Para começar, prepare o equipamento ligando o respirômetro de alta resolução e conecte-o ao software de respirometria VatLab para aquisição e análise de dados. Substitua o etanol 70% na câmara oxigráfica por água bidestilada. Usando uma barra de agitação magnética, agite-a continuamente a 750 RPM na câmara.
Deixe agir por 10 minutos e depois aspirar a água. Lave a câmara três vezes com água bidestilada por cinco minutos cada. Para calibrar os sensores de oxigênio, primeiro remova a água destilada dupla e pipete dois mililitros do meio de preparação celular para a câmara.
Coloque as rolhas deixando uma bolha de troca de ar. Para registrar os valores de calibração de oxigênio, ajuste as configurações, como ganho para o sensor, tensão de polarização e intervalo de gravação de dados. Em seguida, rotule o experimento e entre no meio.
Clique no layout e selecione 01 Experimento de Calibração GR3 Temp. Agite o meio com a barra de agitação a 750 RPM por pelo menos 30 minutos a 37 graus Celsius e monitore o desempenho da membrana do sensor. Segurando o botão esquerdo do mouse e a tecla Shift, arraste o mouse para selecionar uma área onde a mudança na concentração de oxigênio é estável.
Em seguida, clique em oxigrafo e, em seguida, em Calibração de O2. Na calibração do ar, altere a marca selecionada para a região selecionada anteriormente. Em seguida, clique em calibrar e copiar para a área de transferência.
Pare a gravação e salve clicando em oxigraph. Seguido por OK Control e, em seguida, salvar e desconectar. Em seguida, para realizar a avaliação respiratória, abra a câmara e aspirar o meio em seu interior.
Carregar espermatozoides em um volume final de dois mililitros de MRM para análise de células permeabilizadas. Carregue a calibração clicando duas vezes na caixa do calibe do PDV no canto inferior e abrindo a calibração realizada anteriormente. Em seguida, pare o experimento.
Injetar 4,5 microlitros de digitonina 10 milimolar e permeabilizar as células por cinco minutos. Registrar a respiração das células intactas por pelo menos cinco minutos até que um sinal estável seja obtido. Em seguida, adicione os substratos para o complexo I ou complexo II.Meça o consumo de oxigênio até que o sinal aumente e se estabilize.
Em seguida, injetar cinco microlitros de ADP 0,5 molar e medir o consumo de oxigênio até que o sinal aumente e se estabilize. Adicione um microlitro de quatro miligramas por mililitro de oligomicina, que é um inibidor da ATP sintetase. Meça o consumo de oxigênio até que o sinal diminua e se estabilize.
Titular adicionando um microlitro de FCCP em etapas sucessivas, começando de 0,1 milimolar a um milimolar até atingir uma taxa máxima de respiração desacoplado. Meça o consumo de oxigênio até que o sinal aumente e se estabilize. Pare de injetar a droga quando o consumo de oxigênio começa a diminuir.
Finalmente, injetar um microlitro de uma rotenona milimolar para o complexo I ou cinco milimolares Antimicina A para o complexo II para discriminar entre o consumo mitocondrial e residual de oxigênio. Meça o consumo de oxigênio até que o sinal diminua e se estabilize. Para realizar a análise de dados, selecione regiões onde o fluxo de oxigênio por volume correlacionado é estável após a injeção de um substrato ou inibidor, clique em marcas, depois em janelas de estatísticas e exporte os dados.
Normalizar os dados obtidos por 1 milhão de espermatozoides e subtrair o consumo de oxigênio não mitocondrial de todos os valores. Calcule os índices usando essas equações. O registro bem-sucedido de espermatozoides intactos de uma amostra de sêmen foi obtido onde a linha azul mostrou a concentração de oxigênio e a linha vermelha representou o fluxo de oxigênio por volume correlacionado.
Contagens mais baixas de espermatozoides resultaram em menor consumo basal de oxigênio. Além disso, curvas de consumo de oxigênio especificamente para o complexo mitocondrial I ou complexo II foram obtidas usando este protocolo.