Estabelecendo a Monocultura Estromal 3D

Para começar, pegue um tubo de hBM-MSCs e peletize-os por centrifugação. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em volume adequado de meio basal. Em seguida, preparar tubos de centrífuga cônica de 50 mililitros contendo o volume necessário de meio basal suplementado com os respectivos fatores de crescimento.

Finalmente, adicionar as hBM-MSCs da solução estoque em uma diluição de um a 66,67 para atingir uma concentração de 1,5 vezes 10 para a quinta célula por mililitro. Remova a película adesiva de polipropileno que cobre a placa de hidrogel de 96 poços para semear a placa. Aspirar cuidadosamente o tampão de armazenamento que cobre os hidrogéis, posicionando a ponta do aspirador contra a parede do poço e movendo-se lentamente em direção à borda do poço interno.

Durante a semeadura, misture a suspensão celular periodicamente para manter a mistura homogênea e adicione 200 microlitros da suspensão celular a cada poço da placa. Em seguida, mantenha as culturas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma atmosfera umedecida. Alternativamente, use uma lavadora de placas automatizada com os bicos de aspiração ajustados a pelo menos 3,8 milímetros do suporte da placa e em direção à borda do poço e aspirar o tampão de armazenamento.

Semeando a placa misturando as células com uma pipeta sorológica e dispensando um número igual de células para o poço da placa. Monitorar o desenvolvimento das culturas por microscopia de campo claro com objetiva de cinco vezes e adquirir imagens de referência aproximadamente 30 minutos após a semeadura para avaliar o número de células adicionadas.