Name: Como gravar, Cultura e estimular redes neuronais em Micro-Arrays eletrodo (MEA) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprenda a cultivar, gravar e estimular redes neuronais em microarrays de eletrodos usando neurônios corticais de embriões de ratos. Este método permite estudar atividade de rede e plasticidade sináptica in vitro por períodos prolongados.

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Gostaríamos de agradecer aos membros do grupo Potter para fornecer observações inestimáveis ​​sobre o protocolo. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de investigação clínica de treinamento da Academia Americana de Neurologia da Fundação para CMH, uma bolsa de estudos do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS; <a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a> ) para JDR (GM08169 ), uma concessão do National Institute of NIH Distúrbios Neurológicos e Derrame (NS054809), uma Ruth L. Kirschstein Prêmio Nacional de Serviço de Pesquisa de JDR (NS060392), um NSF Efri subvenção (0.836.017), a Fundação Coulter Prêmio de Pesquisa Translacional, e um bolsa de pesquisa translacional para JDR (NS007480).

<ol><li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li>
<li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+thick+brain+slices%3A+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E+Stat+Nonlin+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li>
<li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Neural+Syst+Rehabil+Eng%22%5BJournal%5D)">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li>
<li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li>
<li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays%3A+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li>
<li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+%281-42%29+peptide+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li>
<li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li>
<li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density%3A+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li>
<li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li>
<li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Microsc+Suppl%22%5BJournal%5D)">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li>
<li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays%2C+with+real-time+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li>
<li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. , 2nd ed, MIT Press. Cambridge, Mass. (1998).</li>
</ol>

CMH não tem nada a revelar.<br /&gt; JDR e SMP são pagos consultores para Axion Biosystems.<br /&gt; As taxas de envio e taxas de processamento de vídeo para este artigo e vídeo foram gentilmente patrocinado pela Multi-Channel Systems.

Este protocolo apresenta instruções sobre como a cultura e manter redes neuronais em micro-eletrodo de matrizes, bem como uma introdução para a gravação de redes neuronais e estimulante. Alguns dos problemas mais comuns durante a gravação de MEAs também foram discutidos na seção de solução MEA. Existem variações ocasionais no protocolo como discutido ao longo e muitas vezes essas mudanças são utilizados para otimizar as condições específicas exigidas por alguns projetos experimentais. Embora o sistema de gravação e estimular aqui apresentada é composta por nossa personalizados NeuroRighter 15 com o pré-amplificador MCS, existem vários outros sistemas que podem fornecer uma interface com as redes neuronais. Escolher uma configuração particular dependerá das necessidades específicas experimental. Gravação simplista e exemplos de estimulação foram fornecidas neste protocolo no entanto essas culturas em MEAs pode ser usado para fornecer informações sobre questões complexas sobre a atividade sináptica e conectividade de rede neuronal. Como mencionado acima, o trabalho em curso está utilizando esta tecnologia para estudar processos como plasticidade celular, excitotoxicidade, desenvolvimento e neurodegeneração. 60-10 Por exemplo, uma publicação recente de nosso laboratório mostraram reprodutíveis objetivo dirigido aprendizagem in vitro com real-tempo de estimulação de malha fechada em resposta à atividade neuronal rede atual 3. Embora a cultura MEA são muitas vezes finicky e delicado, graças à sua simplicidade e acessibilidade (em comparação com animais intactos), eles oferecem um modelo poderoso para estudar a atividade neuronal em um nível de rede.

