5.10: Retirada de Sangue I

1. Sangramento retro-orbital

1. Equipamento
   1. Prepare um frasco de sino, ou câmara de indução anestésico, para administrar um gás anestésico como isoflurano. Ao usar um frasco de sino, é imprescindível que o anestésico líquido não entre em contato com o animal, para evitar a absorção através da pele. Uma plataforma com pequenos buracos pode ser usada.
   2. São preferidos tubos de microhematocrito que possuem 50-75 microliters. Os tubos embrulhados mylar são menos propensos a quebrar entre os dedos do operador e devem ser considerados como uma medida de segurança.
   3. Várias espessuras de papel toalha, ou outros materiais isolantes, são colocadas na superfície de trabalho para manter o calor corporal do animal durante o procedimento.
2. Preparação e posicionamento do animal
   1. O animal é anestesiado com um anestésico de inalação, como isoflurano, em um frasco de sino ou câmara de indução de anestesia a gás, para efeito.
   2. Uma vez que o animal é totalmente anestesiado, ele é removido e colocado em recumedência lateral.
   3. O olho é salientes colocando um dedo na parte superior da cabeça e ao longo da mandíbula, e puxando a pele para trás e para baixo.
   4. Evite aplicar pressão na traqueia, pois isso pode entrar em colapso ou ocluir as vias aéreas causando a morte por asfixia.
3. Retirada de sangue
   1. O microhematocrit é colocado no canthus medial do olho e direcionado caudally a um ângulo de 30-45° do plano do nariz.
   2. Aplique pressão enquanto gira suavemente o tubo hematócrito. Isso cortará as membranas conjuntivistas e romperá o plexo ocular.
   3. O sangue fluirá para o tubo hematócrito por ação capilar.
   4. Evite empurrar tão fundo que você atingiu o osso na parte de trás da cavidade ocular.
   5. Uma vez que o sangue começa a fluir, mantenha a pressão para manter o olho salientes.
   6. Para coletar vários tubos de sangue, não é necessário colocar o próximo tubo no plexo ocular, pois o sangue continuará a fluir e pode ser coletado como vem do canthus medial.
   7. Para parar de sangrar, solte a pele e deixe o olho voltar à posição normal. Aplique pressão na órbita para garantir hemostasia.

Figura 1. Retirada de sangue orbital retrô em camundongos.

2. Procedimentos de sangramento na cauda: corte de cauda e corte de cauda

1. Equipamento
   1. Uma lâmina de bisturi estéril, de preferência uma lâmina número 11 ou uma lâmina de barbear de um lado único, é usada para fazer a amputação inicial para o método de corte de cauda. A tesoura não deve ser utilizada porque o corte feito por tesoura é esmagamento, promovendo assim a coagulação e a redução do fluxo sanguíneo. Para o procedimento de corte da cauda, uma lâmina de bisturi número 11 ou 15 é usada para fazer o corte.
   2. Um tubo de contenção que permite o acesso à cauda do mouse é preparado.
   3. Toalhas de papel absorvente ou gaze são usadas como substrato para a realização do corte de cauda.
   4. Também são necessários tubos de coleta ou tubos hematócritos.
   5. O pó esticado deve estar disponível para auxiliar na hemostasia.
2. Restrição
   1. O animal é colocado no tubo de tal forma que a cauda é acessível. Para os contê-inérculos do tipo Broome, o animal é puxado garupa primeiro para dentro do tubo. Para outros tubos, o animal é colocado de cabeça.
   2. Os animais são fixados no tubo de tal forma que não podem se virar ou retirar a cauda.
   3. Alguns camundongos permitirão a coleta de cauda e sangue com mínima contenção manual se eles forem autorizados a pegar uma superfície áspera.
   4. Alguns ratos exigirão anestesia por inalação para este método de coleta de sangue.
3. Retirada de sangue
   1. A cauda é limpa com água morna para remover detritos e causar leve vasodilatação. NÃO use água quente.
   2. Para o corte da cauda, a cauda é estendida, e a extremidade da cauda (0,5-1 mm para ratos e até 2 mm para ratos) é cortada com a lâmina do bisturi.
   3. Para o corte da cauda, a cauda é estendida, e um corte é feito com a lâmina do bisturi aproximadamente 2/3 a distância da garupa, diretamente sobre a veia traseira lateral.
   4. A cauda pode ser acariciada de garupa para ponta para incentivar o fluxo sanguíneo; no entanto, isso diminuirá a qualidade da amostra.
   5. O sangue é coletado da ponta ou corte usando tubos hematócritos ou permitido pingar em um frasco de coleta.

