In vivo como Cultura Wholemount organotípicas murino da retina

Olá, meu nome é Nicole Dunca. Sou chefe do Departamento de Neuro do Instituto de Anatomia da Universidade de D book ASIN na Alemanha. Olá, sou estudante de doutorado no Professor Dunca Lab do Departamento de Neuroanatomia.

Hoje mostraremos um sistema útil para cultivar neurorretinas próximas à situação NI como hormônios retinianos organotípicos. Então, vamos começar. A ablação direcionada de genes e a análise de modelos animais é uma estratégia clássica para inscrever a função gênica específica da retina.

No entanto, os modelos de camundongos transgênicos geralmente exibem litologia precoce ou sofrem de malformações graves, impedindo uma análise além dos estágios embrionários ou pós-natais iniciais. A cultura de células primárias é uma alternativa para investigar os efeitos de fatores recombinantes aplicados exogenamente em um ambiente controlado. A cultura de células dissociadas tem a vantagem de que os sinais endógenos que chegam às células-alvo são reduzidos, facilitando assim a identificação de efeitos desencadeados exogenamente.

No entanto, interações celulares importantes são destruídas em culturas dissociadas. Por outro lado, as culturas organotípicas de hormônios retinianos fornecem um sistema próximo à situação fisiológica in vivo com interações e conexões neuronais ainda preservadas. Em nosso artigo em vídeo, fornecemos uma demonstração passo a passo da micro dissecção dos olhos morinos, incluindo a remoção do cristalino e do vítreo.

Após o rato de 15 dias Emyo foi morto por decapitação. Os olhos são nucleados pelo uso de pinças curvas finas, descascando o gelo da órbita ocular. Dois dias após o nascimento, filhotes de camundongos jovens são mortos por decapitação até o pós-natal.

Dia 15, o momento em que os ratos abrem os olhos, os isolados devem ser abertos mecanicamente com o uso de fórceps. A ponta da pinça de curva fina é inserida na órbita e o tecido conjuntivo ao redor do olho é removido. Como no segundo dia pós-natal, os ossos orbitais ainda cartilaginosos e moles.

É importante não aplicar muita pressão com o fórceps ao tentar remover os olhos. Filhotes de camundongos de 15 dias são mortos por luxação cervical. Depois, os isolados são ampliados por duas transferências, cortes com tesoura de mola.

Em seguida, os olhos são nucleados com a ajuda de pinças curvas, aplicando pressão na órbita e transferidas para uma placa de Petri. Com PBS, camundongos adultos são mortos por luxação cervical E os olhos podem ser diretamente nucleados com a ajuda de pinças curvas aplicando pressão na órbita. Vamos demonstrar as peculiaridades nesta seção de olhos morinos de diferentes estágios de desenvolvimento, do olho morino esquerdo para o direito no dia embrionário 15, pós-natal no segundo dia, pós-natal no 15º dia e um olho adulto em uma pequena placa de Petri.

Com PBS estéril, as camadas oculares circundantes devem ser removidas durante a dissecção, ambos os antebraços devem repousar na bancada. Para estabilizar as mãos, o olho é girado com o local da lente voltado para o fundo da placa de Petri. Ao dissecar os olhos embrionários, o local onde o nervo óptico em desenvolvimento alivia o olho é frequentemente coberto por tecido conjuntivo, que precisa ser removido para criar espaço para entrar no espaço sub-retiniano entre a retina e o epitélio pigmentar pelas pontas de uma pinça muito fina, a esclera e o epitélio pigmentar ainda são muito macios e fáceis de remover.

No entanto, certifique-se de remover completamente o plexo capilar triangular sob o corpo vítreo, juntamente com o vítreo. Este plexo pegajoso é difícil de remover separadamente do copo retiniano restante sem danificar a retina, mas impedirá o excesso de substâncias aplicadas exogenamente nas camadas da retina. Durante as manipulações farmacológicas no segundo dia pós-natal, o nervo óptico na parte de trás do olho precisa ser pinçado por uma pinça.

As camadas oculares circundantes, incluindo a esclera e o epitélio pigmentar, ainda são macias e fáceis de remover. No entanto, tome cuidado para não danificar a retina. Ao entrar no espaço sub-retiniano através do orifício do nervo óptico, o epitélio pigmentar é removido junto com a membrana coróide e a esclera, rasgando cuidadosamente para ambos os lados com ambas as pinças.

A ocular é então virada para o lado da lente, a lente e o vítreo agarrados com uma pinça. E enquanto rasga, a ocular está segurando Place com a outra pinça. No 15º dia pós-natal, o nervo óptico freqüentemente se mantém ligado ao olho durante uma nucleação e deve ser pinçado com uma pinça o mais próximo possível da base.

A esclera já está mais apertada e, portanto, entrando no espaço sub-retiniano. No orifício onde o nervo óptico foi removido e a descamação da membrana coróide da esclera e do epitélio pigmentar torna-se mais difícil do que em P dois. Retire as camadas até o nível da córnea, gire a ocular para o local da lente e remova a córnea junto com o pigmento, o epitélio, a membrana coróide e a esclera.

Enquanto segura o copo retiniano restante pela outra pinça, segure o vítreo junto com a pequena lente e, enquanto rasga com uma pinça, mantenha o suporte do hormônio da retina no lugar com a outra pinça no olho adulto. O nervo óptico, que precisa ser pinçado para ter acesso ao espaço sub-retiniano, é muito mais espesso em comparação com os estágios pós-natais. O mais claro é extremamente firme e a penetração com fórceps para entrar no espaço sub-retiniano acabará sendo uma parte difícil na dissecção, arrancando o epitélio pigmentar junto com a membrana atual e a esclera se torna mais dura e precisa de mais força controlada.

