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Ensaio ELISPOT: Detecção de Esplenócitos Secretores de IFN-γ

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Immunology

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ELISPOT Assay: Detection of IFN-γ Secreting Splenocytes

5.3: ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

5.5: Immunohistochemistry and Immunocytochemistry: Tissue Imaging via Light Microscopy

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11:53 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Tonya J. Webb¹
¹ Departamento de Microbiologia e Imunologia, Faculdade de Medicina da Universidade de Maryland e o Centro de Câncer Integral Marlene e Stewart Greenebaum, Baltimore, Maryland 21201

ELISPOT é um ensaio padronizado e reprodutível usado para detectar respostas imunes celulares. O ensaio utiliza um ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA) para detectar respostas imunes unicelulares que podem ser visualizadas por manchas, daí o nome ELISPOT. Elispot foi descrito pela primeira vez em 1983, por Czerkinsky, como um método de enumerar o número de híbridos de células B produzindo imunoglobulinas específicas de antígeno (1). O mesmo grupo desenvolveu o ensaio para medir a frequência de linfócitos T produtores de citocinas. Agora elispot tornou-se um padrão-ouro para medir a imunidade de células T específica de antígeno em ensaios clínicos e candidatos a vacinas. Por exemplo, após a vacinação ou durante uma infecção, células plasmáticas e células B de memória secretam anticorpos que fornecem proteção. Normalmente, essas respostas de células B são avaliadas medindo títulos de soro de anticorpos específicos de antígeno. No entanto, esse tipo de análise, tipicamente medida pela ELISA, pode não incluir células B de memória, que podem estar presentes mesmo na ausência de níveis detectáveis de anticorpos séricos. Além disso, foi bem estabelecido que as células B da memória circulante são importantes para a resposta rápida e protetora de anticorpos observada após a reexposição do patógeno, portanto, é fundamental ser capaz de detectar essas células. Portanto, para avaliar claramente as respostas de células B de memória específicas do antígeno, tanto a ELISA quanto o ELISPOT devem ser utilizados (2).

O ensaio ELISPOT usa uma placa contendo poços forrados de membrana que são revestidos com anticorpos, a fim de capturar proteínas secretas de interesse. Em seguida, a placa é carregada com células e estímulos para induzir a produção de proteínas. As proteínas secretas são capturadas pelos anticorpos revestidos na superfície. Após o tempo de incubação apropriado, as células são removidas e a molécula secretada é detectada usando um anticorpo biotinilado que é específico para um epítope diferente, em comparação com o anticorpo de captura. Em seguida, é adicionado streptavidin peroxidase, seguido pela adição de um substrato que permite a detecção das manchas (Figura 1). A força deste ensaio é que permite quantificar o número de células que produzem a proteína de interesse. É importante avaliar se há mudanças no número total de células que produzem uma proteína específica ou se as células individuais dentro de uma população estão produzindo mais proteína. Além disso, pode fornecer informações sobre cinética e pode ser usado para avaliar a ativação imune global (estimulação mitogótica) em relação às respostas específicas do antígeno (simulação de antígeno). O ensaio ELISPOT permitirá a detecção de uma célula ativada entre 300.000 células após ativação mitogênica ou específica de antígeno.

Figura 1: Visão geral do protocolo ELISPOT.

As principais vantagens deste ensaio são suas. Simplicidade- o protocolo é relativamente simples e simples. Não requer perícia técnica, b. Sensibilidade- permite a detecção de células imunes no nível único celular e requer muito poucas células em comparação com outros métodos como citometria de fluxo, c. Funcionalidade- fornece dados quantitativos sobre a função imunológica.

Este exercício de laboratório demonstra o protocolo ELISPOT para detecção de ifn-γ secretando splenócitos, mas como mencionado acima deste ensaio também pode ser usado para avaliar a secreção de anticorpos por células B (3).