3. Coleta de sangue cardíaco

1. Equipamento
   1. Para um rato, é preferível uma seringa de 3 cc com uma agulha calibre 22-25 x 1". Seringas menores não têm a mesma pressão nas costas e podem dificultar a retirada de sangue. Agulhas menores que 25 medidores restringem o fluxo de sangue, levando ao aumento da coagulação e danos às células sanguíneas. Agulhas menores que 1" podem não atingir o nível do coração quando se aproximam do diafragma.
   2. Para um rato, é preferível uma seringa de 10-12 cc com uma agulha de calibre x 1,5". Dependendo do tamanho do rato, uma seringa menor pode não conter todo o volume sanguíneo a ser coletado, e assim a seringa teria que ser alterada durante o procedimento. Agulhas menores que 20 medidores restringem o fluxo do sangue, levando ao aumento da coagulação. Agulhas menores que 1,5" podem não atingir o nível do coração quando se aproximam do diafragma.
   3. Um tubo de coleta de sangue de tamanho suficiente é usado para manter o sangue coletado.
2. Restrição
   1. A contenção adequada é essencial para o sucesso deste método. O animal é segurado pelo scruff com o corpo pendurado verticalmente. É importante que o corpo seja reto para evitar a deflexão do coração ou uma torção do peito.
   2. Uma posição alternativa é a recumbência dorsal ao colocar a agulha entre as costelas do lado esquerdo do animal. Isso é especialmente útil para ratos muito grandes ou quando vários animais devem ser sangrados.

Figura 2. Retirada de sangue cardíaco com rato mantido verticalmente.

3. Retirada de sangue
   1. A abordagem do aspecto posterior, pontuando o diafragma é mais facilmente realizada quando o rato ou rato é mantido verticalmente pelo scruff.
      1. A agulha é avançada no entalhe apenas à esquerda do xiphoide do animal.
      2. A agulha deve ser paralela à coluna vertebral e colocada logo abaixo das costelas.
      3. O coração está localizado aproximadamente ao nível do cotovelo.
      4. Coloque a agulha, bisbida, no peito, e perfure o coração.
      5. Aplique uma leve pressão nas costas com a seringa. Se a agulha estiver no coração, o sangue fluirá para dentro da seringa.
      6. Espere até que o sangue tenha enchido a seringa antes de adicionar pressão adicional nas costas na seringa.
   2. A abordagem lateral do lado esquerdo do animal requer o posicionamento do animal na recumbência dorsal.
      1. O ponto de entrada é medido contra o ponto do cotovelo na parede do peito. O coração está localizado aproximadamente ao nível do cotovelo.
      2. A agulha é inserida perpendicular ao plano da mesa em um ponto no meio da parede do peito como medido dorsoventrally.
      3. Coloque a agulha, bisbida, no peito, e perfure o coração.
      4. Aplique uma leve pressão nas costas com a seringa. Se a agulha estiver no coração, o sangue fluirá para dentro da seringa.
      5. Espere até que o sangue tenha enchido a seringa antes de adicionar pressão adicional na seringa.

Figura 3. Retirada de sangue cardíaco com rato em posição de recumbência dorsal.

4. Dicas técnicas
   1. O coração normal está situado com o ápice apontando para a esquerda. Em raros casos, o coração pode ser invertido, resultando em dificuldade em perfurar o coração.
   2. A pressão excessiva nas costas na seringa pode colapsar o coração, ocluindo o bisel da agulha e impedindo o fluxo sanguíneo para dentro da seringa.
   3. Aplicar pressão traseira e liberá-la repetidamente iniciará a coagulação na seringa.
   4. Aplicar suavemente pressão no fígado pode forçar o volume sanguíneo adicional para o sistema circulatório, tornando-o disponível para retirada.

