada em condições apropriadas para cultivar os microrganismos alvo.

Essa técnica é mais ideal para fontes de baixa turbidez, como água potável, piscinas ou lagos e reservatórios. Água com alto teor de material particulado pode resultar em incrustação ou entupimento do filtro, limitando o volume que pode ser processado. Além disso, a filtração por membrana não é prática para fontes de água contendo um grande número de bactérias de fundo ou não coliformes, como esgoto bruto, pois isso pode aumentar a dificuldade de enumerar coliformes alvo na cultura e incubação.

Uma vez que as amostras bacterianas tenham sido presas no filtro, elas podem ser transferidas para placas de crescimento para determinar os tipos de bactérias indicadoras presentes nas amostras de água. O revestimento em diferentes tipos de meios seleciona diferentes tipos de bactérias e pode permitir uma identificação rápida.

Após o crescimento em placas específicas de cultura, a confirmação adicional das identidades das bactérias indicadoras pode ser realizada usando técnicas como a coleta de colônias em meio líquido e o uso de tubos de Durham para capturar gases, que só devem ser produzidos na presença de coliformes fecais ou coliformes totais. Além disso, a suspeita de enterococos fecais pode ser confirmada por uma combinação de uma coloração de Gram positiva, juntamente com um teste negativo de peróxido de hidrogênio-catalase.

Agora que estamos familiarizados com os princípios por trás da filtração por membrana de amostras de água, vamos dar uma olhada em como esse procedimento é realizado.

Para iniciar o procedimento, primeiro colete amostras de água de fontes de água de teste de interesse. Certifique-se de que as amostras sejam coletadas em frascos estéreis de 1 L. Quando a coleta estiver concluída, coloque as amostras no gelo e transporte-as para o laboratório para análise microbiana.

Para iniciar a análise, primeiro esterilize um coletor de filtração por membrana. Em seguida, conecte o coletor a uma bomba de vácuo e a um frasco de resíduos de filtragem contendo alvejante.

O etanol esteriliza a pinça por chama e remove uma membrana estéril da embalagem. Coloque o filtro no centro da área de filtração por membrana do coletor e aplique um funil de filtro estéril na unidade e, em seguida, prenda no lugar.

Meça um volume desejado de água de teste no funil. Aplicar um vácuo parcial para aspirar a amostra de ensaio através do filtro. Material sólido suspenso, incluindo bactérias e outras matérias orgânicas, com mais de 0,45 μm ficará preso no filtro ou dentro dele, enquanto partículas menores, vírus e sólidos dissolvidos passarão para o frasco de resíduos contendo alvejante.

Depois que a amostra passar pelo filtro, enxágue o interior do funil com 25 mL de água estéril 3 vezes, permitindo que ela passe pelo filtro. Quando o enxágue final estiver concluído, desconecte o aspirador e remova o funil do coletor.

Em seguida, esterilize a pinça de esterilização por chama de etanol e remova imediatamente o filtro de membrana da unidade. Coloque-o na placa de crescimento apropriada para o microrganismo alvo usando um movimento de rolamento para garantir o contato completo com a superfície e evitar a retenção de bolhas de ar.

Para o processamento de cada amostra adicional, higienize o coletor de aço inoxidável e use um funil estéril para evitar contaminação cruzada. Por fim, coloque as placas em uma incubadora durante o período de incubação apropriado.

Após o período de incubação, remova as placas da incubadora para enumeração. Se possível, execute a contagem de colônias sob ampliação de baixa potência usando uma fonte de luz branca fria. Para determinar os coliformes totais, identifique e conte as colônias que aparecem de cor rosa a vermelho escuro e têm um brilho de superfície metálica cobrindo total ou parcialmente a colônia. As colônias de coliformes totais atípicas podem aparecer vermelho-escuras, mucoides ou nucleadas sem brilho.

As colônias que aparecem azuis, brancas, incolores ou rosa sem brilho são consideradas não coliformes e não devem ser incluídas na contagem total de coliformes.

As colônias de coliformes fecais aparecerão em vários tons de azul e devem ser contadas como uma categoria separada. As colônias de coliformes não fecais são tipicamente de cor cinza a creme e também devem ser registradas em uma categoria individual. Finalmente, as colônias de enterococos fecais variam de rosa a vermelho escuro e devem ser contadas separadamente.

Para verificar o total de colônias de coliformes, aplique uma alça de inoculação esterilizada e resfriada em uma única colônia de interesse. Transfira a colônia selecionada para um recipiente de vidro contendo caldo de lauril triptose e um tubo de Durham. Em seguida, coloque as culturas em uma incubadora. A presença de turbidez junto com a produção de gás capturada pelo tubo de Durham verifica a colônia como um coliforme total.

Para verificação de coliformes fecais, transfira assepticamente as colônias de cor azul para recipientes de vidro contendo meio EC estéril e um tubo de Durham. Coloque os tubos inoculados em uma incubadora. Após a incubação, inoculações turvas em conjunto com a produção de gás confirmam que a colônia é um coliforme fecal.

Para confirmar os enterococos fecais, transfira assepticamente as colônias suspeitas com a morfologia correta para placas de ágar de infusão cérebro-coração e incuba. Em seguida, transfira o crescimento de uma colônia isolada em BHIA?para duas lâminas de vidro estéreis.

Adicione 2-3 gotas de peróxido de hidrogênio a 3% em uma das lâminas de vidro. A produção rápida de gás indica uma bactéria positiva para catalase, como Citrobacter. As bactérias enterococos fecais são catalase negativas; portanto, nenhum borbulhar é observado. Para colônias negativas para catalase que não apresentam bolhas, faça uma coloração de Gram. Como enterococos fecais, estes devem parecer Gram positivos, de forma ovóide e agrupados principalmente em pares ou cadeias curtas.

Encontrar qualquer uma dessas bactérias indicadoras em uma fonte de água indica a presença de uma contaminação. Se mais de 5% das amostras estiverem contaminadas durante um período de um mês, a fonte pode ser considerada imprópria para consumo humano.

A filtração por membrana é comumente usada em várias aplicações biológicas, e os organismos indicadores fecais também podem ser detectados por outros procedimentos experimentais. Algumas dessas aplicações são exploradas aqui.

A filtração por membrana também pode ser usada na captura de vírus de amostras de água. Como os vírus normalmente estão presentes em níveis muito baixos, as amostras de água devem ser concentradas para capturá-las para análise. Os vírus capturados podem então ser liberados dos filtros e identificados usando técnicas como ensaios de infectividade de cultura de células ou PCR.

A filtração por membrana também é utilizada na produção de água de alta pureza para uso industrial ou laboratorial. Muitas indústrias exigem água altamente purificada para seus processos operacionais, e a filtração por membrana pode servir para remover contaminantes, incluindo metais dissolvidos indesejados e sais da água. Também pode ser usado na dessalinização de água salgada para produzir água potável.

Você acabou de assistir à introdução de JoVE à identificação de organismos indicadores na água por filtração por membrana. Agora você deve entender como filtrar amostras de água por membrana, como cultivar vários tipos de bactérias indicadoras fecais da membrana e como confirmá-las como organismos indicadores. Obrigado por assistir!