A remoção do vítreo é muito mais fácil em comparação com os olhos embrionários, mas o vítreo precisa ser agarrado pelos lados. Não perfure o vítreo com as pontas da pinça, pois seu conteúdo grudará na pinça, dificultando sua remoção. Antes de iniciar a cultura, a hialuronidase contendo membrana interna e autolimitante das células gliais precisa ser parcialmente digerida para facilitar a penetração de substâncias aplicadas exogenamente para esse fim, tubo H 200 microlitros pH balance, ous modified eagles medium contendo 0,5 miligrama por mililitro de hialuronidase em cada poço de uma placa de 96 poços para transferir o monte de retina sem danos.

A ponta de uma pipeta de um mililitro é cortada alguns milímetros para alargar a abertura e as arestas de corte são suavizadas pela inserção e torção de uma segunda ponta de pipeta. Os hormônios da retina são transferidos da placa de coleta de 96 poços para a placa de 96 poços contendo meio com dias altos e pré-incubados por 15 minutos a 37 graus centígrados. Em seguida, os hormônios são transferidos para uma placa de 24 poços contendo dois mililitros quimicamente definidos para BECUs modificados Eagles.

Médio por poço. As culturas de hormônio da retina são devolvidas a uma incubadora e mantidas por 24 a 48 horas a 37 graus centígrados em uma atmosfera de 5% de CO2, 850 microlitros de PBS e 50 microlitros de zero de sangue bovino. Os meus são pipetados para tubos eph de dois mililitros com fundo redondo.

O uso de tubos eph de fundo redondo em vez dos tubos crônicos clássicos melhorou a precipitação das células durante a centrifugação, resultando em uma paleta de células mais estável. Após o tempo de cultura desejado, os mos da retina são transferidos da placa de 24 poços para os tubos de dois mililitros contendo PBS e o meu álbum X bovino. Os tubos eph contendo o mos da retina são colocados em um bloco de aquecimento aquecido a 37 graus centígrados, 25 microlitros de colagenase e 25 microlitros.

Dias hialurônicos são adicionados a cada cubo eph e a dissociação dos hormônios retinianos em suspensão de célula única é iniciada por três pars através de pipetas Poster siliconizadas. 10 microlitros de tripsina são adicionados e a suspensão celular incubada por três a cinco minutos. O tempo de incubação para a dissociação do zimo varia e depende do tamanho dos olhos e do estágio de desenvolvimento, respectivamente.

Verifique o estágio de digestão enzimática do tecido pipetando suavemente para cima e para baixo Após alguns minutos, 10 microlitros de DNAs são editados após outro período de incubação de cerca de três a cinco minutos. A suspensão celular é ainda mais homogeneizada pipetando lentamente para cima e para baixo. Quando a suspensão celular parece homogênea, a digestão do tecido é interrompida pela adição de 10 microlitros de EDTA e os tubos de eol são removidos do aquecedor.

Um mililitro de Hyde gelado fresco 8% Perfomal é adicionado a cada tubo EOL e as suspensões celulares são fixadas à temperatura ambiente em um agitador de rotação. Após uma hora de fixação, as suspensões de células são removidas do agitador de rotação e colocadas em uma centrífuga de resfriamento. As suspensões celulares são centrifugadas por cinco minutos a 40 graus centígrados e a 0,2 força relativa e ugal, a suspensão celular paliada é removida da centrífuga.

O SUP natante é descartado e o patê é ressuspenso em um mililitro. PBS contendo três miligramas por mililitro BSA. Depois de repetir essas etapas de lavagem duas vezes, o pellet é finalmente ressuspenso em 500 microlitros.

PBS contendo três miligramas por mililitro. BSA cinco milimolares EDTA e 0,1% de ácido de sódio se uma coloração imunoquímica se seguir, não adicione ácido de sódio ao tampão de suspensão Resus. E isso resulta em perda de qualidade de coloração.

Uma lâmina de microscópio de extremidade fosca, um filtro de citosina com um ou dois orifícios e uma fileira de funil de citosina inserida em um clipe de citosina E o leve clipe é fechado. Certifique-se de que os orifícios do funil e o filtro de citosina estejam alinhados. Todos os clipes de lâmina são colocados no centro de citosina.

O rotor futuro homogeneizado é a suspensão celular associada pipetando suavemente para cima e para baixo. Ao pipetar um Equa de 100 microlitros da suspensão celular para o funil, a ponta da pipeta deve atingir todo o caminho até o fundo do funil. É importante não empurrar o segundo ponto de pressão da pipeta.

Se isso criar bolhas de ar no ponto da célula, o que dificultará a contagem de células, então a tampa é colocada no rotor e o rotor levantado na centrífuga. As suspensões de célula única são centrifugadas a 700 RPM por sete minutos. O rotor é removido da citosina e a tampa é aberta.

O clipe lateral é aberto e o funil e o clipe deslizante são removidos. Em seguida, o ponto da vela é marcado adicionando na parte de trás do slide. Enquanto o filtro ainda está no lugar, o filtro é removido e a corrediça com um ponto de vela é uma lamínula com darie no meio de montagem.

Alternativamente, o ponto celular pode ser corado imunoquimicamente com BREU ou anticorpos neuroespecíficos. Acabamos de demonstrar as vantagens dos hormônios organotípicos da retina, proporcionando um sistema de cultura próximo à situação fisiológica in vivo com interações e conexões neuronais ainda preservadas. Este sistema de cultura facilita significativamente a acessibilidade para manipulações de olhos morinos.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.