4. Retirada posterior de sangue vena cava

4. Equipamento
   1. Uma seringa de tuberculose com uma agulha calibre 25-29 é usada para coleta de sangue no camundongo. Para ratos, é necessária uma seringa de 10-12 cc com uma agulha calibre 22-25 x 1".
   2. Uma plataforma cirúrgica, bandeja de dissecção ou outra superfície para proteger o animal são necessárias, juntamente com laços, fita ou pinos para afixar os membros em posição.
   3. A anestesia injetável ou a anestesia da inalação é necessária. Se usar anestesia de inalação, é desejável que o anestésico seja entregue através de um vaporizador de precisão com um cone de nariz. O comprimento do procedimento é tal que o uso de uma câmara de indução sem entrega adicional de gás anestésico não fornecerá tempo suficiente para completar a retirada de sangue antes que o animal reaviva.
   4. São necessárias tesouras de íris para o rato, ou uma tesoura afiada para o rato, juntamente com pequenas fórceps atraumáticas do polegar e uma esponja de gaze de 2"x 2".
5. Restrição
   1. Quando o animal é totalmente anestesiado, determinado por pinça do dedo do dedo ou beliscão da cauda, o animal é colocado em recumbência dorsal.
   2. Os membros são fixados na plataforma com fita ou pinos. Os membros devem ser estendidos para longe do corpo.
6. Retirada
   1. A pele é levantada e um pequeno corte transverso é feito através da pele logo acima da pelve em fêmeas, ou logo acima do prepuce em machos.
   2. O ponto da tesoura é colocado no corte, e uma incisão midline é feita através da pele da pelve/prepuce para o xifoide.
   3. A pele é refletida lateralmente para cada lado. Dissecção contundente pode ser necessária para soltá-lo do músculo subjacente.
   4. O músculo é levantado, e um pequeno corte transverso é feito através do músculo logo acima do corte da pele.
   5. O ponto da tesoura é colocado no abdômen e uma incisão média é feita através do músculo para o xiphoide. Certifique-se de inclinar o ponto da tesoura para cima para evitar o corte de quaisquer órgãos.
   6. Corte transversalmente ao longo da curva das costelas de cada lado. Tenha cuidado extra para não perfurar o fígado.
   7. Mova suavemente os intestinos para a esquerda do animal para expor a veia cava posterior.
   8. Coloque uma almofada de gaze no fígado, e descanse o índice e o dedo médio no fígado.
   9. Por outro lado, insira a agulha, bivele para cima, na veia cava no meio do caminho entre a junção dos vasos renais e a bifurcação ilícíaca.
   10. Retire lentamente o sangue enquanto aplica pressão no fígado.

Figura 4. Retirada de sangue da veia cava posterior.

A coleta de sangue é um requisito comum para vários estudos de pesquisa que envolvem camundongos e ratos. A escolha do método de coleta de sangue nesses animais depende de muitos fatores, como o volume de sangue necessário, a frequência da amostragem, o estado de saúde do animal a ser sangrado e o nível de habilidade do técnico.

Aqui, revisaremos essas considerações e descreveremos os procedimentos de coleta de sangue, incluindo sangramento ocular retroorbital, cortes e cortes na cauda, bem como coleta de sangue intracardíaco. Para outros métodos, veja o segundo vídeo desta série.

Antes de nos aprofundarmos nos protocolos de coleta de sangue, vamos primeiro revisar algumas considerações gerais, incluindo tipo de amostra, seleção de agulha e volume máximo de sangue que pode ser coletado. Antes de coletar sangue de um camundongo ou rato, o tipo de amostra de sangue necessária deve ser determinado. Procedimentos experimentais podem exigir sangue total, plasma ou soro.

Se estiver coletando sangue total, um anticoagulante deve ser adicionado à amostra para evitar a coagulação. Os anticoagulantes comumente usados incluem heparina, citrato de sódio e ácido etilenodiamina tetracético, abreviado como EDTA. Os anticoagulantes podem ser carregados diretamente na seringa para revestir as superfícies. Isso permite o contato do anticoagulante diretamente à medida que o sangue é coletado, auxiliando na prevenção da coagulação. Como o sangue dos roedores coagula rapidamente, é essencial que a proporção correta de anticoagulante para sangue seja usada. A coleta de plasma requer centrifugação do sangue total COM anticoagulante. Após a rotação, o líquido translúcido acima da camada de leucócitos e plaquetas é o plasma. Ele contém fibrinogênio e outros fatores de coagulação. Por outro lado, o soro é coletado de amostra de sangue total SEM anticoagulantes. E como a amostra coagulou, o soro, que é o melhor jogador, não contém fibrinogênio ou outros fatores de coagulação.

