Cultura primária de Miócitos Coração Adulto Rat

Neste artigo, descrevemos uma forma típica para isolar e cultura miócitos adulto coração de rato. Colagenase e protease são usadas para digerir e isolar miócitos único. Miócitos cultivadas seguir este protocolo de responder às necessidades mais experiência.

O procedimento começa com a excisão do coração de um rato adulto e pendurá-lo no sistema de perfusão. As soluções enzimáticas podem perfundir por cerca de 30 minutos, após os quais o coração é removido. A digestão picada e enzimática pode continuar num pequeno copo.

No final da digestão, as células são dissociadas em uma única suspensão celular por agitação mecânica e filtradas em um tubo estéril. As células cardíacas primárias são lavadas três vezes em tampões com concentração crescente de cálcio, ressuspensas em cultura, meio e plaqueadas em placas de cultura de tecidos revestidas com laminado. Olá, sou Shahi, do laboratório de Henry Cowa, no Departamento de Fisiologia e Física Celular da Universidade de Columbia.

Hoje mostraremos um procedimento para isolar e cultivar outras células cardíacas de ratos. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar os canais de cálcio no coração. Então vamos começar.

No dia anterior à cirurgia no rato, certifique-se de que todas as soluções foram feitas, mas não adicione nenhuma enzima ainda. Os tampões a B e o tampão de lavagem devem ser filtrados quanto à esterilidade antes do armazenamento a quatro graus Celsius. Seis placas de cultura de tecidos de poço também devem ser revestidas com solução laminada no dia anterior e armazenadas a 37 graus Celsius em uma incubadora de CO2.

No dia da cirurgia. Prepare os instrumentos cirúrgicos higienizando a tesoura e a pinça com etanol 70% e deixe secar em uma toalha de papel. Uma seringa de um mililitro cheia de meio mililitro de solução de heparina está pronta.

Agora é uma boa prática lavar o aparelho de perfusão com etanol a 70% com a bomba peristáltica ao contrário. Uma vez terminado, enxaguar com etanol, enxaguar o aparelho com água bidestilada e, finalmente, enxaguar com tampão A. O fluxo é recolhido num copo e colocado num banho-maria a 37 graus Celsius. Para preparar o aparelho de profusão limpo, encha o tubo da seringa direita com 40 mililitros de tampão A e o tubo da seringa esquerdo com 40 mililitros de tampão B. Prepare o tubo de perfusão até a ponta do cateter, permitindo que o tampão A flua através do aparelho.

Reabasteça a seringa tampão até o nível de 40 mililitros. Certifique-se de que não haja bolhas de ar presas na tubulação após esta etapa, agora desligue o tampão, uma seringa com a válvula da torneira de parada e repita o processo de forma que a tubulação de profusão esteja agora preparada com o tampão B. O aparelho de profusão está finalmente pronto e é deixado com o tampão. B pare a válvula da torneira aberta, mas o fluxo é interrompido.

Utilizando o regulador na linha IV, rejeitar o fluxo tampão através do copo de recolha. A última coisa a fazer antes da cirurgia é adicionar as enzimas necessárias à sua solução estoque e, em seguida, filtrar a solução enzimática da mesma forma que as outras soluções foram filtradas no dia anterior. Uma vez filtrada, esta solução pode ser deixada à temperatura ambiente seguindo o protocolo padrão.

Eutanásia do rato com iso flúor em uma câmara de gás. Higienizar a área da incisão no tórax com etanol 70%. Abra o peito usando uma tesoura e exponha o coração.

Injete no ventrículo esquerdo uma solução de heparina a 0,5 mililitros. Remova o coração com uma grande parte da aorta intacta. Insira imediatamente o cateter na aorta.

Um coração de rato típico deve produzir uma alta fração de miócitos saudáveis em forma de bastonete e poucas células mortas arredondadas. Se o procedimento a seguir for seguido corretamente, para começar, prenda a aorta ao cateter. A ponta do cateter não deve ser empurrada muito para dentro do coração para garantir uma boa perfusão do coração através da artéria coronária.

