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Transformação de células de E. coli usando um protocolo adaptado de cloreto de cálcio

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Microbiology

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Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

6.9: Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

6.11: Conjugation: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

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10:54 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Natalia Martin¹, Andrew J. Van Alst¹, Rhiannon M. LeVeque¹, e Victor J. DiRita¹
¹ Departamento de Microbiologia e Genética Molecular, Universidade Estadual de Michigan

As bactérias têm a capacidade de trocar material genético (Ácido Desoxiribonucleico, DNA) em um processo conhecido como transferência de genes horizontais. A incorporação do DNA exógeno fornece um mecanismo pelo qual as bactérias podem adquirir novos traços genéticos que lhes permitem adaptar-se às mudanças nas condições ambientais, como a presença de antibióticos ou anticorpos (1) ou moléculas encontradas em habitats naturais (2). Existem três mecanismos de transferência genética horizontal: transformação, transdução e conjugação (3). Aqui vamos focar na transformação, na capacidade das bactérias de tirar DNA livre do meio ambiente. Em laboratório, o processo de transformação tem quatro etapas gerais: 1) Preparação de células competentes, 2) Incubação de células competentes com DNA, 3) Recuperação de células e 4) Revestimento das células para crescimento dos transformadores (Figura 1).

Figura 1: Etapas gerais do processo de transformação. O processo de transformação tem quatro etapas gerais: 1) Preparação de células competentes, 2) Incubação com DNA, 3) Recuperação das células e 4) Células de chapeamento para crescimento dos transformadores.

Para que a transformação ocorra, a bactéria receptora deve estar em um estado conhecido como competência. Algumas bactérias têm a capacidade de se tornarem naturalmente competentes em resposta a certas condições ambientais. No entanto, muitas outras bactérias não se tornam competentes naturalmente, ou as condições para esse processo ainda são desconhecidas. A capacidade de introduzir DNA em bactérias tem uma gama de aplicações de pesquisa: gerar múltiplas cópias de uma molécula de DNA de interesse, expressar grande quantidade de proteínas, como componente em procedimentos de clonagem, entre outros. Devido ao valor da transformação para a biologia molecular, existem vários protocolos que visam tornar as células artificialmente competentes quando as condições de competência natural são desconhecidas. Dois métodos principais são utilizados para preparar células artificialmente competentes: 1) através do tratamento químico das células e 2) expondo as células a pulsos elétricos (eletroporação). O primeiro usa diferentes produtos químicos dependendo do procedimento para criar atração entre o DNA e a superfície celular, enquanto o segundo usa campos elétricos para gerar poros na membrana celular bacteriana através da qual moléculas de DNA podem entrar. A abordagem mais eficiente para a competência química é a incubação com cátions divalent, mais notavelmente cálcio (Ca²⁺) (4,5) Competência induzida por cálcio é o procedimento que será descrito aqui (6). Este método é usado principalmente para a transformação de bactérias Gram-negativas, e esse será o foco deste protocolo.

O procedimento de transformação química envolve uma série de etapas em que as células são expostas a ceações para induzir a competência química. Essas etapas são posteriormente seguidas por uma mudança de temperatura – choque térmico – que favorece a absorção de DNA estranho pela célula competente (7). Os envelopes de células bacterianas são carregados negativamente. Em bactérias gram-negativas como escherichia coli,a membrana externa é carregada negativamente devido à presença de lipopólise (LPS) (8). Isso resulta em repulsa das moléculas de DNA igualmente carregadas negativamente. Na indução de competência química, íons de cálcio carregados positivamente neutralizam essa repulsão de carga permitindo a absorção de DNA na superfície celular (9). O tratamento de cálcio e a incubação com DNA são feitos no gelo. Posteriormente, é realizada uma incubação a temperaturas mais altas (42°C), o choque térmico. Esse desequilíbrio de temperatura favorece ainda mais a absorção de DNA. As células bacterianas precisam estar na fase de crescimento exponencial médio para suportar o tratamento de choque térmico; em outros estágios de crescimento, as células bacterianas são muito sensíveis ao calor, resultando em perda de viabilidade, o que diminui significativamente a eficiência da transformação.

