Análise de DNA dupla fita-Break Repair (DSB) em células de mamíferos

Demonstrado neste protocolo de vídeo é um método para medir a eficiência e precisão do reparo do freio de fita dupla de DNA por NHEJ ou HR em uma linhagem celular de mamíferos. O procedimento começa com a geração de uma linha celular contendo uma única cópia cromossomicamente integrada do NHEJ ou do repórter HR. Essas células repórter são então transfectadas com uma mistura de I SCE, um plasmídeo expressor e vermelho DS e um plasmídeo.

Eu sce. Uma endonuclease produz uma quebra de fita dupla na construção repórter e o DS RED serve como um controle de transfecção. A porcentagem de glóbulos vermelhos positivos para GFP e DS positivos é então analisada por fax para quantificar a eficiência do NHEJ ou HR, se desejado.

A fidelidade do reparo é analisada resgatando os produtos repórter em e coli e sequenciando os produtos de reparo. Desta forma, a eficiência e a fidelidade da quebra da fita dupla ou reparo de DSB em uma determinada linhagem celular são determinadas com base na quantificação citométrica de fluxo de eventos de reparo e sequenciamento dos produtos de reparo. Este método tem muitas vantagens sobre os métodos existentes para a análise do reparo de freio de corda dupla.

Em primeiro lugar, este método diferencia especificamente entre uma recombinação homóloga e não homóloga e junção. Então o método é altamente quantitativo, permitindo a análise de milhões de células por citometria de fluxo e então o método não requer empacotamento extensivo de células após o reparo estar completo para seleção de cls resistentes a antibióticos. E, por último, a conclusão do reparo pode ser monitorada em tempo real, observando a aparência das células verdes.

E esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de reparo, como medir a FC e a eficiência do reparo HEGA em tipos de células mutantes de vírus ou após tratamentos medicamentosos. Examine o reparo A em diferentes estágios do ciclo celular e medindo a taxa do reparo tão geral. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é importante alcançar uma boa eficiência de transfecção.

Neste procedimento. Dois repórter são usados para testar o reparo de quebras de DNA de fita dupla. Um é usado para examinar a junção de extremidade não homóloga ou o reparo N-H-E-J-D-N-A.

O outro é usado para observar a recombinação homóloga ou o reparo do DNA HR na extremidade não homóloga. A fita repórter contém um gene GFP com um íntron de três quilobases projetado do gene PEM um ou GFP PEM. Em suma, a introdução de P um contém um éxon adenoviral flanqueado por sequências de reconhecimento para Hindi três e I SCE uma endonuclease para indução de quebras de fita dupla.

Os sítios I SCE um são uma orientação invertida I SCE um tem uma sequência de reconhecimento não palindrômica, portanto, dois sítios invertidos geram incompatibilidade. O DNA termina incompatível. As extremidades do DNA imitam melhor o dss que ocorre naturalmente.

Um NAEJ não arranjado é negativo para GFP, pois o éxon adenoviral interrompe o G-F-P-O-R-F. Após a indução de quebras de DNA de fita dupla por ISEE um, o éxon adenoviral é removido e o NHEJ restaura a função do gene GFP. O repórter de recombinação homóloga também é baseado na construção GFP PEM one no HR.

O primeiro éxon do G FP PEM contém uma deleção de 22 pares de bases combinada com a inserção de três locais de restrição. I SCE um Hindi três I SCE E um. A exclusão garante que o GFP não possa ser reconstituído por um evento NHEJ aqui também.

Os locais I SCE One estão em orientação invertida. Portanto, a digestão I SCE one deixa extremidades incompatíveis. A primeira cópia do GFP PMM é seguida por um promotor menos um TG, menos o primeiro exon e a introdução do GFP M1. A construção intacta é GFP negativa após a indução de uma quebra de fita dupla por I sce E uma digestão.

O gene GFP funcional é reconstituído por um evento de conversão gênica entre as duas cópias mutantes do primeiro GFP PMM um éxon, outros tipos de reparo de DSB, como o cruzamento de ajoelhados de fita simples. E o NHEJ não reconstituirá o gene GFP. Já que falta a segunda cópia do gene GFP.

O primeiro códon A TG e a resolução do segundo éxon por cruzamento ou ajoelhado de fita simples não restauram a atividade da GFP. Este projeto, portanto, permite a detecção exclusiva de resolução por conversão gênica, que é a via HR predominante em células de mamíferos. Para iniciar este procedimento, use o kit endo free da Kyogen para preparar um estoque de alta qualidade de plasmídeo repórter NHEJ ou HR, linearizar 10 microgramas do plasmídeo e purificar o DNA da solução de digestão.

Consulte o protocolo escrito que acompanha os detalhes da preparação do plasmídeo. Em preparação para a transfecção. Certifique-se de que os fibroblastos humanos normais sejam mantidos nas melhores condições de cultivo.

Se começar com um frasco congelado, divida as células duas vezes antes da transfecção. Se começar a partir de uma placa de células de confluência, dividir as células uma vez crescer as células para 70 a 80% de confluência. Isso leva cerca de dois dias para cinco vezes 10 elevado à quinta células plaqueadas em uma placa de 100 milímetros.

Para melhor eficiência de transfecção, coloque as células em crescimento logarítmico. A cultura de crescimento ativo contém células no estágio M, vistas como células arredondadas presas à superfície para a colheita de transfecção, cerca de duas vezes 10 das seis células de duas placas de 100 milímetros. É fundamental não sobrecarregar a tripsina, as células param a tripsina assim que 80% das células se desprenderem da placa.

