In vivo Bioluminescent imagem de tumores mamários Usando Spectrum IVIS

Células tumorais mamárias expressar luciferase são implantados subcutaneamente em camundongos e visualizado utilizando imagens ópticas para monitorar o crescimento do tumor e de desenvolvimento não-invasiva em um estudo longitudinal.

Para iniciar este procedimento, a linhagem celular de tumor mamário que expressa luciferase é descongelada de caules congelados e depois expandida em cultura para fluência de 90% de COF. A diluição serial de células suspensas é então semeada em 96. Placas de poço expostas a luciferiano e, em seguida, o número ideal de células gerando emissões fluorescentes acima de 500 fótons é determinado usando uma placa As células do leitor são então injetadas, subcutaneamente no flanco de um animal e, em seguida, a luciferase é injetada.

As células intraperitoneais podem ser visualizadas até 10 minutos após a administração de Lúcifer, e a massa tumoral pode ser visualizada até um mês in vivo até o início da necrose. Olá, sou Ed Lim, do Laboratório de Imagens da Caliper Life Sciences em Alameda, Califórnia. Hoje mostraremos um procedimento para monitorar o crescimento do tumor em camundongos de forma não invasiva usando bioluminescência.

Este procedimento é utilizado em nosso laboratório e no laboratório ivus, o mundo inteiro para estudar o crescimento e desenvolvimento tumoral, especialmente após o tratamento com compostos medicamentosos. Então vamos começar. Este procedimento começa com a preparação da linha de células tumorais para injeção no camundongo.

Uma ampla gama de linhagens de células cancerígenas que expressam luciferase pode ser usada para experimentos pré-clínicos bioluminescentes. Essas células são fornecidas como uma cultura congelada livre de patógenos, que crescerá prontamente em meios padrão sem a necessidade de marcadores de seleção. Para nosso experimento, usaremos a linha celular de tumor mamário murino 41 Luke, que expressa o gene da luciferase que serve como um indicador óptico da expressão gênica ou tumorgênese.

In vivo, usaremos a expressão da luciferase para rastrear o crescimento do tumor primário de forma não invasiva, mas também pode ser usada para localizar e monitorar lesões metastáticas. A atividade da luciferase deve ser verificada antes da injeção e, para isso, um frasco de 90% confluente é colhido por tripsina e depois contado. 50.000 células são então dispensadas em um único poço de uma placa de microtitulação e a diluição em série é realizada.

Lúcifer é adicionado aos poços a 150 microgramas por mililitro e incubado por dois minutos. A microplaca pode ser visualizada em ivus ou em um leitor de placas luminescentes para determinar os níveis de expressão. Esta linhagem celular expressa até 6.500 fótons por segundo por célula, mas qualquer nível de expressão acima de 30 fótons por segundo por célula pode ser obtido com sucesso in vivo.

Agora que temos células de atividade ideal, podemos prosseguir para a etapa de injeção subcutânea. Para facilitar a detecção ideal do tumor, estamos usando uma cepa de camundongo nu imunocomprometido tímico A. Antes da injeção, os animais são anestesiados com flúor 3% ISO por cinco minutos para anestesia profunda.

Em seguida, injetaremos 250.000 células em cem microlitros de PBS por via subcutânea no flanco. Carregue as células em uma seringa de um mililitro e conecte uma agulha de calibre 26. Levante a pele suavemente com uma pinça para fazer uma tenda e injetar as células na base.

As células recém-injetadas podem ser visualizadas imediatamente. Um total de 150 miligramas de Lúcifer por quilograma de peso corporal é então administrado por meio de duas injeções na cavidade peritoneal. Neste estudo, os animais são fotografados 10 minutos após a injeção luciferiana para garantir um fluxo consistente de fótons.