Procedure

1. Configuração

Tampões e reagentes

Salina tamponada de fosfato estéril (PBS) sem cálcio ou magnésio
Tampão de revestimento- PBS estéril ou tampão de carbonato
Ensaio diluído- 10% soro bovino fetal (FBS) na PBS
Cultura celular média- RPMI 1640 com 10% de FBS, penicilina/estreptomicina, & L-glutamina
Tampão de lavagem- PBS contendo 0,05% Tween20
Dupla água destilada (ddH₂O)
Substrato de detecção- 100 mg AEC (3-amino-9-etil-carbazole) em 10 mL DMF (N,N, Dimetilformamida).

Equipamento

Capa de fluxo laminar
Incubadora umidificada (fixada em 37°C, 5% CO₂)
Leitor ELISPOT automatizado ou microscópio de dissecação

Materiais

Placas ELISPOT
Reservatórios estéreis e não tésteres
Pipettors e dicas
Pipetas sorológicas estéreis
Tubos estéreis e cônicos de polipropileno
Duas garrafas de espremer para lavagem de pratos

Reagentes específicos de ensaio

Células- células primárias ou linhas celulares (aqui, esplenócitos de C57BL/6 camundongos foram usados)
Estimulantes- mitogênio ou antígeno (aqui, phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA, 50 ng/mL) e ionomicina (1 μM) foram usados)
Anticorpo primário- biotinilado anti-citocinas detectando anticorpos (diluídos a 2 μg/mL em diluente de ensaio)
Anticorpo secundário- streptavidin-rabanete peroxidase (SAv-HRP)

2. Procedimento

Revestimento

Mantendo as condições estéreis e dentro de uma coifa de fluxo laminar, diluir o anticorpo purificado anti-citocina capturar a uma concentração final de 0,5-4,0 μg/mL em tampão de revestimento estéril. (Nota: para IFN- γ e IL-6 use 5 μg/mL).
Transfira a solução de anticorpos de captura, 100 μL/well, para a placa ELISPOT.
Cubra a placa com uma tampa de placa e sele-a para evitar a evaporação.
Incubar a placa durante a noite a 4°C.

Bloqueio

No dia seguinte, descubra a placa ELISPOT no capô de fluxo laminar. Inverta rapidamente a placa em lenços estéreis para remover a solução de anticorpos de captura de cada poço.
Em seguida, adicione 200 μL de cultura celular média a cada poço. Esta etapa bloqueará a vinculação não específica durante o ensaio.
Substitua a tampa da placa e incubar a placa por 2 horas a 37°C.

Células de revestimento e ativação

Enquanto a placa estiver incubando, prepare uma solução 2X mitogen contendo 50 ng/mL PMA e 1 μM de ionomicina em meio de cultura celular.
Em seguida, prepare as suspensões celulares de destino para uma concentração de estoque de 2 x 10⁶ células/mL.
Depois que a incubação estiver completa, remova o meio de cultura celular de cada poço, invertendo rapidamente a placa em lenços estéreis dentro da capa de fluxo laminar.
Em seguida, gere uma diluição serial 2X da solução de suspensão de células de estoque. Para isso, adicione primeiro 200 μL da solução de estoque de suspensão celular preparada nos poços na linha superior da placa ELISPOT.
Em seguida, adicione 100 μL de cultura de célula simples ao próximo cinco linhas da placa abaixo das linhas que contêm solução de estoque celular.
Depois disso, realize uma diluição serial 2X ao pipetar 100 μL da suspensão celular da linha superior para a linha superior diretamente abaixo. Certifique-se de uma mistura adequada, encanar suavemente esta solução para cima e para baixo para garantir a distribuição uniforme das células.
Repita este processo para as quatro linhas restantes.
Deixe a sexta fila apenas com o meio de cultura. Servirá como controle experimental.
Em seguida, adicione 100 μL da solução mitogênio preparada aos poços experimentais das cinco primeiras linhas da placa. Nos poços de controle e na sexta linha, adicione 100 μL da mídia de cultura celular sem mitogênio.
Substitua a tampa da placa e incuba a placa de 37°C, 5% DE CO₂ em uma incubadora por 20-48 horas. (Nota: 20-24 horas é normalmente suficiente para detectar IL-2 e TNF-α, enquanto 48 horas é ideal para IL-4 e IFN-γ).