Diferentes fontes de DNA podem ser usadas para transformação. Tipicamente, plasmídeos, pequenas moléculas circulares de DNA de dupla laga, são usados para transformação na maioria dos procedimentos laboratoriais em E. coli. Para que os plasmídeos sejam mantidos na célula bacteriana após a transformação, eles precisam conter uma origem da replicação. Isso permite que eles sejam replicados na célula bacteriana independentemente do cromossomo bacteriano. Nem todas as células bacterianas são transformadas durante o procedimento de transformação. Assim, a transformação produz uma mistura de células transformadas e células não transformadas. Para distinguir entre essas duas populações, é utilizado um método de seleção para identificar as células que adquiriram o plasmídeo. Plasmídeos geralmente contêm marcadores selecionáveis, que são genes codificando um traço que confere uma vantagem para o crescimento (ou seja, resistência a um antibiótico ou químico ou resgate de uma auxotrofia de crescimento). Após a transformação, as células bacterianas são banhadas em mídias seletivas, o que só permite o crescimento das células transformadas. No caso de células transformadas com uma resistência plasmid conferenciando a um dado antibiótico, a mídia seletiva será a mídia de crescimento contendo esse antibiótico. Vários métodos diferentes podem ser usados para confirmar que as colônias cultivadas nas mídias seletivas são transformadores (ou seja, incorporaram o plasmídeo). Por exemplo, plasmídeos podem ser recuperados dessas células usando métodos de preparação plasmídeos (10) e digeridos para confirmar o tamanho plasmídeo. Alternativamente, a COLÔNIA PCR pode ser usada para confirmar a presença do plasmídeo de interesse (11).

O objetivo deste experimento é preparar células quimicamente competentes E. coli DH5α, utilizando uma adaptação do procedimento de cloreto de cálcio (12), e transformá-las com o pUC19 plasmídeo para determinar a eficiência da transformação. A cepa E. coli DH5α é uma cepa comumente usada em aplicações de biologia molecular. Devido ao seu genótipo, especificamente o recA1 e o endA1,esta cepa permite maior estabilidade da inserção e melhorar a qualidade do DNA plasmídeo nas preparações subsequentes. Uma vez que a eficiência de transformação diminui com o aumento do tamanho do DNA, o plasmídeo pUC19 foi usado neste protocolo por causa de seu pequeno tamanho (2686 bp) (ver https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html para um mapa vetorial). pUC19 confere resistência à ampicilina e, portanto, este foi o antibiótico utilizado para seleção.

Procedure

Este protocolo descreve a preparação e transformação do competente E. coli DH5α utilizando uma adaptação do procedimento de cloreto de cálcio (12).

1. Configuração

Equipamento
- Espectrofotômetro
- Centrífuga de Sorval (ou equivalente)
- Centrífuga benchtop
- Bloco de calor ou banho de água
- Orbital Shaker
- Incubadora Estacionária
- Bandeja de fundição de gel
- Bem pentes
- Fonte de tensão
- Caixa de gel
- Fonte de luz UV
- Microondas
Soluções e reagentes
- Caldo luria-bertani (LB) (10 g de hidrolise enzimática de caixa, extrato de levedura de 5 g e cloreto de sódio de 5 g em 1000 mL de H₂O)
- Caldo super ideal com repressão catabólica (SOC): (2% (w/v) triptona, extrato de levedura de 0,5% (w/v), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl_2,10 mM MgSO₄e 20 mM de glicose)
- CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂) solução.
- Solução M CaCl₂ (se as células serão transformadas imediatamente) ou solução de 0,1M CaCl₂ contendo 10% (v/v) glicerol (se as células serão congeladas para uso futuro).
- Placas de ágar LB
- Placas seletivas de ágar LB (para este experimento, uma vez que o plasmid usou resistência à ampicilina, foram utilizadas placas de ágar LB contendo ampicillin 100 μg/mL)
- E. coli Tensão DH5α
- DNA plasmid pUC19 (100 pg/ μl)
- QiAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)
- Hind Enzima de restrição III
- 1 kb mais escada de DNA
- Ponto de fusão baixo Agarose
- Tampão TAE 1X (Base Tris de 40 mM, ácido acético de 20 mM e 1mM EDTA)
- Brometo de ethidium (10mg/mL)
Notas gerais de segurança
E. coli DH5α é classificado como Biossegurança Nível 1 (BSL1). Micróbios nesta categoria representam pouca ou nenhuma ameaça de infecção em adultos saudáveis. No entanto, é necessária uma manipulação cuidadosa do microrganismo.