Mostraremos isso na próxima etapa. Para nosso experimento, usaremos o sistema de imagem in vivo do espectro IVUS, que usa um dispositivo acoplado de carga reduzida traseira resfriado a 90 graus Celsius negativos para atingir a sensibilidade máxima. Para suportar quantificação absoluta, o sistema mede a carga escura durante o tempo de inatividade e executa uma autocalibração durante a inicialização.

Para iniciar a geração de imagens, inicialize o sistema IVUS e defina os parâmetros de imagem para o experimento. Selecione o campo de visão. Para o número de animais que estão sendo fotografados, até cinco animais podem ser mantidos no instrumento usando o coletor anestésico integral.

O estágio está a uma constante de 37 graus Celsius para manter a temperatura corporal nos animais. Uma porta de eletrocardiograma é fornecida para monitorar a saúde animal durante procedimentos estressantes na exposição do software de imagem viva, o tempo de parada F e a ligação pix podem ser otimizados com base no nível de expressão da linha celular. Essas configurações podem ser alteradas a qualquer momento durante um experimento sem afetar o resultado quantitativo.

Ivus adquire uma imagem fotográfica do animal sob luz branca em um sinal bioluminescente ou fluorescente quantitativo, que é sobreposto à imagem, o sinal bioluminescente é expresso em fótons por segundo e exibido como um mapa de intensidade. A exibição da imagem é ajustada para fornecer contraste e resolução ideais na imagem sem afetar a quantificação. A luminescência das células pode ser medida no local da injeção usando uma região de interesse. Ferramenta.

Os dados de medição são exibidos na tabela junto com todos os parâmetros experimentais relacionados à captura de imagem, que podem ser salvos ou exportados. Para análise, várias imagens podem ser adquiridas e comparadas e estudos longitudinais cobrindo segundos ou meses, dependendo da natureza do experimento. Mediremos o fluxo de fótons do tumor no tempo zero e monitoraremos por quatro semanas.

Com imagens em intervalos quinzenais, o fluxo de fótons do tumor é proporcional ao número de células vivas que expressam luciferase. Portanto, a bioluminescência se correlaciona diretamente com o tamanho do tumor cinco dias após a implantação. O tumor ainda não é palpável, mas as células podem ser quantificadas por meio de bioluminescência e o tumor está crescendo ativamente.

Nesta fase, o sinal de bioluminescência é muito mais forte. O tempo de exposição f-stop e a rotação de pixels podem ser ajustados para que a imagem fique nítida e a câmera não sature. O IVUS compensa automaticamente as mudanças na coleta de luz.

Portanto, essas medições podem ser comparadas às coletadas anteriormente e mais tarde. No experimento. Aos 15 dias pós-implantação, os tumores são palpáveis e a medição da bioluminescência já gerou 15 dias de dados.

Aos 28 dias, os tumores pós-implantação estão se tornando necróticos e as células começam a morrer. O tamanho do tumor estimado pela medição do paquímetro não muda sensivelmente, mas a luminescência do tumor diminuirá. A indicação do calibre da morte celular e da medição da bioluminescência pode ser continuada até que um ponto final humano seja alcançado.

A necrose tumoral devido à hipóxia ou regimes de tratamento serão indicados pela redução da bioluminescência, mesmo que não reduzam a massa tumoral. Acabamos de mostrar como monitorar o desenvolvimento de tumores subcutâneos, um modelo simples de camundongo xenoenxerto usando imagens bioluminescentes. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de verificar o nível de expressão de suas células antes da implantação.

Em segundo lugar, para máxima reprodutibilidade, a imagem dos animais no momento ideal após a injeção luciferiana. A sensibilidade do método permite monitorar o desenvolvimento do tumor nos estágios iniciais, porque os tumores podem ser medidos por bioluminescência muito antes de poderem ser medidos de forma confiável por paquímetros. Lembre-se de otimizar seus parâmetros de imagem em cada estágio Esse sinal de luminescência não satura, mas por luminescência, os animais podem ser monitorados quantitativamente por meses para estudar os efeitos da remissão e da recaída.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.