Abastecimento <ul><li> Descartáveis ​​garrafa superior do filtro (150ml, tamanho dos poros 0,2 Hm; Nalgene # 565-0020) </li><li> Dia embrionário 18 ratos timed-fêmea grávida </li><li> Matrizes de microeletrodos (ver descrição no protocolo, B1) </li><li> Microeletrodo tampas array (ver descrição no protocolo, B3) </li><li> Nylon célula filtro (40μm, BD Falcon, # 352340) </li><li> Polipropileno cônico frascos (estéril, 15ml) </li><li> Placas de Petri de poliestireno (estéril, de 35mm e 100x15mm) </li><li> Pontas de pipeta (estéril, 20μl, 200μl e 1000μl) </li><li> Pipetas sorológicas (5ml) </li></ul> Equipamento: <ul><li> Biológicos de segurança capela de fluxo gabinete / laminar </li><li> Contador de células </li><li> Centrifugador </li><li> Recipiente de gelo </li><li> Tesouras de dissecação e pinça (esterilizada) </li><li> Dissecando microscópio em uma capela de fluxo laminar </li><li> Handheld elétrica Pipetman </li><li> Hemocitômetro </li><li> Isofluorano e câmaras de gás </li><li> Microscópio de luz </li><li> Handheld Pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) </li><li> MEA sistema de gravação (ver descrição no protocolo, D1) </li><li> Guilhotina roedores </li><li> Tri-gás incubadora (ver descrição no protocolo, B15) </li><li> Balão de vácuo, com aspirador ligado na capa </li><li> Vórtice </li><li> Banho-maria (35-37 ° C) </li></ul> Soluções e Reagentes: Solução BSA: Faça BSA 5% (Sigma A-9418) em tampão fosfato salina pH 7,4 e filtrado a 0,2 Hm. Esta solução pode ser preparado com antecedência e armazenado a 4 ° C durante vários meses. Médio célula: Combine 90 meio modificado ml Dulbecco Águia (Irvine Scientific 9024), 10 ml soro de cavalo (Gibco 16.050), piruvato de sódio 1 ml (100mM, Gibco 11.360), 250 Glutamax mL (Gibco 35.050) e insulina (concentração final 2,5 mg / ml, Sigma I-5500), em seguida, passar por um 0,2 mM Quente filter.22 e equilibrar o meio de células na incubadora antes de usar. Solução de dissecção para a preparação de solução papaína: 23 <table border="1"><tr><td> Solução de dissecção (100ml estoque) </td><td> Combine em ordem, 0,22 mM filtrar e armazenar a 4 ° C. </td><td></td></tr><tr><td> Componente </td><td> Ml de volume </td><td> Concentração Final (mM) </td></tr><tr><td> Água bidestilada </td><td> 91,175 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 0,58 </td><td> 5,8 mM </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> 0,025 </td><td> 0,25 mM </td></tr><tr><td> HEPES 0,5 M </td><td> 0,32 </td><td> 1,6 mM </td></tr><tr><td> 0,5% de vermelho de fenol </td><td> 0,2 </td><td> (0,001%) </td></tr><tr><td> NaOH 0,1 N </td><td> 0,2 </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> 2 M Na2SO4 </td><td> 4,5 </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> 1 M K2SO4 </td><td> 3,0 </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> 0,1 M ácido cinurênico </td><td> 1,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> 5 mM APV </td><td> 1,0 </td><td> 0,05 mM </td></tr></table> Esta solução pode ser preparado com antecedência e armazenado a 4 ° C durante vários meses. DNAse I: Invitrogen (# 18047019). 50μl alíquotas são de flash congeladas e armazenadas a -80 ° C. Uma alíquota é descongelado no capela de fluxo laminar antes de iniciar o processo de dissociação das células. Solução salina balanceada de Hank: Sigma (# 4891). Uma solução de 1X é preparada em água deionizada estéril, filtrada em 0,2 Hm e armazenados a 4 ° C. Solução Hibernate: Prepare no dia da cultura. Combine 98 ml de meio L-15 (Invitrogen 11415), com 2 ml suplemento B-27 (50X, Invitrogen # 17504) e filtro de 0,2 mm. Solução laminina: Prepare no dia da cultura. Diluir 20μl de laminina (1mg/ml, Sigma L-2020) em 980 mL meio de células para uma concentração final de 0.02mg/ml. 20 alíquotas mL da laminina (1mg/ml) são armazenadas a -80 ° C e descongeladas imediatamente antes de usar. Descongelamento deve ocorrer na bancada e não no banho de água como o rápido degelo pode levar a gelificação da laminina. Papaína solução: 23 10 ml de solução quente dissecção (acima) para 30-32 ° C. Adicionar 200 unidades papaína (Sigma P-4762) e 1,6 mg L-cisteína (Sigma C-7880). Ajustar o pH para 7,4 com cerca de 14 mL de 0,1 N NaOH. Incubar por cerca de 30 minutos até que o cl soluçãoorelhas, filtro de 0,2 mm, flash freeze com nitrogênio líquido, em alíquotas de 2 ml em 15 ml de polipropileno estéril frascos cônicos e armazenar a -80 ° C. Descongelar uma alíquota a 35-37 ° C antes de iniciar o protocolo. Polietilenoimina solução (PEI): 13 100 ul de PEI (50% w / v, Sigma P-3143) é diluído em 100 ml tampão borato de sódio (0,1 M pH 8,4, Sigma B-9876) para uma concentração final de 0,05% w / v. Filtro estéril de 0,2 mm. Isto pode ser preparado com antecedência e armazenado a 4 ° C durante meses. Água deionizada estéril: Autoclave e deixar arrefecer à temperatura ambiente antes de usar. Tripsina (0,25% com EDTA, Gibco 25200): Alíquotas de 1ml de flash são congeladas e armazenadas a -80 ° C. Alíquotas são descongelados em banho-maria a 35-37 ° C antes do uso.