Suspenda novamente as células em solução de NHDF. Como as células são sensíveis à solução de NHDF, minimize o tempo de incubação e misture as células suavemente. Em seguida, use o efetor amaxa nucleo para transfectar as células com 0,5 microgramas de construção repórter linearizada para fibroblastos humanos normais.

Essas condições de transfecção resultam na integração de uma única cópia de uma construção repórter para a maior parte do integr 24 horas após a transfecção a um miligrama por mililitro de genética ou G quatro 18. Para selecionar as células com construções repórter cromossomicamente integradas, continue a seleção por sete a 10 dias e, em seguida, escolha colônias resistentes individuais G 4 1 8 ou agrupe os clones resistentes. Expanda a cultura para aproximadamente cinco placas de 100 milímetros.

Congele três placas para uso futuro e expanda as duas placas restantes para cinco vezes 10 elevado à quinta célula por placa de 100 milímetros. Dez placas de cem milímetros são geralmente suficientes para cinco transfectos. Dois dias após o plaqueamento, quando as células contendo a construção repórter atingiram 70 a 80% de confluência com uma mistura de cinco microgramas de plasmídeo expressor I sce one e 0,1 micrograma de plasmídeo vermelho DS.

Como controle da eficiência da transfecção, use o efetor AM maxon nucleo para transfectar cerca de duas vezes 10 das seis células de uma cultura de crescimento logaritmicamente. Como a eficiência do DSP é medida como uma proporção de glóbulos vermelhos positivos para GFP positivos, variações na mistura de ISCE um e plasmídeo vermelho DS podem afetar os resultados. A qualidade do plasmídeo também pode afetar os resultados, alterando a eficiência da transfecção.

Portanto, para obter medições consistentes, é importante usar a mesma mistura de plasmídeo em um experimento Ao mesmo tempo, prepare três controles de calibração para fatos para cada controle. Transfectar cerca de duas vezes 10 das seis células. Os três controles são cinco microgramas de plasmídeo expressando EGFP, cinco microgramas de DS, plasmídeo vermelho e cinco microgramas.

Um plasmídeo de controle que não expressa uma proteína fluorescente. Três dias após a transfecção, verificar a eficiência da transfecção e expressão das proteínas vermelhas GFP e DS por microscópio invertido fluorescente com filtros para detecção de GFP e DS. O vermelho cresce as células por mais um dia antes da análise por fax, quatro dias após a colheita da transfecção, as células I SCE uma transfectada e as células de controle. Nesta fase, é fundamental colher todas as células e ter células de formato redondo.

Para conseguir isso, use um tempo de tripsina mais longo ou uma concentração mais alta de tripsina. Examine as células ao microscópio para confirmar que 99% das células estão separadas da placa e têm uma forma redonda. Suspenda novamente as células em 500 microlitros de PBS e transfira para tubos de fax.

Mantenha as células no gelo e proteja-as da luz enquanto é possível armazená-las no gelo por algumas horas. Para obter os melhores resultados, analise as células imediatamente após a colheita. Em seguida, calibre os fatos com TFP DS RED e os controles negativos.

Ajuste a tensão e a compensação de cor para incluir todas as células fluorescentes na análise. Lembre-se de que a intensidade fluorescente das amostras experimentais é menor do que a dos controles. Depois de calibrar os fatos com os controles, analise o I SCE uma contagem de células transfectadas pelo menos 20.000 células para cada tratamento para evitar possíveis interferências entre GFP e ds.

A fluorescência vermelha mantém a porcentagem de glóbulos vermelhos positivos para GFP ou DS positivos abaixo de 25%Se a porcentagem for maior, reduza a quantidade de DS RED ou um plasmídeo. A porcentagem de células positivas para GFP corresponde à eficiência do reparo de D-N-A-D-S-P e a porcentagem de células vermelhas positivas para DS indica a eficiência da transfecção. Calcule a eficiência relativa do reparo D-N-A-D-S-P como uma proporção de células positivas para GFP para células vermelhas positivas DS.

Para determinar a precisão das liminares reparadas, resgate as construções repórter digerindo o DNA genômico com circularização da enzima eco R uma e transformação em células e coli competentes. Esse resgate é possível porque as construções originais contêm uma origem bacteriana de replicação analisada por restrição, digestão e sequenciamento. Estes são fatos típicos, resultados das transecções de controle e dos experimentos NHEJ e HR.

A intensidade fluorescente e o número de células fluorescentes são menores nas células transfectadas I SCE em comparação com os controles. A diferença no sinal de fluorescência é devido à diferença no número de cópias das construções GFP e DS RED nessas células. Cada célula no experimento contém uma cópia da construção do repórter integrado.

Assim, eventos de reparo bem-sucedidos reconstituem o gene GFP em uma fração das células. A eficiência de NHEJ e HR é calculada como uma razão entre GFP positivo e DS glóbulos vermelhos positivos. O NHEA é um processo mais eficiente do que o HR em células humanas, em fibroblastos humanos, a eficiência do NHEJ é tipicamente de 0,6 a 1,3 e a eficiência do HR é de 0,05 a 0,3.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do reparo de DNA explorarem os papéis de vários fatores no HEG e HR e estudarem a cinética e os regulamentos de NHEG e HR em células de mamíferos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a eficiência e a precisão de HR e GJ em células de mamíferos usando um ensaio fluorescente.