IMPORTANTE todas as etapas deste protocolo precisam ser realizadas utilizando técnicas assépticas e em temperaturas de gelo ou 4°C, a menos que indicado.

2. Protocolo

A partir de um estoque congelado de E. coli DH5α (congelado em 20% de glicerol de uma cultura durante a noite cultivada em LB) listram bactérias para isolamento em uma placa de ágar LB. Incubar a 37°C durante a noite (16-20 horas).
Inocular uma única colônia em 3 mL de caldo LB em um tubo. Cresça tremendo a 210 rpm a 37°C durante a noite (16-20 horas).
Meça o OD600 da cultura da noite para o dia. Use a cultura da noite para inocular 100 mL de caldo LB em um frasco de 1 litro para um OD600 =0,01. Incubar a cultura tremendo vigorosamente (210 rpm) a 37°C monitorando OD600 no espectrofotômetro a cada 15-20 min, até que a cultura atinja OD600=0,35 (aproximadamente 3 horas).
NOTA: Para que a transformação seja eficiente, as células bacterianas precisam estar em fase de crescimento exponencial médio. O número máximo de células precisa ser de 10⁸ células/mL, o que para a maioria das cepas de E. coli corresponde a OD600 =0,4. O uso do espectrômetro permite medir o OD600, que permite determinar que as células estão no estágio de crescimento adequado. Se este protocolo for usado para outras cepas de bactérias, a calibração para determinar o número de colônias formando unidades em valores específicos de OD600 será necessária para determinar essa correlação.
Transfira os 50 mL da cultura para cada uma das 2 garrafas de centrífugas de polipropileno geladas. Coloque as garrafas no gelo por 20 minutos para esfriar.
Recupere as células por centrifugação a 2700g (4100 rpm em um rotor Sorval GSA) por 10 min a 4°C.
Remova o supernatante. Escorra os últimos traços da mídia colocando a garrafa de cabeça para baixo em um bloco ou papel toalha.
Resuspenda cada pelota bacteriana em 30 mL de uma solução gelada CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂) solução gelada. Primeiro adicione 5 mL da solução, gire cuidadosamente até que a pelota tenha dissolvido completamente e, em seguida, adicione os 25 mL restantes da solução.
Repita o passo 2.4.
Repita o passo 2.5.
Se as células competentes forem diretamente transformadas, resuspenncie cada pelota bacteriana em 2 mL de uma solução gelada cacl₂ (0,1 M) girando os tubos cuidadosamente. Se a pelota não ficar ressuspendida com este método, resuspend por tubos suavemente para cima e para baixo (evitando a formação de bolhas).
Alternativamente, as células competentes podem ser congeladas e armazenadas para uso posterior. Para preparar estoques congelados de células competentes, resuspense a pelota em 2 ml de uma solução 0.1M CaCl₂ contendo 10% (v/v) glicerol. Esta solução precisa ser gelada. Suspensão de células de aliquot em tubos de polipropileno gelado de 1,5 mL (160 μl por tubo). Congele as células competentes imediatamente em um banho seco de gelo/etanol. Transfira os tubos para um congelador de -70°C.
Para transformar as células tratadas com CaCl_2,transfira 50 μl de células competentes para cada um dos tubos de polipropileno de 2,5 ml. Adicione os 1 μl (100 pg) de DNA plasmídeo pUC19 a um dos tubos e deixe o segundo tubo sem DNA (controle negativo). Misture suavemente (evite a formação de bolhas). Incubar por 30 minutos no gelo.
NOTA: Não mais de 50 ng de DNA em um volume de 10 μL ou menos deve ser usado na transformação.
Transfira os tubos para o bloco de calor e incubar a 42°C por 45 s exatamente.
NOTA: O choque térmico é um passo crítico. Não exceda a temperatura ou o tempo de incubação.
Transferência prontamente de tubos para gelo. Incubar por 2 min.
Adicione 950 μL de mídia SOC e incubar os tubos por 1 hora a 37°C para permitir que as bactérias se recuperem e expressem o marcador resistente a antibióticos codificado no plasmídeo.
Diluir 10 μL da suspensão celular em 1000 μL em SOC (diluição de 1/100) e 100 μL da suspensão celular em 1000 μL em SOC (diluição de 1/10). Placa 100 μl das diluições, bem como o controle, em placas seletivas, e espalhar usando uma espátula. Normalmente, o revestimento de 100 μL de uma diluição de 1/100 e 1/10 produzirá número suficiente de unidades formadoras de colônias (cfu) por placa. Idealmente, esse número deve variar entre 30-300 cfu para que haja colônias suficientes, mas separadas umas das outras. No entanto, o número de cfu dependerá da eficiência de transformação (ver Seção de Análise de Dados e Resultados).
Incubar as placas a 37°C. Colônias transformadas devem aparecer em 12-16 horas (essa faixa dependerá da cepa celular e método de seleção). Nenhuma colônia deve crescer no controle negativo.
Conte a cfu/placa obtida para a transformação (Tabela 1).
Para verificar se serão realizados os transformadores do plasmídeo pUC19, será realizada uma preparação plasmida e posterior digestão. Para isso, inocular uma única colônia em 3 ml de caldo LB em um tubo. Cresça tremendo a 210 rpm a 37°C durante a noite (16-20 horas).
Prepare uma preparação plasmida usando o Kit Miniprep QIAprep Spin, de acordo com as instruções do fabricante.
Digerir os 1 μg de pUC19 purificado com a enzima de restrição HindIII a 37°C por 1 hora.
NOTA: Qualquer enzima que corte no local de clonagem múltipla pUC19 pode ser usada para esta etapa.