como gravar, cultura e estimular redes neuronais em micro-arrays eletrodo (mea)

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

Para o século passado, muitos neurocientistas de todo o mundo têm dedicado suas vidas para entender como as redes neuronais funcionam e por que parar de trabalhar em várias doenças. Estudos incluíram observação neuropatológicos, microscopia fluorescente com rotulagem genética, e gravação intracelular em ambos os neurônios dissociados e preparações fatia. Este protocolo discute outra tecnologia, que envolve o crescimento neuronal em culturas dissociadas micro-eletrodo arrays (também chamado de multi-eletrodo arrays, AAM). Há múltiplas vantagens de usar este sistema através de outras tecnologias. Dissociada culturas neuronal em MEAs fornecer um modelo simplificado em que a atividade de rede podem ser manipulados com sequências de estimulação elétrica através de eletrodos múltiplos da matriz. Porque a rede é pequena, o impacto da estimulação é limitada a áreas observáveis, o que não é o caso de preparações intactas. As células crescem em uma monocamada fazer alterações na morfologia fácil de monitorar, com várias técnicas de imagem. Finalmente, as culturas em MEAs pode sobreviver por mais de um ano in vitro que remove todas as limitações inerentes de tempo claro com as técnicas de cultivo outras 1. Nosso laboratório e outros em todo o mundo estão utilizando esta tecnologia para fazer perguntas importantes sobre redes neuronais. O objectivo deste protocolo é fornecer as informações necessárias para a criação, cuidando, e gravação de estimular eletricamente as culturas em MEAs. Em redes vitro fornecer um meio para pedir fisiologicamente questões relevantes na rede e níveis celulares levando a uma melhor compreensão da função cerebral e disfunção.

Este protocolo fornece as informações necessárias para a criação, cuidando, e gravação de estimular eletricamente as culturas na AAM.<em&gt; In vitro</em&gt; Redes de fornecer um meio para pedir fisiologicamente questões relevantes na rede e níveis celulares levando a uma melhor compreensão da função cerebral e disfunção.

Como gravar, Cultura e estimular redes neuronais em Micro-Arrays eletrodo (MEA)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