Detecção

Anticorpo primário

Prepare o anticorpo biotinína anti-citocina detectador para uma concentração de 2 μg/mL em diluente de ensaio.
Prepare 20-25 mL de tampão de lavagem neste momento misturando 0,05% Tween-20 em PBS.
Depois que a incubação estiver completa, desprezam a placa e invertam-na rapidamente sobre uma pia para remover todo o líquido dos poços. (Nota: Após este ponto a placa não precisa mais ser mantida estéril).
Em seguida, lave a placa adicionando ~200 μL de tampão de lavagem a cada poço. Expulse este líquido invertendo rapidamente e movendo a placa sobre uma pia. Repita este processo para um total de cinco lavagens.
Em seguida, adicione 100 μL da solução de anticorpos biotiniladas diluídas que detectam anticorpos a cada poço. Incubar em temperatura ambiente por 2 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C.

Anticorpo secundário

Após a incubação ser concluída, expulse o anticorpo de detecção invertendo e sacudindo a placa sobre a pia.
Como antes, lave a placa 5 vezes com ~200 μL de tampão de lavagem, expelindo o líquido entre cada lavagem.
Em seguida, adicione 100 μL de solução de peroxidase de streptavidin-rabanete diluída a cada poço (diluído à sua concentração ideal pré-determinada no diluente do ensaio).
Substitua a tampa da placa e incubar à temperatura ambiente por 1,5-2 horas a 37°C.

Substrato

Após a incubação, não mais do que 15 minutos antes do uso, ative primeiro a solução de substrato AEC de acordo com as instruções do fabricante.
Em seguida, descarte o conteúdo dos poços e lave a placa cinco vezes com tampão de lavagem, como antes.
Em seguida, adicione imediatamente 100 μL de solução de substrato AEC preparada em cada poço.
Incubar a placa em temperatura ambiente por ~10-20 minutos enquanto monitora o desenvolvimento do local.
Pare a reação enxaguando a placa com água e jogando a placa sobre a pia.
Borrique a placa em toalhas de papel e deixe a placa secar durante a noite ou até que esteja completamente seca. A remoção da bandeja de plástico sob a placa facilitará a secagem.

3. Aquisição e Análise de Dados

Após a secagem, as manchas estão prontas para serem contadas com um leitor automático de placas. Aqui, o leitor CTL Immunospot é usado, mas este protocolo pode ser adaptado para qualquer leitor.
Primeiro ligue o instrumento, depois o computador. Em seguida, abra o programa CTL e clique em “contagem de varredura”.
Empurre “ejetar” para que a bandeja se estenda da máquina. Em seguida, remova o adaptador plástico e alinhe a linha “A” na placa e adaptador ELISPOT.
Escolha um nome de arquivo e localização para que o arquivo seja salvo e carregue a placa na bandeja.
Em seguida, clique em “carregar” no software e feche a porta na lateral da máquina.
Pressione “start-after count”. Certifique-se de que o arquivo está salvo e, em seguida, abra o software de controle de qualidade “QC” para analisar os dados e contar o número de pontos.

Anotações:

O número mínimo de células deve ser determinado em experimentos preliminares. O número ideal de pontos é ~50/bem. Se muitas células estiverem carregadas, será difícil detectar pontos distintos. Além disso, as células se sobreporão e não podem formar uma monocamada na membrana, assim o nível de detecção pode ser reduzido.
Ao otimizar o experimento, considere o nível de expressão esperado da proteína alvo. Quanto menor a expressão, maior o número de células exigidas por poço.
Ao contrário da ELISA, é melhor lavar a placa à mão em vez de usar uma arruela de placa. As placas ELISPOT são mais delicadas e deve-se evitar perfurar a membrana PVDF.
Deve-se limitar o movimento da placa durante o período de incubação, pois pode fazer com que as manchas borrem.
As placas devem ser armazenadas no escuro, pois a exposição à luz direta faz com que as manchas desapareçam.