Componente	Quantidade
Tampão de digestão de restrição de 10X	2,5 μl
Plasmid pUC19	1 μg
Hind III	1 μl
H₂O	20,5 μl (até 25 μl)

Execute uma escada de peso molecular, DNA pUC19 digerido e a mesma quantidade de DNA pUC19 não digerido em um gel de 1% de agarose contendo 1 μg/mL brometo de etídio por 1 hora a 95 V.
NOTA: o tempo e a tensão variam dependendo do equipamento utilizado.
Visualize o gel sob a luz UV. Compare o tamanho do DNA pUC19 digerido e não digerido(Figura 2) (ver Seção de Análise de Dados e Resultados).
Prossiga com as etapas necessárias para verificar a transformação de acordo com o objetivo de cada experimento de transformação em particular.

Figura 2: Digestão do DNA plasmídeo recuperado das células DH5α transformadas. O DNA plasmídeo foi recuperado de células DH5α transformadas, digeridas com HindIII, executadas em um gel de 1% de agarose e visualizadas com uma fonte UV (passos 2,19 a 2,22).

3. Análise e Resultados de Dados

Para calcular a eficiência da transformação, um indicador de quão bem as células ocuparam o DNA extracelular, as colônias obtidas na transformação precisam ser contadas:

Diluição	Cfu
1/100	34
1/10	246

Tabela 1: Unidades formadoras de colônias (cfu) contaram a partir de experimento de transformação.

A eficiência de transformação (TE) é uma medida do número de cfu resultante da transformação de 1 μg de plasmídeo em um determinado volume de células competentes. Muitos parâmetros afetam a eficiência de transformação: tamanho plasmídeo, genótipo celular, estágio de crescimento durante a preparação de competências, métodos de transformação, etc.). Ao calcular o TE é importante considerar qual diluição (se houver) foi realizada antes do emplacamento e incorporá-la no cálculo do número total de cfu. A eficiência de transformação (TE) é calculada com a seguinte equação:

Primeiro divida a cfu pelo μg de DNA, neste exemplo 0,0001μg. Em seguida, divida o resultado pelo fator de diluição. Neste exemplo, foi utilizada uma diluição de 1/10 e 100μL de uma solução de 1 ml (diluição: 1/10 × 100 μL /1000 μL=0,01).