O objetivo geral deste procedimento é cultivar, registrar e estimular redes neuronais em matrizes de microeletrodos. Isso é feito primeiro preparando reagentes e matrizes de microeletrodos para cultura. A segunda etapa do procedimento é dissociar os neurônios corticais de um embrião de rato do dia 18.A terceira etapa do procedimento é colocar neurônios em matrizes de microeletrodos e cultura por duas a três semanas. A etapa final do procedimento é experimentar as redes neuronais por meio de estimulação e gravação das matrizes de microeletrodos. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram atividade espontânea e evocada por estímulo em redes neuronais com software de gravação e estimulação por meio de cultura celular meticulosa em matrizes de microeletrodos.Olá, sou o professor Steve Potter. Sou o diretor do Laboratório de Neuroengenharia do Departamento de Cultura de Engenharia Biomédica da Georgia Tech. Esse departamento é compartilhado com a Escola de Medicina da Universidade Emory.E eu sou Chad Hales, um pós-doutorado no laboratório do Dr. Potter. Também sou bolsista cognitivo-comportamental no Departamento de Neurologia da Escola de Medicina da Universidade Emory. Hoje vamos mostrar como cultivar e cuidar de neurônios em matrizes de vários eletrodos.Como estes. Nós os usamos para estudar o aprendizado e a memória in vitro e o processamento de informações em rede. Então vamos começar Em uma capela de fluxo laminar, comece a preparar o micro feixe de eletrodos de sistemas multicanal ou a pipeta MEA de 100 microlitros de amina de polietileno no centro de um MEA limpo e estéril descansando em uma placa de Petri de 100 milímetros para evitar danificar os eletrodos.Nunca toque em objetos sólidos na superfície MEA. Cubra levemente o prato com uma tampa estéril equipada com uma membrana de Teflon permeável a gás e incube no capô por 30 minutos. A tampa da membrana de Teflon proporciona troca gasosa com evaporação mínima e a capacidade de cultura em ambientes de menor umidade.A umidade mais baixa permite o uso de eletrônicos delicados na incubadora e reduz as taxas de contaminação. Aspire o PEI e enxágue o MEA três vezes com um a dois mililitros de água deionizada estéril. Deixe-os secar com a tampa aberta no capô por pelo menos 30 minutos ou até que estejam completamente secos.Complete uma dissociação de neurônios corticais E 18 conforme descrito na parte de texto deste protocolo. Coe as células após coar. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros e leve o volume da suspensão celular para quatro mililitros com meio celular com cuidado.Coloque 500 microlitros de uma solução de 5% BSA sob a centrífuga de suspensão celular a 200 Gs por seis minutos. Enquanto as células estão girando, verifique se o MEA está completamente seco. Pipete cuidadosamente 20 microlitros de solução laminada no centro do MEA.Evite introduzir bolhas de ar e certifique-se de que todos os eletrodos estejam cobertos. Coloque suavemente a tampa de Teflon no MEA para evitar a evaporação da laminina. O MEA deve estar em uma superfície completamente plana quando a tampa for colocada.Caso contrário, a pressão pode rachar o fundo de vidro da matriz. Incube o prato a 35 a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, 9% de oxigênio e 65% de umidade por 20 minutos. Agora transfira as células giradas para o capô.Um pellet celular deve ser visível no fundo do tubo. Retirar e reservar o sobrenadante em caso de peletização incompleta. Ressuspenda suavemente o pellet.Conte o número de células em 10 microlitros da suspensão em um hemocitômetro e dilua a suspensão até a concentração desejada. Normalmente 1000 a 3000 células por microlitro com meio celular. Quando a incubação laminada da matriz estiver concluída, aspire a gota imediatamente.Pipete 15 a 20 microlitros da suspensão celular sobre a área revestida com laminado do MEA. Cubra o prato com a tampa de Teflon e coloque na incubadora por 30 minutos. Sob um microscópio de contraste de fase, inspecione o prato para garantir que as células tenham aderido e cubra todos os eletrodos.Se a cobertura estiver incompleta, adicione mais células e reincube. Inunde lentamente o prato com um mililitro de meio celular equilibrado aquecido. Recoloque a tampa de Teflon e coloque o prato de volta na incubadora por 24 horas.No dia seguinte. Sob o microscópio de contraste de fase, verifique se as células cultivadas estão