O Imunospot ligado à enzima, ou ELISPOT, é um método para analisar a resposta imune a um patógeno ou dano celular. Permite quantificar a ativação de diferentes células imunes detectando proteínas específicas que secretam. Por exemplo, o ELISPOT é comumente usado para medir respostas de células T após a exposição a um antígeno estranho, detectando citocinas secretadas.

Para um ensaio ELISPOT baseado em citocinas, o processo começa com o revestimento de uma microplacã ELISPOT com um anticorpo de captura, que é específico para a citocina alvo. Após o revestimento de anticorpos, as células T são adicionadas aos poços e estimuladas por um agente externo, como o anticorpo anti-CD3, por exemplo. As células então secretam a citocina alvo, que imediatamente é imobilizada pelo anticorpo de captura. Uma vez que a proteína é capturada instantaneamente após a secreção de células vivas, sem diluição ou degradação, este ensaio tem uma alta precisão. Depois que a citocina alvo é imobilizada, um anticorpo de detecção é adicionado, que também se liga à citocina capturada.

A técnica ELISPOT também pode ser usada para quantificar as células B da memória após uma infecção ou vacinação, analisando sua produção de anticorpos específicos. Em um ELISPOT baseado em anticorpos, um antígeno específico é usado em vez de um anticorpo para a etapa de captura, onde o antígeno será vinculado à placa, ou na etapa de detecção, onde o antígeno detecta o anticorpo alvo após a captura. Em todas as variações do processo, para células T ou células B, o anticorpo ou antígeno de detecção é biotiningado, o que permite que ele se ligue a uma enzima de detecção conjugada streptavidin, como peroxidase de rabanete. Em seguida, após a adição do substrato da peroxidase, AEC, é produzido um precipitado escuro e insolúvel. Este precipitado marca a localização da proteína capturada, e cada célula secretal resulta em um ponto visível, que pode ser quantificado usando um leitor ELISPOT ou um microscópio. O tamanho das manchas é uma estimativa relativa da quantidade de proteína secretada de cada célula. Este ensaio pode detectar respostas imunes de células únicas, mesmo em subpopulações relativamente pequenas de células secretas, tornando-a útil para estudar respostas imunes no nível celular.

Neste vídeo, você aprenderá como realizar um ensaio ELISPOT e, em seguida, quantificar as manchas que representam as células secretary.

Durante todo o experimento, garanta condições estéreis trabalhando em um capô de fluxo laminar e usando luvas.

Todos os cálculos neste protocolo são baseados no volume necessário para uma placa de 96 poços.

Primeiro, diluir o anticorpo anti-citocinas. Para isso, transfira 10 mililitros de tampão para um tubo cônico de 15 mililitros estéril. Em seguida, use uma pipeta para adicionar 10 microlitradores de um miligrama por mililitro de anticorpo monoclonal ao buffer para criar uma solução com uma concentração final de um micrograma por mililitro. Em seguida, despeje a solução de anticorpos de captura em um reservatório estéril e, usando uma pipeta multicanal, distribua 100 microliters em cada poço de uma placa ELISPOT de 96 poços.

Cubra a placa com uma tampa de placa, sele-a para evitar a evaporação e incuba durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, descubra a placa ELISPOT no capô de fluxo laminar. Inverta rapidamente a placa em lenços estéreis para remover a solução de anticorpos de captura de cada poço. Em seguida, use uma pipeta multicanal para adicionar 200 microliters de meio de cultura celular a cada poço. Esta etapa bloqueará a vinculação não específica durante o ensaio. Substitua a tampa da placa e incuba em uma incubadora de 37 graus Celsius por duas horas.