As bactérias são notavelmente adaptáveis e um mecanismo que facilita essa adaptação é sua capacidade de tomar moléculas de DNA externos. Um tipo de DNA que as bactérias podem captar é chamado de plasmídeo, um pedaço circular de DNA que frequentemente contém informações úteis, como genes de resistência a antibióticos. O processo de modificação das bactérias por novas informações genéticas incorporadas a partir de uma fonte externa é referido como transformação. A transformação pode ser facilmente realizada em laboratório usando Escherichia coli, ou E. coli.

Para serem transformadas, as células E. coli devem primeiro ser competentes, o que significa capaz de tomar moléculas de DNA de seu ambiente. O protocolo para conseguir isso é surpreendentemente simples, uma breve incubação das células em uma solução de cloreto de cálcio. Essa incubação faz com que as células se tornem permeáveis às moléculas de DNA. Depois que as células são pelotas por centrifugação, o supernatante é removido. O DNA plasmídeo é agora adicionado às células competentes. Depois de incubar as células com DNA, a mistura é brevemente aquecida a 42 graus Celsius, seguida de rápido resfriamento no gelo. Este choque térmico faz com que o DNA seja transferido através da parede e membranas da célula. As células são então incubadas em mídia fresca. Em seguida, as bactérias são colocadas a 37 graus para permitir que elas seealm suas membranas e expressem proteínas resistentes.

As células que tomaram os plasmídeos copiarão fielmente o DNA e o passarão para sua descendência e expressarão quaisquer proteínas que possam ser codificadas por ele, incluindo mediadores de resistência a antibióticos. Esses genes de resistência podem ser usados como marcadores selecionáveis para identificar bactérias que foram transformadas com sucesso porque as células que não tomaram o plasmídeo não expressarão o produto genético de resistência. Isso significa que quando as células são banhadas em um meio sólido que contém o antibiótico apropriado, apenas as células que tomaram o plasmídeo crescerão. A transformação das células em uma colônia em crescimento pode ser confirmada por cultivar essas células em mídia líquida durante a noite para aumentar o rendimento antes de extrair o DNA da amostra. Uma vez que o DNA é isolado, uma restrição diagnóstica de digestão pode ser realizada. Como enzimas de restrição cortam DNA em locais previsíveis, executar esses digestos em um gel deve mostrar um padrão previsível se o plasmídeo desejado foi transformado com sucesso. Por exemplo, se pUC19 for preparado e cortado com a enzima de restrição HindIII, uma única faixa de 2686 nucleotídeos deve ser vista no gel.

Neste laboratório, você transformará a cepa E. coli DH-5 Alpha com pUC19, e então confirmará a transformação bem sucedida por eletroforese de gel de DNA.

Antes de iniciar o procedimento, coloque os equipamentos de proteção individual adequados, incluindo um jaleco e luvas. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho com 70% de etanol.

Agora, prepare células quimicamente competentes depositando um loop cheio de bactérias em uma placa de ágar estéril e listrando as bactérias com um novo laço. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, esterilize a bancada com 70% de etanol novamente, e retire a placa da incubadora.

Inocular uma única colônia bem isolada em 3 mililitros de caldo LB em um tubo com um laço estéril. Em seguida, cresça a cultura a 37 graus Celsius durante a noite, com agitação a 210 RPM. No dia seguinte, meça a densidade óptica da cultura da noite para o dia com um espectrofotômetro. Em seguida, adicione 100 mililitros de caldo LB a um frasco de um litro, e inocula-o com a cultura da noite para o dia a uma densidade óptica de 0. 01. Agora, incubar a cultura a 37 graus Celsius com agitação, e verificar o OD600 a cada 15 a 20 minutos até que a cultura atinja a fase de crescimento exponencial médio.