aderidas e se a quantidade de detritos e morte celular é limitada com os devidos cuidados e alimentação. Conforme explicado no texto anexo, os neurônios cultivados dessa maneira podem sobreviver por mais de um ano.Após duas a três semanas, as culturas atingiram um estado estável de atividade e podem ser gravadas a partir deste vídeo agora demonstrará a gravação com o programa neuro writer personalizado. Transfira o prato para a incubadora de gravação novamente mantida a 35 a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, 9% de oxigênio e 65% de umidade. Para manter a temperatura e o pH ideais, ao movimentar o prato, leve-o paralelo ao solo e evite movimentos rápidos que possam desalojar as células do substrato.Levante o MEA do prato e coloque-o nos sistemas multicanais. Gravação pré-emamplifier, certificando-se de combinar corretamente o aterramento interno com o Preem ampterra do amplificador. O pré-amplificador está sentado em um dispositivo de pele, que funciona para dissipar o calor conforme descrito no texto que acompanha aqui, o pré-amplificador foi removido da incubadora.Melhor mostrar o assento adequado do prato. Use um pano umedecido com etanol 70% para limpar os contatos ao redor do perímetro da matriz. Certifique-se de que o MEA esteja encaixado corretamente, abaixe e trave a tampa.Use um cotonete para alinhar os contatos da matriz, se necessário. No neuro writer, escolha as configurações apropriadas para o experimento. O interruptor de gravação deve ser acionado para cima.Para gravar os dados em um arquivo, clique no botão Iniciar para iniciar a gravação. A tela de pico agora mostrará traços de atividade e ruído de fundo com potenciais de ação ocasionais e explosões de atividade. Se um eletrodo exibir muito ruído, pode haver um pino desalinhado na tampa do pré-amplificador, um pequeno pedaço de lixo, uma gota de meio, uma superfície de eletrodo degradada ou uma membrana transparente sobreposta da tampa interrompendo o contato.Verifique o pino de contato e ajuste com um cotonete embebido em etanol 70%, se necessário. Clique na guia forma de onda de pico para alterar a visualização da tela para o modo de detecção de pico, onde os potenciais de ação são exibidos em janelas estáticas de três milissegundos. Para estimular a rede neuronal no MEA, treine o algoritmo salpa na guia de configurações de gravação para limitar o artefato de estimulação, ative salpa na guia de configurações online.Assim que a gravação for iniciada, clique na guia STEM para configurar um paradigma de estimulação apropriado para usar o programa de malha aberta para estimular um eletrodo e observar as respostas no prato. Escolha as configurações apropriadas na seção de malha aberta e pressione iniciar. Visualize as respostas na guia principal de picos e na guia de formas de onda de pico.Este filme retrata o desenvolvimento in vitro de neurônios e células gliais do sétimo dia à medida que crescem e formam uma rede conectada em um MEA para microeletrodos são visíveis. Este é um gráfico raster de dois minutos de atividade espontânea de uma rede neuronal. Cada ponto preto representa um potencial de ação.Duas rajadas de atividade são indicadas com as setas azuis. A resposta em vários eletrodos é uma função da conectividade de rede. Aqui está um gráfico raster de 16 segundos de atividade evocada por estímulo.Estrelas vermelhas representam estímulos. As setas vermelhas mostram cinco estímulos que induziram com sucesso explosões de atividade sináptica em vários eletrodos. Ocasionalmente, um estímulo não produz uma explosão.Aqui na seta azul, acabamos de mostrar como cultivar e estimular redes neuronais em matrizes de micro eletrodos. Provavelmente, a preocupação mais importante é evitar que as culturas sejam infectadas e reduzir a evaporação. Se usadas tampas com membranas semipermeáveis como esta, elas são seladas e evitam a evaporação e a infecção, e você pode cultivar as culturas por meses, talvez até mais de um ano.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A forma robusta para estudar avalanches neuronal, ou seja, escala-invariante rajadas espaço-temporal atividade, indicativo da dinâmica do estado crítico no córtex. Avalanches surgem espontaneamente no desenvolvimento de camadas superficiais do córtex cultura que permite medições a longo prazo da atividade com arrays planar integrada multi-eletrodo (MEA), sob condições estritamente controladas.