Enquanto a placa está incubando, prepare uma solução mitogótica 2X adicionando um microlitr de PMA e 20 microliters de ionomicina a 10 mililitros de cultura celular para alcançar uma concentração final de 15 nanogramas por PMA mililitro e uma ionomicina micromolar.

As suspensões celulares de esplenócitos de rato também devem ser preparadas neste momento em um capô estéril. Usando um microscópio e hemótmetro, meça a concentração das células e ajuste o volume total até que uma concentração de estoque de dois milhões de células por mililitro seja atingida.

Depois que a incubação estiver completa, inverta rapidamente a placa em lenços estéreis para remover o meio de cultura celular de cada poço. Em seguida, adicione 200 microliters da solução de estoque de suspensão celular preparada aos poços na linha superior da placa ELISPOT. Configure o experimento em triplicado, de modo que cada tipo de célula testada seja emplacado em um conjunto de três colunas agrupadas. Abaixo disso, adicione 100 microliters de meio de cultura celular simples às próximas cinco linhas da placa, abaixo das linhas que contêm solução de estoque celular.

Em seguida, realize uma diluição serial ao pipetar 100 microliters da suspensão celular da linha superior para a linha diretamente abaixo, encanar suavemente a solução para cima e para baixo para distribuir uniformemente as células. Repita este processo para as linhas restantes, movendo 100 microliters da linha anterior para a linha abaixo em cada etapa, continuando até que a quinta linha tenha sido diluída em série. Deixe a sexta fila apenas com meio de cultura celular, para servir como controle. Para estimular as células nos poços experimentais da placa, adicione 100 microliters da solução mitogênio preparada às suspensões celulares em cada poço de linhas de uma a cinco linhas. Certifique-se de deixar a sexta fila, que servirá como controle, sem estimulação. Substitua a tampa e incuba a placa a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 24 a 48 horas.

Prepare o anticorpo biotinína diluído que detecta anticorpos. Primeiro, prepare 50 mililitros de diluente de ensaio adicionando 5 mililitros de soro bovino fetal de 10% a 45 mililitros de PBS. Em seguida, diluir o anticorpo detectador para uma concentração de 2 microgramas por mililitro no ensaio diluído. Além disso, prepare 20 a 25 mililitros de tampão de lavagem neste momento, misturando 0,05% Tween-20 e PBS.

Depois que a incubação estiver completa, desprezam a placa e invertam-na rapidamente para remover todo o líquido dos poços. Lave a placa adicionando cerca de 200 microliters de tampão de lavagem a cada poço. Expulse este líquido invertendo rapidamente e movendo a placa sobre uma pia. Repita este processo mais quatro vezes para um total de cinco lavagens. Em seguida, adicione 100 microliters da solução de anticorpos de detecção diluída a cada poço, substitua a tampa e incubar à temperatura ambiente por duas horas. Após a incubação, expulse a solução de anticorpos de detecção dos poços da placa invertendo e sacudindo a placa sobre a pia.

Como antes, lave a placa cinco vezes com tampão de lavagem, expelindo o líquido entre cada lavagem. Após a lavagem final, prepare a solução de peroxidase streptavidin-rabanete diluindo-a de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, com os poços da placa vazios, adicione 100 microliters de solução de peroxidase de streptavidin diluído para cada poço. Coloque a tampa de volta na placa e incubar em temperatura ambiente por duas horas.

Após a incubação, não mais do que 15 minutos antes do uso, ative a solução de substrato AEC pré-fabricado. Descarte o conteúdo dos poços e lave a placa cinco vezes com tampão de lavagem, como antes. Em seguida, adicione imediatamente 100 microliters de solução de substrato AEC preparada em cada poço. Deixe a placa em temperatura ambiente para se desenvolver por aproximadamente 10 a 20 minutos, enquanto monitora o desenvolvimento do local. Essas manchas aparecerão como pequenos círculos escurecidos na superfície dos poços. Em seguida, pare a reação enxaguando a placa com água e jogando-a sobre a pia. Borrique a placa em toalhas de papel e deixe secar durante a noite ou até secar completamente. A remoção da bandeja de plástico sob a placa facilitará a secagem. Após a secagem, as manchas estão prontas para serem contadas com um leitor automático de placas.