Após aproximadamente três horas, transfira 50 mililitros da cultura para duas garrafas de polipropileno gelada. Em seguida, coloque as garrafas de volta no gelo por 20 minutos para esfriar. Em seguida, recupere as células através da centrifugação. Descarte os supernantes e coloque as garrafas de cabeça para baixo em uma toalha de papel. Em seguida, resuspende a pelota bacteriana em cinco mililitros de solução de cloreto de cloreto de cálcio gelado e gire cuidadosamente até que a pelota tenha se dissolvido completamente. Em seguida, adicione mais 25 mililitros da solução à pelota bacteriana dissolvida. Resuspende a outra pelota bacteriana como demonstrado anteriormente. Depois disso, repita a centrifugação e remova os sobrenantes.

Se as células competentes forem diretamente transformadas, resuspense cada pelota bacteriana em dois mililitros de uma solução de cloreto de cálcio molar 0,1 no gelo, girando os tubos cuidadosamente. Para iniciar o procedimento de transformação, transfira 50 microlitradores de células competentes para dois tubos de polipropileno de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione um microliter de DNA plasmídeo pUC19 a um dos tubos. Misture suavemente, evitando a formação de bolhas e incubar os dois tubos por 30 minutos no gelo. Após a incubação, transfira os tubos para um bloco de calor e incubar a 42 graus Celsius por 45 segundos. Transfira imediatamente os tubos para o gelo e incuba por dois minutos. Agora, adicione 950 microliters de mídia SOC a cada tubo e incuba-os por uma hora a 37 graus Celsius para permitir que as bactérias se recuperem, e expresse o marcador resistente a antibióticos codificado no plasmídeo.

Para fazer uma diluição de 1 a 100, adicione 990 microliters de mídia SOC e 10 microliters de suspensão celular a um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, faça uma diluição de 1 a 10 adicionando 900 microliters de mídia SOC e 100 microliters de suspensão celular a um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, placa 100 microliters das suspensões celulares diluídas e 100 microliters do controle negativo, em placas seletivas separadas contendo ampicillina usando um espalhador e incubar as placas a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas. Após a incubação, conte as unidades formadoras de colônias, ou UFC, por placa, obtidas através da transformação, e regise esses dados. Para verificar se os transformadores têm o plasmídeo pUC19, escolha uma única colônia bem isolada de uma placa com um laço estéril, e introduza-o a um tubo contendo 3 mililitros de caldo LB. Em seguida, incubar a cultura a 37 graus Celsius com agitação, durante a noite. No dia seguinte, use um mini kit de preparação de DNA para isolar DNA de 3 mililitros da cultura, de acordo com as instruções do fabricante. Após completar a mini preparação de DNA, digerir o 1 micrograma de pUC19 purificado com uma enzima de restrição a 37 graus Celsius por 1 hora. Agora, carregue 20 microlitres de uma escada de peso molecular, 1 micrograma de DNA plasmídeo digerido, e 1 micrograma de DNA plasmídeo não digerido em poços consecutivos de um gel de 1% de agarose contendo 1 micrograma por mililitro ethidium brometo. Então, execute o gel por 1 hora a 95 volts. Por fim, visualize o gel com um iluminador UV.

Neste experimento, células quimicamente competentes E. coli DH5 Alpha foram preparadas usando uma adaptação do procedimento de cloreto de cálcio e, em seguida, transformadas com o pUC19 plasmídeo para determinar a eficiência da transformação. Para calcular a eficiência da transformação, utilize as contagens de UFC registradas para as 1 em 100 e 1 em 10 diluições, e quaisquer outras diluições com CFU contam entre 30 e 300. Primeiro, a contagem registrada da UFC, 246 neste exemplo, é dividida pela quantidade de DNA, 0,0001 microgramas aqui, que foi banhado. Em seguida, esse número é dividido pelo fator de diluição utilizado para dar eficiência de transformação em UFC por micrograma. Neste exemplo, foi utilizada uma diluição de 1 a 10 e 100 microlitres de uma solução de 1 mililitro foram emplacados, dando um fator final de diluição de 0,01. Na pista plasmida não digerida, o DNA circular pode aparecer como duas ou três bandas diferentes de brilho variado. Isso porque o DNA circular e sem cortes pode existir em vários estados de conformação diferentes, como supercoilado, círculo aberto ou mais linear, e cada um deles se move através do gel a taxas diferentes. A análise da digestão de DNA plasmóide recuperado indicou que o plasmídeo usado tem um tamanho esperado de DNA pUC19, 2.686 pares de bases.