A seleção da agulha é baseada no tamanho do animal e no local da punção venosa. Em geral, agulhas de grande calibre causam menos danos às células sanguíneas e permitem uma coleta de sangue mais rápida; mas são mais propensos a causar danos aos vasos. O comprimento da agulha também deve ser considerado. Se uma agulha for muito longa, pode ser difícil de usar ou o sangue pode começar a coagular ainda dentro da agulha. As opções de tamanho variam de 18 a 29 gauge e 0,5 a 1,5 polegadas de comprimento. O tamanho apropriado da agulha para cada método será discutido na seção de procedimentos.

Por fim, devido ao pequeno tamanho dos roedores, há uma quantidade máxima de sangue que pode ser coletada de uma única coleta de sangue, o que não causará sérios danos ao organismo. A retirada de sangue pode ser sem ou com reposição de fluidos - geralmente feita com soro fisiológico a 0,9%. O limite superior em cada caso está listado no protocolo de texto abaixo. Além disso, alguns experimentos exigem coleta de várias amostras e, nesses casos, juntamente com a reposição de fluidos, os animais também precisarão de tempo para reabastecer as células sanguíneas. Novamente, há uma quantidade máxima que pode ser coletada durante a coleta em série, e os limites superiores estão listados no protocolo abaixo.

Depois de revisar algumas considerações gerais, vamos pular para as técnicas específicas de coleta de sangue, começando com o sangramento retro-orbital - uma técnica usada pelos cientistas para coletar pequenos volumes dos vasos próximos ao olho. Observe que a estrutura anatômica da área orbital é diferente entre o camundongo e o rato. Os ratos têm um plexo de vasos que fluem atrás do olho, enquanto o camundongo tem uma coleção de vasos que criam um seio retroorbital, o que facilita a realização desse procedimento em camundongos.

Comece pegando um tubo para coleta de sangue. Tubos de micro hematócrito com capacidade para 50-75 microlitros são os preferidos. Coloque várias toalhas de papel ou outros materiais isolantes na superfície de trabalho. Isso é para manter o calor corporal do animal durante o procedimento. Agora anestesiar o animal usando um anestésico inalatório, como o isoflurano. Assim que o animal estiver totalmente anestesiado, remova-o da câmara e coloque-o de lado em posição de decúbito lateral. Em seguida, coloque um dedo no topo da cabeça e ao longo da linha da mandíbula e puxe a pele para trás e para baixo para induzir a protrusão ocular. Evite aplicar pressão na traqueia, pois isso pode causar a morte por asfixia. Em seguida, coloque o tubo de micro-hematócrito no canto medial do olho e direcione-o caudalmente em um ângulo de 30 a 45 graus em relação ao plano do nariz. Aplique pressão enquanto gira suavemente o tubo. Isso cortará as membranas conjuntivais e romperá o plexo ocular ou seio. O sangue fluirá para o tubo de hematócrito por ação capilar. Evite empurrar o tubo tão fundo que você bata no osso na parte de trás da cavidade ocular. Quando o sangue começar a fluir, mantenha a pressão para manter o olho saliente. Para parar o sangramento, solte a pele e permita que o olho retorne à posição normal. Aplique pressão para promover a hemostasia. Para a coleta repetida de amostras, aguarde um mínimo de 10 dias entre os sangramentos. Isso fornece aos tecidos algum tempo para cicatrizar.

Embora o sangramento retro-orbital seja um procedimento comum, há muitas preocupações sobre sua humanidade. Isso inclui inchaço devido ao movimento excessivo do tubo de hematócrito. Isso, por sua vez, pode causar a protrusão do globo ocular e impedir o fechamento da pálpebra, resultando em ressecamento da córnea, danos e dor, o que pode desencadear arranhões e automutilação. A colocação inadequada do tubo de hematócrito pode cortar o nervo óptico, resultando em cegueira. Outra complicação possível é que o olho pode ser forçado para fora da órbita, permitindo que as pálpebras fiquem atrás do globo ocular. Além disso, podem surgir problemas devido à fratura dos ossos frágeis da órbita, penetração do globo ocular resultando na perda do humor vítreo ou na formação de um hematoma atrás do olho que pode resultar em dor extrema. Apesar de todas essas preocupações, se um técnico qualificado realizar o procedimento e o animal estiver totalmente anestesiado, o sangramento retro-orbital é um método eficaz de coleta de sangue em roedores.