Aqui, o leitor CTL ImmunoSpot é usado, mas este protocolo pode ser adaptado para qualquer leitor. Em seguida, abra o programa CTL e clique em Contagem de Varredura. Empurre ejetar para que a bandeja se estenda da máquina. Em seguida, remova o adaptador plástico e alinhe a linha A na placa e adaptador ELISPOT. Escolha um nome e localização do arquivo para que o arquivo seja salvo e carregue a placa e o adaptador na bandeja. Clique em Carregar no software e feche a porta na lateral da máquina. Em seguida, pressione Iniciar depois de contar. Certifique-se de que o arquivo seja salvo e, em seguida, abra o software QC de Controle de Qualidade para analisar os dados e contar o número de pontos. Exporte esses dados como um arquivo Excel. Uma vez que a análise esteja concluída, clique em Ejetar para recuperar a placa.

Neste experimento, células de tipo selvagem e camundongos portadores de tumor foram banhadas e analisadas para gama IFN. Observe que o número de manchas diminui com a diminuição da concentração celular. Normalmente, os dados DO ELISPOT são apresentados como o número de contagens pontuais por número de células emplacaram. Neste exemplo, o número de pontos foi exibido em um gráfico de barras, com cada concentração celular respectiva listada no eixo x. Observe que o número de manchas indica o número de células ativadas por número total de células em uma determinada população.

Results

Neste ensaio ELISPOT, leucócitos esplênicos de camundongos selvagens e portadores de tumores foram analisados para ifn-γ. A Figura 2 A mostra a imagem visual do resultado do ensaio. Os números na cor verde indicam o número de pontos por poço (TNTC indica “numeroso demais para contar”). Observe que o número de manchas diminui com a diminuição da concentração celular.

Figura 2A: Diminuição das respostas imunes em camundongos portadores de tumores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Normalmente, os dados DO ELISPOT são apresentados como o número de contagens pontuais por número de células emplacaram. Na Figura 2 B o número de pontos é exibido em um gráfico de barras, com cada concentração celular respectiva listada no eixo X. Para fins de grafação, 150 foram utilizados para indicar o número máximo de pontos. O número de ifn-γ produzindo leucócitos esplênicos murinos em animais portadores de tumores é menor do que os do tipo selvagem.

Figura 2B: Diminuição das respostas imunes em camundongos portadores de tumores. Os splenócitos foram colhidos a partir do controle C57BL/6 (tipo selvagem) e camundongos portadores de tumores e estimulados com PMA/ionomicina por 48 horas. Os ensaios ELISPOT foram usados para quantificar o número de leucócitos esplênicos produtores de IFN γ. (A) Representação gráfica visual e (B) dos dados. TNTC indica numerosos demais para contar. Para fins de grafação, 150 foram utilizados para indicar o número máximo de pontos. Os números verdes indicam o número de pontos contados por poço. Os números vermelhos indicam os poços de referência utilizados para determinar quais pontos eram células e quais manchas eram detritos, artefatos ou efeitos de borda e devem ser excluídos da análise.

Applications and Summary

O ensaio ELISPOT permite avaliar a ativação de células imunes determinando o número de células que secretam um analito específico. O tamanho e intensidade das manchas fornece informações sobre a quantidade de analito que está sendo produzida por cada célula. O protocolo descrito acima detalhava a detecção de uma única citocina. No entanto, os desenvolvimentos recentes melhoraram a utilidade deste ensaio. Atualmente, pode-se usar corantes fluorescentes de detecção para detectar vários analitos dentro de um poço. Isso permite a detecção de diferentes subpopulações de células segregando um ou ambos analitos.

