Implante guiado por ultrassom: uma técnica para implantar células de adenocarcinoma ductal pancreático em um camundongo adulto

- O ultrassom fornece imagens de alta resolução que ajudam a implantar células cancerígenas em um local específico do tecido com inflamação mínima durante a injeção de células tumorais. Primeiramente, usamos modelos ortotópicos para enxertar células tumorais em um órgão relevante de origem tumoral. O órgão imita o microambiente tumoral original e facilita a metástase.

Comece suspendendo as células tumorais em PBS frio para manter o pH e coloque o tubo no gelo. Em seguida, coloque o mouse anestésico no estágio de ultrassom e prenda os membros com fita adesiva. Aplique a quantidade necessária de gel de ultrassom no abdômen raspado e ajuste a posição da sonda de ultrassom até que o pâncreas esteja claramente visível. Carregue a seringa com suspensão de células tumorais e injete cuidadosamente as células no pâncreas.

Uma bolha de fluido aparece na imagem do ultrassom, confirmando o implante bem-sucedido. Aguarde 5 segundos para evitar o refluxo das células e remova suavemente a agulha. Retorne o animal para uma gaiola limpa e monitore até que ele se recupere da anestesia. Poucas semanas após a injeção, as células cancerígenas injetadas no pâncreas se dividem rapidamente e formam um tumor. No protocolo a seguir, realizaremos implante guiado por ultrassom de células de adenocarcinoma ductal pancreático derivadas de murinos no pâncreas do modelo ortotópico.

- Antes de iniciar o procedimento, ressuspenda a linha celular de adenocarcinoma ductal pancreático de interesse em um volume apropriado de PBS frio estéril no gelo. Coloque as gaiolas em uma placa de aquecimento a 37 graus Celsius e limpe completamente o gabinete de segurança biológica, a câmara de indução e o estágio de ultrassom com um esterilizante apropriado. Defina a função de aquecimento do estágio de ultrassom para 37 graus Celsius e, após a indução da anestesia, aplique pomada nos olhos do primeiro animal.

Coloque o mouse em decúbito dorsal no estágio de ultrassom e prenda suavemente as extremidades superiores e inferiores ao estágio com a fita. Use um aplicador de ponta de algodão estéril para aplicar uma camada generosa de creme depilatório no quadrante superior esquerdo do abdômen sobre a região do baço até a linha média. Após 1 minuto, use uma gaze seca para remover suavemente os pelos antes de remover o excesso de creme depilatório com a gaze salina úmida. Em seguida, coloque o mouse em uma das novas gaiolas limpas no aquecedor.

Para implantação de células tumorais guiadas por ultrassom, ajuste a plataforma de ultrassom para que a superfície fique paralela ao chão e fique do lado esquerdo do animal com a cabeça do camundongo voltada para a direita. Ajuste a posição do transdutor para que uma imagem abdominal transversal seja obtida e prenda os membros do mouse à plataforma com fita adesiva. Abaixe suavemente o transdutor para entrar em contato com o abdômen do camundongo e ajuste o transdutor até que o pâncreas fique claramente visível. Localize o rim esquerdo e o baço para fornecer uma orientação precisa na cavidade abdominal.

Quando o local da injeção for localizado, carregue uma seringa de insulina de calibre 29 e meia polegada com 25 microlitros da suspensão de células tumorais e limpe a ponta da agulha com uma almofada de preparação de álcool estéril. Use uma pinça de borda romba para agarrar a pele do camundongo e a parede peritoneal para aumentar a tensão no local da injeção. Segurando a seringa em um ângulo de aproximadamente 25 a 45 graus em relação à superfície da plataforma de ultrassom, avance lentamente a agulha através da pele e da parede peritoneal. Confirme se a agulha perfurou a parede peritoneal antes de utilizar a visualização por ultrassom para guiar a agulha diretamente para o pâncreas.

Quando a agulha estiver no lugar, injete lentamente as células tumorais. A formação de um bolo de fluido dentro do pâncreas será evidente em um pâncreas injetado corretamente por ultrassom. Uma vez que o volume total da suspensão tenha sido injetado e um bolus de fluido possa ser observado por ultrassom, segure a seringa muito imóvel por vários segundos antes de retrair lentamente a agulha do abdômen do camundongo, tomando cuidado para não perturbar as células injetadas. Em seguida, coloque o mouse em uma nova gaiola limpa no aquecedor com monitoramento até a recuperação total.

- A colocação adequada da agulha no pâncreas, incluindo profundidade e ângulo da agulha, é uma etapa crítica neste protocolo. A visualização do bolus de fluido ajuda a confirmar uma injeção tumoral bem-sucedida. Controlar a profundidade da injeção é o aspecto mais difícil. Meu conselho é praticar com injeções de azul de tripano e confirmar o bolus de fluido por ultrassom e necropsia.