Ensaio de Membrana Basal de Cultura 3D: Cultura de Células Cancerígenas em Matriz de Proteína de Membrana Basal 3D para Estudar a Invasão Celular

Primeiro, despeje a matriz de membrana fria do porão em um prato com fundo de vidro e espalhe-a uniformemente com uma ponta de pipeta. Deixe a membrana solidificar a 37 graus Celsius, com um suprimento contínuo de dióxido de carbono. Tripsinize as células cancerígenas marcadas com fluorescência para separá-las da superfície da placa e ressuspendê-las em um meio de cultura.

Transfira essas células ressuspensas para um tubo cônico e gire. Remover o sobrenadante e ressuspender as células do meio de cultura. Após a contagem, misture esta suspensão celular contendo o número desejado de células com a matriz basal em uma proporção igual.

Coloque delicadamente a mistura de matriz celular no prato revestido com matriz de membrana basal solidificada. Deixe a mistura da matriz celular solidificar a 37 graus Celsius, com um suprimento contínuo de dióxido de carbono. Assim que a mistura solidificar, adicione meio de cultura ao prato e incube-o pelo período desejado.

As células cancerígenas podem formar saliências de membrana ricas em actina e liberar proteases para degradar a matriz extracelular, invadindo assim a matriz. Coloque o prato sob um microscópio fluorescente em diferentes intervalos de tempo para analisar as células que formam saliências. No protocolo de exemplo, cultivaremos células de câncer de mama em uma matriz de membrana basal 3D para estudar o processo de invasão.

Antes de iniciar o procedimento de cultura, coloque a matriz da membrana basal, uma pipeta P200 e as pontas da pipeta no gelo durante a noite, a 4 graus Celsius. No dia seguinte, use a ponta da pipeta gelada de 200 microlitros para espalhar 50 microlitros da matriz em um padrão espiral sobre o fundo de um prato confocal número 1 com fundo de vidro. Em seguida, coloque o prato em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono, por pelo menos 30 minutos.

Enquanto a matriz está em solidificação, tripsinize uma placa de células confluentes de 100 milímetros de 70% a 80%. Assim que as células começarem a se desprender, inative a tripsina com 10 mililitros de meio e, em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros.

Centrifugue as células por três minutos a 100 Gs e 4 graus Celsius. Enquanto as células estão girando, alíquota de 50 microlitros de matriz em um tubo de microcentrífuga de 1 mililitro por prato de matriz de membrana basal e coloque os tubos no gelo. Quando as células terminarem de girar, aspire o sobrenadante sem perturbar o pellet e, em seguida, ressuspenda as células em 1 mililitro de meio e conte-as.

Em seguida, transfira 2,5 vezes 10 para as 4ª células para um novo tubo de microcentrífuga, completando a suspensão celular com meio até um volume final de 50 microlitros. Em seguida, adicione os 50 microlitros de matriz de membrana basal gelada às células na proporção de 1:1, para um volume final de 100 microlitros. Coloque suavemente a mistura de matriz para célula na matriz da membrana basal solidificada e permita que as células sejam incorporadas na matriz na incubadora de cultura de células.

Após 30 minutos, cubra a matriz com 2 mililitros de meio e coloque o prato de volta na incubadora, trocando o meio todos os dias durante o experimento. Use a objetiva de 10x de um microscópio óptico uma vez por dia durante o experimento para obter 20 imagens de contraste de interferência diferencial da colônia suspensa na matriz da membrana basal. Analise as imagens cegamente para determinar a formação estrelada da colônia celular. Uma colônia é considerada estrelada se uma ou mais projeções do esferóide de células forem observadas.