Multieletrodos Recordings Array of Avalanches Neuronal em culturas organotípicas

Este vídeo demonstra o desenvolvimento de uma cultura neuronal 3D acoplada a uma matriz de microeletrodos planares com neurônios do hipocampo. Os neurônios isolados formam uma rede 2D na área ativa do conjunto de microeletrodos e aderem a microesferas de vidro em uma placa de vários poços com uma inserção de membrana. Ao transferir essas microesferas revestidas de neurônios para o eletrodo, elas se organizam em uma rede neural 3D interconectada.

Construindo redes neuronais tridimensionais acopladas a matrizes de microeletrodos

O vídeo demonstra como usar um arranjo de microeletrodos (MEA) para registrar a atividade eletrofisiológica de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). A atividade eletrofisiológica de um MEA multipoço contendo uma co-cultura neurônio-astrócitos é registrada para detectar potenciais de ação de vários neurônios na rede, confirmando a diferenciação bem-sucedida de hiPSCs em neurônios.

Medindo a atividade eletrofisiológica de redes neuronais usando matrizes de microeletrodos

Este vídeo demonstra o registro da atividade neural espontânea e dependente de estimulação de culturas primárias de neurônios ganglionares espirais murinos (SGN) em uma matriz de múltiplos eletrodos (MEA). Envolve lavar e preparar o MEA, registrar a atividade neural espontânea e aplicar estímulos elétricos controlados para identificar a atividade neuronal dependente de estimulação.

Analisando a atividade neural em neurônios ganglionares espirais murinos primários usando matrizes de multieletrodos

Este vídeo apresenta gravações eletrofisiológicas de co-culturas organotípicas de fatias da medula espinhal, capturadas usando uma matriz de múltiplos eletrodos ou dispositivo MEA. Essas gravações avaliam a regeneração neuronal entre as fatias. A atividade elétrica sincronizada observada confirma a regeneração neural bem-sucedida.

Registros eletrofisiológicos para avaliação de regenerações neuronais em fatias de medula espinhal co-cultivadas

Este vídeo demonstra o procedimento de uso da matriz de multieletrodos (MEA) para medir a fisiologia sináptica em esferas de cocultura 3D. Este método permite entender a dinâmica da rede neural e a atividade de explosão da rede sináptica dentro das esferas 3D.

Utilizando matrizes de multieletrodos para medir a fisiologia sináptica em esferas de cocultura 3D

Este vídeo demonstra o estabelecimento de uma co-cultura neurônio-astrócitos para registrar a atividade da rede neuronal. Ao estabelecer a co-cultura de neurônios motores e astrócitos em uma placa multi-electrode array (MEA), a atividade elétrica rítmica síncrona da rede neuronal foi registrada extracelularmente usando o MEA.

Registro da Atividade Eletrofisiológica da Rede Neuronal em uma Co-cultura Neurônio-Astrócito

Neste trabalho, um novo modelo experimental no qual culturas neuronais 3D são acopladas a matrizes planares de microeletrodos (MEAs) é presented. 3D redes são construídas semeando neurônios em um andaime composto de microesferas de vidro nas quais os neurônios crescem e formam estruturas 3D interconectadas.

Interface 3D Engineered culturas neuronais para Micro-Arrays eletrodo: An Innovative<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Apresentamos um protocolo para cultivar explantes primários de neurônios do gânglio espiral murino em matrizes de múltiplos eletrodos para estudar perfis de resposta neuronal e otimizar parâmetros de estimulação. Tais estudos visam melhorar a interface neurônio-eletrodo do implante coclear para beneficiar a audição dos pacientes, bem como o consumo de energia do dispositivo.

Do gânglio espiral Neuron Explant Cultura e Eletrofisiologia em multi-eléctrodos Arrays

Células neuronais de rato cultivadas em matrizes de múltiplos eléctrodos apresentam um aumento na resposta após estimulação eléctrica. Este protocolo demonstra como cultivar neurônios, como registrar a atividade, e como estabelecer um protocolo para treinar as redes para responder a padrões de estimulação.

Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

Este protocolo visa demonstrar como combinar em vitro matrizes de microeletrodos com dispositivos microfluídicos para estudar a transmissão do potencial de ação em culturas neuronal. Análise de dados, ou seja, a detecção e caracterização de potenciais de ação, de propagação é realizada utilizando um novo avançado, ainda amigável e livremente disponível, ferramenta computacional.

Microfluídica interfaceamento com matrizes de microeletrodos para estudar comunicação Neuronal e propagação de sinal Axonal

Aprenda a cultivar, gravar e estimular redes neuronais em microarrays de eletrodos usando neurônios corticais de embriões de ratos. Este método permite estudar atividade de rede e plasticidade sináptica in vitro por períodos prolongados.

Como gravar, Cultura e estimular redes neuronais em Micro-Arrays eletrodo (MEA)

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