Results

Embora o TE dependa de muitos fatores, preparações celulares não comerciais e competentes, como esta, normalmente produzem de 10^a 10⁷ transformadores por micrograma de plasmídeos. Portanto, esta preparação, com um TE = 2,46 x 10⁸ cfu/μg, rendeu um TE muito além da faixa esperada. Protocolos adicionais estão disponíveis para a fabricação de células supercompetente quando são necessárias maiores eficiências de transformação para uma determinada aplicação (13).

A análise da digestão do DNA plasmídeo recuperado das células transformadas indicou que este plasmídeo tem o tamanho esperado de DNA pUC19 (2686 bp).

Applications and Summary

A transformação é um método poderoso para introduzir DNA exógeno em células bacterianas que é fundamental para muitas aplicações de biologia molecular em laboratório. Além disso, desempenha um papel importante na natureza ao permitir que as células bacterianas troquem material genético que poderia resultar em maior variação genética e permitir a aquisição de diferentes traços benéficos para a sobrevivência sob uma ampla gama de condições. Muitas cepas bacterianas codificam os genes necessários para a competência natural. No entanto, as condições em que esses genes são induzidos ainda são desconhecidas. Mais pesquisas são necessárias para determinar essas condições.

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Transcript

Bacteria are remarkably adaptable and one mechanism which facilitates this adaptation is their ability to take in external DNA molecules. One type of DNA that bacteria can uptake is called a plasmid, a circular piece of DNA that frequently contains useful information, such as antibiotic resistance genes. The process of bacteria being modified by new genetic information incorporated from an external source is referred to as transformation. Transformation can easily be performed in the laboratory using Escherichia coli, or E. coli.

In order to be transformed, E. coli cells must first be made competent, which means capable of taking in DNA molecules from their environment. The protocol for accomplishing this is surprisingly simple, a short incubation of the cells in a calcium chloride solution. This incubation causes the cells to become permeable to DNA molecules. After the cells are pelleted by centrifugation, the supernatant is removed. The plasmid DNA is now added to the competent cells. After incubating the cells with DNA, the mix is briefly heated to 42 degrees Celsius, followed by rapid cooling on ice. This heat shock causes the DNA to be transferred across the cell’s wall and membranes. The cells are then incubated in fresh media. Then, the bacteria are placed at 37 degrees to allow them to reseal their membranes and express resistant proteins.

Those cells which have taken in the plasmids will faithfully copy the DNA and pass it to their progeny and express any proteins that might be encoded by it, including antibiotic resistance mediators. Those resistance genes can be used as selectable markers to identify bacteria which have been successfully transformed because cells that have not taken up the plasmid will not express the resistance gene product. This means that when the cells are plated on a solid medium which contains the appropriate antibiotic, only cells that have taken up the plasmid will grow. Transformation of the cells in a growing colony can be further confirmed by culturing those cells in liquid media overnight to increase the yield before extracting the DNA from the sample. Once the DNA is isolated, a diagnostic restriction enzyme digest can be carried out. Because restriction enzymes cut DNA in predictable locations, running these digests on a gel should show a predictable pattern if the desired plasmid was successfully transformed. For example, if pUC19 is prepared and cut with the restriction enzyme HindIII, a single band of 2686 nucleotides should be seen on the gel.

In this lab, you will transform E. coli strain DH-5 Alpha with pUC19, and then confirm the successful transformation by DNA gel electrophoresis.

Before starting the procedure, put on the appropriate personal protective equipment, including a lab coat and gloves. Next, sterilize the workspace with 70% ethanol.

Now, prepare chemically competent cells by depositing a loopfull of bacteria onto a sterile LB agar plate and streaking the bacteria with a new loop. Then, incubate the plate at 37 degrees Celsius overnight. The next day, sterilize the bench top with 70% ethanol again, and remove the plate from the incubator.

Inoculate a single, well-isolated colony into 3 milliliters of LB broth in a tube with a sterile loop. Then, grow the culture at 37 degrees Celsius overnight, with shaking at 210 RPM. The next day, measure the optical density of the overnight culture with a spectrophotometer. Then, add 100 milliliters of LB broth to a one-liter flask, and inoculate it with the overnight culture at an optical density of 0. 01. Now, incubate the culture at 37 degrees Celsius with shaking, and check the OD600 every 15 to 20 minutes until the culture reaches mid-exponential growth phase.

