Isolamento de bactérias fecais de amostras de água por filtração

1. Coleta e Processamento de Amostras de Água

1. Coletar várias amostras de água 1-L da fonte de água de teste (por exemplo, fontes de água, piscinas, reservatórios, sistemas de distribuição de água, esgoto bruto ou tratado), e transportar gelo para o laboratório para análise microbiana.
2. Esterilize ou higienize o conjunto de coletores de filtragem de membrana antes do uso por autoclaving, exposição à radiação UV (2 min) ou ignição por etanol-chama.
3. Após o resfriamento de todas as peças, conecte corretamente o coletor a uma bomba de vácuo e frasco de resíduo de filtragem de vácuo contendo alvejante.
4. A chama de etanol esteriliza um par de fórceps e, com eles, remove um filtro de membrana estéril e gridded de sua embalagem. São tipicamente utilizadas membranas de 47 mm de diâmetro com tamanho de poros de 0,45 μm. No entanto, diâmetros alternativos e tamanhos de poros podem ser empregados desde que o tamanho dos poros possa prender suficientemente os microrganismos alvo, e pelo menos 70% da área do filtro é composta por espaço poroso.
5. Coloque o filtro no centro da área de filtragem da membrana do coletor, e aplique um funil de filtro estéril na unidade e fixá-lo no lugar.
6. Meça um volume desejado de água de teste (por exemplo, 100 mL) e adicione-a ao funil (uma marca de linha de 100 mL é visível no funil).
7. Aplique um vácuo parcial [diferencial de pressão de 34 a 51 kPa (kiloPascals)] para desenhar a amostra de ensaio através do filtro. Material sólido total suspenso, incluindo bactérias e matéria orgânica em decomposição, maior do que o tamanho médio do poros do filtro de 0,45 μm estão presos no filtro. Partículas menores, incluindo vírus e sólidos dissolvidos, como pequenas quantidades de matéria orgânica e sais, passarão pela membrana e pelo frasco de vácuo do recipiente de resíduos contendo alvejante.
8. Após a passagem completa da amostra através do filtro, enxágue o interior do funil com volumes de 20 a 30 mL de água estéril.
9. Desligo o vácuo e remova o funil do coletor após o fechamento da lavagem final.
10. Com fórceps esterilizados com chama de etanol, remova imediatamente o filtro de membrana da unidade e coloque-o prontamente no meio de agarose de crescimento adequado para o microrganismo alvo (a Tabela 1 lista as condições recomendadas de mídia de crescimento e incubação para cada um).
11. Aplique o filtro de membrana na superfície da ágarose com um movimento tipo rolo para garantir o contato completo da membrana com o meio de crescimento e evitar a armadilha das bolhas de ar.
12. Substitua o funil de filtragem usado por uma unidade estéril entre o processamento de cada amostra e o etanol-higienize o coletor de aço inoxidável, a fim de evitar a contaminação cruzada.

2. Enumeração da Colônia

1. Após o período de incubação, remova as placas de crescimento da incubadora para enumeração.
2. Idealmente, realizar a contagem da colônia sob baixa ampliação de energia usando uma fonte de luz branca fria.
3. Coliformes totais
   1. Colônias coliformes totais são tipicamente rosa a vermelho-escuro na cor com um brilho de superfície metálica. O brilho em si pode cobrir parcial ou completamente a colônia. Morfologias totais de colônia coliformes atípicas podem ser vermelhas, mucoides ou nucleadas sem brilho.
   2. Colônias que são rosa, azul, branca ou incolor enquanto sem brilho são consideradas não coliformes.
4. Coliformes fecais
   1. Colônias coliformes fecais aparecem como vários tons de azul.
   2. Colônias coliformes não-africanas são cinza para creme na cor.
5. Enterococci fecal
   1. As colônias de enterococci fecal variam de cor rosa a vermelho escuro.

3. Verificação da Colônia

1. Coliformes totais
   1. Para uma verificação presença-ausência, cotonete toda a membrana usando um laço inoculante estéril. Para colônias, é preferível verificar pelo menos cinco de morfologias típicas e atípicas.
   2. Transfira a colônia selecionada para um vaso de vidro contendo caldo de lauryl tryptose com um tubo durham. Incubar os tubos inoculados a 35±0,5 °C por 48 h. A presença de turbidez indicando crescimento em conjunto com a produção de gás verifica a colônia como um coliforme.
2. Coliformes fecais
   1. Transfira colônias de cor azul asepticamente em vasos de vidro contendo meio EC estéril com um tubo durham. Incubar os tubos inoculados a 44,5 ± 0,2 °C por 24 h. A presença de turbidez indicando crescimento em conjunto com a produção de gás verifica a colônia como coliforme fecal.
3. Enterococci fecal
   1. Colônias de greve tipificando a morfologia de enterococci fecal para isolamento asepticamente no Ágar de Infusão Cérebro-Coração (BHIA), e incubam a 35 ± 0,5 °C por 24 a 48 h.
   2. Transfira o crescimento de uma colônia isolada na BHIA para dois slides de vidro pré-limpos.
   3. Adicione duas a três gotas de peróxido de hidrogênio de 3% para manchas preparadas nos slides. O aparecimento rápido de bolhas indica um resultado "catalase positivo", e o isolado não é uma bactéria estreptococo fecal.
   4. Realize uma mancha gram para testes isolados como "catalase negativo" (sem bolhas observadas). Enterococci fecal são Gram-positivos, vazios, e aparecem principalmente em pares ou cadeias curtas.

Indicador bacteriano fecal	Mídia recomendada (Temperatura de incubação, tempo) 1
Coliformes totais	LES Endo Agar (35 ± 5 °C, 24 h) M-Endo Médio (35 ± 5 °C, 24 h)
Coliformes fecais	m-FC Médio (44,5 ± 0,2 °C, 24 h)
Enterococci fecal	m Enterococcus Agar (35 ± 0,5 °C, 48 h)

Mesa 1. Mídia de crescimento cultural comumente utilizada para a detecção de indicadores bacterianos fecais em amostras ambientais
¹ Conforme recomendado pelos Métodos Padrão para o Exame de Água e Esgoto (American Public Health Asssociation and the American Water Works Association, 22ª Edição, 2012)