Como gravar, Cultura e estimular redes neuronais em Micro-Arrays eletrodo (MEA)

O objetivo geral deste procedimento é cultivar, registrar e estimular redes neuronais em matrizes de microeletrodos. Isso é feito primeiro preparando reagentes e matrizes de microeletrodos para cultura. A segunda etapa do procedimento é dissociar os neurônios corticais de um embrião de rato do dia 18.

A terceira etapa do procedimento é colocar neurônios em matrizes de microeletrodos e cultura por duas a três semanas. A etapa final do procedimento é experimentar as redes neuronais por meio de estimulação e gravação das matrizes de microeletrodos. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram atividade espontânea e evocada por estímulo em redes neuronais com software de gravação e estimulação por meio de cultura celular meticulosa em matrizes de microeletrodos.

Olá, sou o professor Steve Potter. Sou o diretor do Laboratório de Neuroengenharia do Departamento de Cultura de Engenharia Biomédica da Georgia Tech. Esse departamento é compartilhado com a Escola de Medicina da Universidade Emory.

E eu sou Chad Hales, um pós-doutorado no laboratório do Dr. Potter. Também sou bolsista cognitivo-comportamental no Departamento de Neurologia da Escola de Medicina da Universidade Emory. Hoje vamos mostrar como cultivar e cuidar de neurônios em matrizes de vários eletrodos.

Como estes. Nós os usamos para estudar o aprendizado e a memória in vitro e o processamento de informações em rede. Então vamos começar Em uma capela de fluxo laminar, comece a preparar o micro feixe de eletrodos de sistemas multicanal ou a pipeta MEA de 100 microlitros de amina de polietileno no centro de um MEA limpo e estéril descansando em uma placa de Petri de 100 milímetros para evitar danificar os eletrodos.

Nunca toque em objetos sólidos na superfície MEA. Cubra levemente o prato com uma tampa estéril equipada com uma membrana de Teflon permeável a gás e incube no capô por 30 minutos. A tampa da membrana de Teflon proporciona troca gasosa com evaporação mínima e a capacidade de cultura em ambientes de menor umidade.

A umidade mais baixa permite o uso de eletrônicos delicados na incubadora e reduz as taxas de contaminação. Aspire o PEI e enxágue o MEA três vezes com um a dois mililitros de água deionizada estéril. Deixe-os secar com a tampa aberta no capô por pelo menos 30 minutos ou até que estejam completamente secos.

Complete uma dissociação de neurônios corticais E 18 conforme descrito na parte de texto deste protocolo. Coe as células após coar. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros e leve o volume da suspensão celular para quatro mililitros com meio celular com cuidado.

Coloque 500 microlitros de uma solução de 5% BSA sob a centrífuga de suspensão celular a 200 Gs por seis minutos. Enquanto as células estão girando, verifique se o MEA está completamente seco. Pipete cuidadosamente 20 microlitros de solução laminada no centro do MEA.

Evite introduzir bolhas de ar e certifique-se de que todos os eletrodos estejam cobertos. Coloque suavemente a tampa de Teflon no MEA para evitar a evaporação da laminina. O MEA deve estar em uma superfície completamente plana quando a tampa for colocada.

Caso contrário, a pressão pode rachar o fundo de vidro da matriz. Incube o prato a 35 a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, 9% de oxigênio e 65% de umidade por 20 minutos. Agora transfira as células giradas para o capô.

Um pellet celular deve ser visível no fundo do tubo. Retirar e reservar o sobrenadante em caso de peletização incompleta. Ressuspenda suavemente o pellet.

Conte o número de células em 10 microlitros da suspensão em um hemocitômetro e dilua a suspensão até a concentração desejada. Normalmente 1000 a 3000 células por microlitro com meio celular. Quando a incubação laminada da matriz estiver concluída, aspire a gota imediatamente.

Pipete 15 a 20 microlitros da suspensão celular sobre a área revestida com laminado do MEA. Cubra o prato com a tampa de Teflon e coloque na incubadora por 30 minutos. Sob um microscópio de contraste de fase, inspecione o prato para garantir que as células tenham aderido e cubra todos os eletrodos.