Agora vamos revisar as considerações e procedimentos para sangramento de cauda, o que permite a coleta de amostras seriadas de pequenos volumes. O equipamento necessário para este procedimento inclui um bisturi número 11 estéril. A tesoura não deve ser usada porque o corte feito pela tesoura é esmagador, o que pode promover a coagulação e reduzir o fluxo sanguíneo. Outros instrumentos são um tubo de contenção que permite o acesso à cauda do animal; toalhas de papel absorventes; tubos de coleta ou hematócrito e pó hemostático - para auxiliar na hemostasia.

Comece prendendo o animal no tubo de contenção. Em seguida, limpe a cauda com água morna para remover detritos e causar uma leve vasodilatação. NÃO use água quente. Estenda a cauda e, com a lâmina do bisturi, corte a ponta da cauda para coletar o sangue usando hematócrito ou tubos de coleta. A cauda pode ser acariciada ou "ordenhada" da garupa às pontas para estimular o fluxo sanguíneo. No entanto, isso diminuirá a qualidade da amostra.

Para parar o sangramento, aplique pressão na ponta da cauda com uma gaze. O pó hemostático pode ser usado para obter hemostasia. Verifique os animais a cada 5 a 10 minutos para garantir que a hemostasia foi alcançada, o que pode ser atrasado após repetidas amostragens. A amostra coletada de um corte de cauda pode conter sangue arterial e venoso, juntamente com contaminação por produtos de tecido. No entanto, este procedimento de coleta de sangue permite coletas em série, interrompendo a crosta ou coágulo do corte original no final da cauda.

Um método alternativo de coleta de sangue para um corte de cauda é o corte do vaso caudal, que é relativamente menos invasivo. Para isso, usando a mesma lâmina de bisturi, faça um pequeno corte diretamente sobre a veia lateral da cauda, aproximadamente dois terços da distância da garupa. Tal como acontece com as tesouras de cauda, o sangue pode ser coletado em tubos de coleta ou hematócrito. E é imperativo garantir a hemostasia aplicando pressão no local e verificando novamente o animal a cada 5-10 minutos. No entanto, como acontece com o corte da cauda, as amostras podem estar contaminadas com produtos de tecido.

Muitas vezes, estudos que exigem uma grande amostra de sangue não sobrevivente, que é realizada por meio de exsanguinação por meio de um sangramento intracardíaco ou da veia cava caudal.

Para o método intracardíaco em camundongos, você precisa de uma seringa de 3 cc com uma agulha de calibre 22 -25 de 1 polegada. E para ratos, é preferível uma seringa de 10-12 cc com uma agulha de calibre 18 de 1,5 polegadas. Veja o protocolo abaixo para entender por que essas necessidades e seringas são ideais.

Comece sacrificando o animal usando dióxido de carbono. Após a eutanásia, segure o roedor pela nuca com o corpo pendurado verticalmente. Essa contenção é crítica, pois o corpo deve estar reto para evitar a deflexão do coração ou a torção do peito. Observe que o coração está localizado aproximadamente no nível do cotovelo. O lado de inserção está no entalhe à esquerda do xifóide, paralelo à coluna e sob as costelas.

Insira a agulha, chanfrada, no peito e perfure o coração. Aplique uma leve contrapressão com a seringa. Se a agulha estiver no coração, o sangue fluirá para a seringa. Espere até que o sangue encha o barril antes de adicionar contrapressão adicional. Aproximadamente metade do volume total de sangue pode ser coletado de um camundongo ou rato por punção cardíaca. Isso equivale a aproximadamente 1 mL de sangue de um camundongo médio e aproximadamente 10 mL de sangue de um rato médio

Uma posição alternativa é a decúbito dorsal ao usar a abordagem lateral. Nesse caso, coloque a agulha entre as costelas do lado esquerdo do animal. O ponto de entrada é medido em relação ao ponto do cotovelo na parede torácica. Insira a agulha, chanfrada para cima, perpendicular ao plano da mesa em um ponto no meio da parede torácica. Aplique uma leve contrapressão com a seringa. Se a agulha estiver no coração, o sangue fluirá para a seringa. Novamente, espere até que o sangue encha o barril antes de adicionar contrapressão adicional. Observe que, em qualquer posição, a contrapressão excessiva pode colapsar o coração, ocluindo o bisel da agulha e interrompendo o fluxo sanguíneo para a seringa.