After approximately three hours, transfer 50 milliliters of the culture to two ice-cold polypropylene bottles. Then, place the bottles back on ice for 20 minutes to cool. Next, recover the cells via centrifugation. Discard the supernatants and place the bottles upside down on a paper towel. Next, resuspend the bacterial pellet in five milliliters of ice-cold calcium chloride magnesium chloride solution and swirl carefully until the pellet has dissolved completely. Then, add another 25 milliliters of the solution to the dissolved bacterial pellet. Resuspend the other bacterial pellet as previously demonstrated. After this, repeat the centrifugation, and remove the supernatants.

If the competent cells are going to be directly transformed, resuspend each bacterial pellet in two milliliters of an ice-cold 0.1 molar calcium chloride solution by swirling the tubes carefully. To begin the transformation procedure, transfer 50 microliters of competent cells to two labeled 1.5 milliliter polypropylene tubes. Then, add one microliter of pUC19 plasmid DNA to one of the tubes. Mix gently, avoiding bubble formation, and incubate both tubes for 30 minutes on ice. After incubation, transfer the tubes to a heat block and incubate at 42 degrees Celsius for 45 seconds. Immediately transfer the tubes to ice, and incubate for two minutes. Now, add 950 microliters of SOC media to each tube and incubate them for one hour at 37 degrees Celsius to allow the bacteria to recover, and express the antibiotic resistant marker encoded in the plasmid.

To make a 1 to 100 dilution, add 990 microliters of SOC media and 10 microliters of cell suspension to a 1.5 milliliter tube. Then, make a 1 to 10 dilution by adding 900 microliters of SOC media and 100 microliters of cell suspension to a 1.5 milliliter tube. Next, plate 100 microliters of the diluted cell suspensions and 100 microliters of the negative control, onto separate selective plates containing ampicillin using a spreader and incubate the plates at 37 degrees Celsius for 12 to 16 hours. After incubation, count the colony-forming units, or CFUs, per plate, obtained through transformation, and record these data. To verify that the transformants have the pUC19 plasmid, pick a single, well-isolated colony from a plate with a sterile loop, and introduce it to a tube containing 3 milliliters of LB broth. Then, incubate the culture at 37 degrees Celsius with shaking, overnight. The next day, use a DNA mini prep kit to isolate DNA from 3 milliliters of the culture, according to the manufacturer’s instructions. After completing the DNA mini prep, digest the 1 microgram of purified pUC19 with a restriction enzyme at 37 degrees Celsius for 1 hour. Now, load 20 microliters of a molecular weight ladder, 1 microgram of digested plasmid DNA, and 1 microgram of undigested plasmid DNA into consecutive wells of a 1% agarose gel containing 1 microgram per milliliter ethidium bromide. Then, run the gel for 1 hour at 95 volts. Finally, visualize the gel with a UV illuminator.

In this experiment, E. coli DH5 Alpha chemically competent cells were prepared using an adaptation of the calcium chloride procedure, and then transformed with the plasmid pUC19 to determine transformation efficiency. To calculate the transformation efficiency, use the recorded CFU counts for the 1 in 100 and 1 in 10 dilutions, and any other dilutions with CFU counts between 30 and 300. First, the recorded CFU count, 246 in this example, is divided by the amount of DNA, .0001 micrograms here, that was plated. Then, this number is divided by the dilution factor used to give the transformation efficiency in CFUs per microgram. In this example, a 1 to 10 dilution was used and 100 microliters of a 1 milliliter solution was plated, giving a final dilution factor of 0.01. In the undigested plasmid lane, the circular DNA may appear as two or three different bands of varying brightness. This is because the circular, uncut DNA may exist in several different conformation states, such as supercoiled, open circle, or more linear, and each of these move through the gel at different rates. Analysis of the recovered plasmid DNA digestion indicated that the plasmid used has an expected size of pUC19 DNA, 2,686 base pairs.

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