Se a cobertura estiver incompleta, adicione mais células e reincube. Inunde lentamente o prato com um mililitro de meio celular equilibrado aquecido. Recoloque a tampa de Teflon e coloque o prato de volta na incubadora por 24 horas.

No dia seguinte. Sob o microscópio de contraste de fase, verifique se as células cultivadas estão aderidas e se a quantidade de detritos e morte celular é limitada com os devidos cuidados e alimentação. Conforme explicado no texto anexo, os neurônios cultivados dessa maneira podem sobreviver por mais de um ano.

Após duas a três semanas, as culturas atingiram um estado estável de atividade e podem ser gravadas a partir deste vídeo agora demonstrará a gravação com o programa neuro writer personalizado. Transfira o prato para a incubadora de gravação novamente mantida a 35 a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, 9% de oxigênio e 65% de umidade. Para manter a temperatura e o pH ideais, ao movimentar o prato, leve-o paralelo ao solo e evite movimentos rápidos que possam desalojar as células do substrato.

Levante o MEA do prato e coloque-o nos sistemas multicanais. Gravação pré-emamplifier, certificando-se de combinar corretamente o aterramento interno com o Preem ampterra do amplificador. O pré-amplificador está sentado em um dispositivo de pele, que funciona para dissipar o calor conforme descrito no texto que acompanha aqui, o pré-amplificador foi removido da incubadora.

Melhor mostrar o assento adequado do prato. Use um pano umedecido com etanol 70% para limpar os contatos ao redor do perímetro da matriz. Certifique-se de que o MEA esteja encaixado corretamente, abaixe e trave a tampa.

Use um cotonete para alinhar os contatos da matriz, se necessário. No neuro writer, escolha as configurações apropriadas para o experimento. O interruptor de gravação deve ser acionado para cima.

Para gravar os dados em um arquivo, clique no botão Iniciar para iniciar a gravação. A tela de pico agora mostrará traços de atividade e ruído de fundo com potenciais de ação ocasionais e explosões de atividade. Se um eletrodo exibir muito ruído, pode haver um pino desalinhado na tampa do pré-amplificador, um pequeno pedaço de lixo, uma gota de meio, uma superfície de eletrodo degradada ou uma membrana transparente sobreposta da tampa interrompendo o contato.

Verifique o pino de contato e ajuste com um cotonete embebido em etanol 70%, se necessário. Clique na guia forma de onda de pico para alterar a visualização da tela para o modo de detecção de pico, onde os potenciais de ação são exibidos em janelas estáticas de três milissegundos. Para estimular a rede neuronal no MEA, treine o algoritmo salpa na guia de configurações de gravação para limitar o artefato de estimulação, ative salpa na guia de configurações online.

Assim que a gravação for iniciada, clique na guia STEM para configurar um paradigma de estimulação apropriado para usar o programa de malha aberta para estimular um eletrodo e observar as respostas no prato. Escolha as configurações apropriadas na seção de malha aberta e pressione iniciar. Visualize as respostas na guia principal de picos e na guia de formas de onda de pico.

Este filme retrata o desenvolvimento in vitro de neurônios e células gliais do sétimo dia à medida que crescem e formam uma rede conectada em um MEA para microeletrodos são visíveis. Este é um gráfico raster de dois minutos de atividade espontânea de uma rede neuronal. Cada ponto preto representa um potencial de ação.

Duas rajadas de atividade são indicadas com as setas azuis. A resposta em vários eletrodos é uma função da conectividade de rede. Aqui está um gráfico raster de 16 segundos de atividade evocada por estímulo.

Estrelas vermelhas representam estímulos. As setas vermelhas mostram cinco estímulos que induziram com sucesso explosões de atividade sináptica em vários eletrodos. Ocasionalmente, um estímulo não produz uma explosão.

Aqui na seta azul, acabamos de mostrar como cultivar e estimular redes neuronais em matrizes de micro eletrodos. Provavelmente, a preocupação mais importante é evitar que as culturas sejam infectadas e reduzir a evaporação. Se usadas tampas com membranas semipermeáveis como esta, elas são seladas e evitam a evaporação e a infecção, e você pode cultivar as culturas por meses, talvez até mais de um ano.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.