References

Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., & Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods, 65 (1), 109-121(1983).
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Roberts, T. J., Lin, Y., Spence, P. M., Van Kaer, L., & Brutkiewicz, R. R. CD1d1-dependent control of the magnitude of an acute antiviral immune response. The Journal of Immunology, 172, 3454-3461 (2004).

Transcript

The Enzyme-linked Immunospot, or ELISPOT, assay is a method to analyze the immune response to a pathogen or cell damage. It allows for quantification of the activation of different immune cells by detecting specific proteins they secrete. For example, ELISPOT is commonly used for measuring T-cell responses upon exposure to a foreign antigen by detecting secreted cytokines.

For a cytokine-based ELISPOT assay, the process begins with the coating of an ELISPOT microplate with a capture antibody, which is specific to the target cytokine. After the antibody coating, T-cells are added to the wells and stimulated by an external agent, like anti-CD3 antibody, for example. The cells then secrete the target cytokine, which immediately gets immobilized by the capture antibody. Since the protein is captured instantly post-secretion from live cells, without dilution or degradation, this assay has a high accuracy. After the target cytokine is immobilized, a detection antibody is added, which also binds to the captured cytokine.

The ELISPOT technique can also be used to quantify memory B-cells after an infection or vaccination by analyzing their production of specific antibodies. In an antibody-based ELISPOT, a specific antigen is used instead of an antibody for either the capture step, where the antigen will be bound to the plate, or at the detection step, where the antigen detects the target antibody post-capture. In all variations of the process, for T-cells or B-cells, the detection antibody or antigen is biotinylated, which allows it to bind to a streptavidin-conjugated detection enzyme, such as horseradish peroxidase. Then, upon addition of the peroxidase’s substrate, AEC, a dark, insoluble precipitate is produced. This precipitate marks the location of the captured protein, and each secretory cell results in a visible spot, which can be quantified using an ELISPOT reader or a microscope. The size of the spots is a relative estimate of the amount of protein secreted from each cell. This assay can detect immune responses from single cells, even in relatively small subpopulations of secretory cells, making it useful for studying immune responses at the cellular level.

In this video, you will learn how to perform an ELISPOT assay and then quantify the spots representing the secretory cells.

Throughout the experiment, ensure sterile conditions by working in a laminar flow hood and wearing gloves.

All calculations in this protocol are based on the volume needed for one 96-well plate.

First, dilute the anti-cytokine capture antibody. To do this, transfer 10 milliliters of buffer into a sterile 15 milliliter conical tube. Then, use a pipette to add 10 microliters of one milligram per milliliter of monoclonal antibody to the buffer to create a solution with a final concentration of one microgram per milliliter. Next, pour the capture antibody solution into a sterile reservoir and, using a multichannel pipette, distribute 100 microliters into each well of a 96-well ELISPOT plate.

Cover the plate with a plate cover, seal it to prevent evaporation, and incubate overnight at four degrees Celsius. The next day, uncover the ELISPOT plate in the laminar flow hood. Quickly invert the plate onto sterile wipes to remove the capture antibody solution from each well. Next, use a multichannel pipette to add 200 microliters of cell culture medium to each well. This step will block non-specific binding during the assay. Replace the plate cover and incubate in a 37 degrees Celsius incubator for two hours.

While the plate is incubating, prepare a 2X mitogen solution by adding one microliter of PMA and 20 microliters of ionomycin to 10 milliliters of cell culture medium to achieve a final concentration of 15 nanograms per milliliter PMA and one micromolar ionomycin.

Cellular suspensions of mouse splenocytes should also be prepared at this time in a sterile hood. Using a microscope and hemocytometer, measure the concentration of cells and adjust the total volume until a stock concentration of two million cells per milliliter is reached.