Outro método para coletar sangue cardíaco é através da veia cava caudal. O equipamento necessário para este procedimento é uma seringa apropriada com uma agulha de tamanho correto acoplada; tesoura para abertura da cavidade abdominal, pequena pinça de polegar atraumática e esponja de gaze. Esta técnica requer que o animal seja profundamente anestesiado e mantido sob anestesia durante todo o procedimento. A narcose por CO2 não é uma opção, pois o coração do animal deve estar batendo para este procedimento. Coloque o animal em decúbito dorsal e prenda os membros na plataforma. Os membros devem ser estendidos para longe do corpo.

Agora levante a pele com uma pinça e use uma tesoura para fazer um pequeno corte transversal na pele logo acima da pelve nas mulheres ou no prepúcio nos homens. Em seguida, coloque a ponta da tesoura no corte e faça uma incisão na linha média através da pele da pelve ou prepúcio até o xifóide. Com a pele refletida lateralmente, levante o músculo e faça um pequeno corte transversal através do músculo, logo acima do corte da pele.

Coloque a ponta da tesoura no abdômen e faça uma incisão na linha média através do músculo até o xifóide. Certifique-se de inclinar a ponta da tesoura para cima para evitar cortar qualquer órgão. Corte transversalmente ao longo da curva das nervuras de cada lado. Tenha cuidado para não perfurar o fígado. Mova suavemente os intestinos para a esquerda do animal para expor a veia cava posterior. Coloque uma gaze no fígado e descanse os dedos indicador e médio sobre ela. Com a outra mão, insira a agulha, chanfre na veia cava, a meio caminho entre a junção dos vasos renais e a bifurcação ilíaca. Retire lentamente o sangue enquanto aplica pressão no fígado.

Evite o movimento das mãos, pois isso pode causar a ruptura do vaso. Além disso, a retirada de sangue muito rápida pode fazer com que o vaso colapse no chanfro, ocluindo a abertura e impedindo a coleta de sangue. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de coletar uma amostra estéril, pois a agulha não passa pela pele.

Por fim, vejamos algumas aplicações dessas técnicas de retirada de sangue. A imuno-oncologia é um campo emergente, e os pesquisadores dessa área costumam realizar coletas de sangue para estudar as células imunes em diferentes estágios de desenvolvimento do câncer. Por exemplo, aqui os pesquisadores coletaram sangue cardíaco de camundongos portadores de câncer para isolar e quantificar neutrófilos em dez, vinte e trinta dias após o enxerto do tumor.

Por outro lado, a composição do sangue também é frequentemente estudada por fisiologistas. Como neste estudo, os pesquisadores estavam interessados em avaliar a função renal em animais diabéticos. Para fazer isso, esses cientistas primeiro injetaram um corante em um modelo animal de diabetes. Em seguida, eles usaram o método de corte da cauda para coletar sangue em vários momentos para avaliar a concentração de corante no sangue, que foi usado para calcular a taxa de filtração glomerular que destacou a diferença na função renal após a indução do diabetes.

Por fim, os pesquisadores de células-tronco usam amostras de sangue para avaliar o sucesso da incorporação de células doadoras no sistema do receptor. Aqui, os pesquisadores primeiro transplantaram células da medula óssea de um camundongo macho para um tipo selvagem e geneticamente modificado fêmea por meio da injeção na veia da cauda. Em seguida, eles coletaram sangue do seio retroorbital do camundongo receptor para estudar o DNA genômico das células sanguíneas usando a reação em cadeia da polimerase. Isso forneceu a porcentagem de enxerto de células doadoras nos dois tipos de animais.

Você acabou de assistir à primeira parte de JoVE sobre técnicas de retirada de sangue. Por favor, veja o próximo vídeo da série para revisar como realizar outras técnicas comumente empregadas de coleta de sangue em animais de laboratório. Como sempre, obrigado por assistir!