Uma vez pinçada, amarrada a aorta ao cateter com a sutura. Em seguida, abra o regulador de linha IV para permitir uma taxa de gotejamento rápida e permitir que a abelha tampão lave o coração durante a lavagem da abelha tampão. Use a pequena tesoura e fórceps para remover os átrios e qualquer tecido adiposo ou pulmonar agarrado ao coração.

Depois que o buffer B for concluído, alterne o fluxo para buffer por um tempo. O tampão A pode fluir por cinco minutos. Aqueça a solução enzimática em banho-maria a 37 graus Celsius.

Quando o tampão A está esgotado da seringa, mas ainda presente no tubo, carrega 50 mililitros da solução enzimática na seringa A do aparelho de profusão. Agora é necessário descartar todo o fluxo do copo de coleta no banho-maria até que a solução enzimática examine o coração. Assim que a solução enzimática examinar o coração, ative a bomba peristáltica, que é configurada para transferir a solução enzimática do copo coletor para a seringa reabastecida.

A Deixe a solução enzimática fluir pelo coração por 10 minutos. À medida que o coração é digido, ele começa a parecer inchado em 37,5 microlitros de cloreto de cálcio 0,1 molar para a solução enzimática na seringa A para dar uma concentração efetiva de cálcio 0,1 milimolar. Esta é a primeira de várias adições de cloreto de cálcio usadas para aumentar a concentração após 10 minutos, aumentar a concentração de cálcio para 0,2 milimolar adicionando mais 50 microlitros de cloreto de cálcio 0,1 molar à seringa A e deixar a profusão prosseguir por mais 10 minutos.

Decorridos 10 minutos, cortar os ventrículos e transferir o coração para um pequeno copo estéril contendo 20 mililitros de solução enzimática no copo. Aumente a concentração de cálcio para 0,4 milimolar adicionando mais 40 microlitros de cloreto de cálcio 0,1 molar, pique suavemente o coração em 10 ou mais pedaços com uma pequena tesoura estéril. Agora incube o béquer a 37 graus Celsius com um balanço suave.

Após cinco minutos de incubação, adicione 40 microlitros de cloreto de cálcio 0,1 molar para obter uma concentração efetiva de 0,6 milimolar de cálcio e itere suavemente os pedaços de coração com uma pipeta de transferência de plástico três a cinco vezes após a incubação por mais cinco minutos a 37 graus Celsius, adicione 40 microlitros de cloreto de cálcio 0,1 molar e itere suavemente como antes. Use um filtro estéril de 500 micrômetros para separar os miócitos individuais digeridos do tecido conjuntivo não digerido. Deixe as células assentarem em um tubo de 50 mililitros por 10 minutos em temperatura ambiente, empurre o sobrenadante com uma transferência VI Ressuspenda suavemente as células no tampão de lavagem número um e deixe as células assentarem por 10 a 20 minutos em temperatura ambiente enquanto as células estão assentando.

Pegue uma pequena alíquota e use esse tempo como uma oportunidade para avaliar a qualidade e a viabilidade das células em suspensão sob um microscópio invertido. Uma boa preparação terá uma alta proporção de células semelhantes a bastonetes com estrias nítidas. Assim que as células se acomodarem, descarte o snat e ressuspenda suavemente as células no tampão de lavagem.

Número dois, deixe as células assentarem em temperatura ambiente, o que deve levar novamente de 10 a 20 minutos e descarte o sobrenadante. Ressuspenda suavemente as células em meio de soro a 5% antes de transferir as células para placas de cultura de tecidos. Lave as placas com um XSFM.

Transfira as células na densidade desejada e incube em uma incubadora de cultura de tecidos de CO2. Por três a cinco horas, mude o meio para um XSFM As células podem ser cultivadas por até quatro dias e usadas conforme necessário para experimentos. Deve haver mais de 70% de miócitos de coração vivo sob microscópio invertido quando o protocolo é feito corretamente.

Estes são miócitos isolados transfectados com YFP REM após serem cultivados por 48 horas. Células dessa qualidade são normalmente cultivadas a partir desse procedimento. Vamos apenas mostrar como isolar e a cultura são essas células quentes.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de ser o mais rápido e limpo possível. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.