After incubation is complete, quickly invert the plate onto sterile wipes to remove the cell culture medium from each well. Next, add 200 microliters of the prepared cellular suspension stock solution to the wells in the top row of the ELISPOT plate. Set up the experiment in triplicate, so that each cell type tested will be plated in a set of three grouped columns. Below this, add 100 microliters of plain cell culture medium to the next five rows of the plate, below the rows containing cellular stock solution.

Next, perform a serial dilution by pipetting 100 microliters of the cell suspension from the top row into the row directly below, gently pipetting the solution up and down to evenly distribute the cells. Repeat this process for the remaining rows, moving 100 microliters from the previous row to the row below at each step, continuing until the fifth row has been serially diluted. Leave the sixth row with cell culture medium only, to serve as a control. To stimulate the cells in the experimental wells of the plate, add 100 microliters of the prepared mitogen solution to the cellular suspensions in each well of rows one through five. Be sure to leave the sixth row, which will serve as the control, unstimulated. Replace the lid and incubate the plate at 37 degrees Celsius and 5% CO2 for 24 to 48 hours.

Prepare the diluted biotinylated anti-cytokine detecting antibody. First, prepare 50 milliliters of assay diluent by adding 5 milliliters of 10% fetal bovine serum to 45 milliliters of PBS. Next, dilute the detecting antibody to a concentration of 2 micrograms per milliliter in assay diluent. Also, prepare 20 to 25 milliliters of wash buffer at this time, by mixing .05% Tween-20 and PBS.

After the incubation is complete, uncap the plate and quickly invert it to remove all liquid from the wells. Wash the plate by adding about 200 microliters of wash buffer to each well. Expel this liquid by quickly inverting and flicking the plate over a sink. Repeat this process four more times for a total of five washes. Next, add 100 microliters of the diluted detection antibody solution to each well, replace the lid, and incubate at room temperature for two hours. After incubation, expel the detection antibody solution from the wells of the plate by inverting and flicking the plate over the sink.

As before, wash the plate five times with wash buffer, expelling the liquid between each wash. After the final wash, prepare the streptavidin- horseradish peroxidase solution by diluting it according to the manufacturer’s instructions. Next, with the wells of the plate empty, add 100 microliters of diluted streptavidin- horseradish peroxidase solution to each well. Place the lid back onto the plate and incubate at room temperature for two hours.

After the incubation, no more than 15 minutes before use, activate pre-made AEC substrate solution. Discard the contents of the wells and wash the plate five times with wash buffer, as before. Then, immediately add 100 microliters of prepared AEC substrate solution into each well. Leave the plate at room temperature to develop for approximately 10 to 20 minutes, while monitoring spot development. These spots will appear as small, darkened circles on the surface of the wells. Then, stop the reaction by rinsing the plate with water and flicking it over the sink. Blot the plate on paper towels and allow to air dry overnight or until completely dry. Removing the plastic tray under the plate will facilitate drying. After drying, the spots are ready to be counted with an automated plate reader.

Here, the CTL ImmunoSpot reader is used, but this protocol can be adapted for any reader. Then, open the CTL program and click on Scan Count. Push eject for the tray to extend from the machine. Then, remove the plastic adapter and align row A on the ELISPOT plate and adapter. Choose a file name and location for the file to be saved and load the plate and adapter onto the tray. Click Load on the software and close the door on the side of the machine. Then, press Start After Counting. Ensure that the file is saved and then open the Quality Control QC software to analyze the data and count the number of spots. Export this data as an Excel file. Once analysis is complete, click Eject to retrieve the plate.

In this experiment, cells from wild type and tumor-bearing mice were plated and analyzed for IFN gamma. Notice that the number of spots decreases with decreasing cell concentration. Typically, ELISPOT data are presented as the number of spot counts per number of cells plated. In this example, the number of spots were displayed in a bar graph, with each respective cellular concentration listed on the x-axis. Notice that the number of spots indicates the number of activated cells per total number of cells in a given population.

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