Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

Meu nome é Gail Siebel e sou pesquisadora pós-doutoranda no laboratório da Dra. Veronica Alvarez no Instituto Nacional sobre Abuso de Álcool e Alcoolismo. Este trabalho foi realizado em colaboração com o Dr. Kathleen Grant e Andrew Wow, no Centro de Primatas do Oregon, e com o Dr. James Dene, na Universidade Wake Forest, que forneceram o tecido de primatas não humanos utilizado neste estudo. O objetivo principal deste procedimento é introduzir corantes fluorescentes em neurônios e rotular seções cerebrais de diferentes espécies, como roedores e primatas, de qualquer idade.

Para o estudo da morfologia de dendritos e espinhos dendríticos, isso é realizado primeiramente revestindo Ts e microesferas com um corante lipofílico, como o D eye. O segundo passo do procedimento consiste em forrar tubos com microesferas revestidas com D eye e cortá-los em pequenos pedaços, que servem como projéteis para o sistema de canhão de genes Helios. O terceiro passo do procedimento é disparar microesferas revestidas com D eye em fatias de cérebro utilizando o canhão de genes.

O passo final do procedimento é opcional, pois a estilística pode ser combinada com imunomarcação para localizar simultaneamente outros marcadores. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram marcação fluorescente esparsa de neurônios, adequada para imagens de alta resolução, como microscopia confocal ou de dois fótons, e para o estudo da ramificação dendrítica e da morfologia dos espinhos dendríticos. A principal vantagem desta técnica em relação aos nossos métodos existentes é que a estilística pode ser aplicada a cortes cerebrais de animais de todas as espécies, idades e genótipos.

Pode ser usado em combinação com imunomarcação e produz uma marcação fluorescente esparsa adequada para microscopia de alta resolução. Antes de preparar os projéteis, recubra as microesferas de tungstênio com corante lipofílico em uma cabine de exaustão química utilizando 450 mililitros de cloreto de metileno para 13,5 miligramas de corante lipofílico dye eye, obtendo uma concentração final de 30 miligramas por mililitro. Pegue um tubo pré-Eloqua contendo 300 miligramas de microesferas de tungstênio e adicione 300 microlitros de cloreto de metileno; agite vigorosamente para ressuspender as microesferas e obter uma solução homogênea.

Somente 100 miligramas de microesferas de tungstênio são utilizados por conjunto de balas, pipetando para cima e para baixo para manter as microesferas em suspensão, adicione 100 mililitros das microesferas e o corante dissolvido sobre uma lâmina de vidro e misture-os completamente. Com a ponta de uma pipeta, deixe secar ao ar completamente até que as microesferas fiquem cinza-claras. Coloque um pedaço limpo de papel branco encerado sob a lâmina, utilizando uma lâmina limpa; para cada cor de balas, raspe as microesferas da lâmina de vidro e triture-as em um pó fino.

Retire as microesferas revestidas para um papel de soro e transfira-as com auxílio de funil para um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione três mililitros de água e sonique em banho de água por 10 a 30 minutos à temperatura ambiente para interromper completamente quaisquer agregados. Corte 0,7 metros de tubo turquesa com um ângulo em uma das extremidades e conecte a outra extremidade a uma seringa de 12 mililitros utilizando um adaptador de tubo, coloque a extremidade livre em um tubo contendo 10 mililitros de uma solução de polivinil perone ou PVP a 10 miligramas por mililitro e aspire a solução completamente através do tubo e para dentro da seringa.

Vortexe a solução de perlas enquanto bombeia com a seringa para obter uma mistura homogênea, trabalhando rapidamente para evitar a precipitação das perlas; aspire completamente a solução para dentro do tubo. Evite introduzir bolhas de ar, pois elas impedirão a adesão das perlas ao tubo naquele ponto, mantendo o tubo esticado por ambas as extremidades. Incline-o de um lado para o outro uniformemente.

Distribua as microesferas. Introduza o tubo na estação de preparo e deixe as microesferas sedimentarem por 30 a 60 segundos. Use a seringa para empurrar lentamente, mas de forma contínua.

Remova a água, deixando as esferas para trás. Desconecte imediatamente a seringa e comece a girar o tubo. Ajuste o fluxo de nitrogênio na estação de preparo para quatro a cinco LPM secos durante 10 a 20 minutos, até que gotículas de água não sejam mais visíveis.

Remova o tubo da estação de preparo, corte projéteis em comprimentos de 13 milímetros com o cortador de tubos observado e, nos bons projéteis, haverá uma leve névoa cinza revestindo uniformemente o interior. Coloque os projéteis em frascos de cintilação envoltos em folha de alumínio contendo um agente secante, como sulfato de cálcio anidro. Armazene à temperatura ambiente até o momento do disparo.

A marcação com DiI pode ser usada para corar neurônios em tecido cerebral de diversas espécies e idades, preservados por diversos métodos. Coloque fatias de cérebro, fixadas antes ou após o corte, nos poços de uma placa de 24 poços.

Lave as fatias em um XPB S3 três vezes, durante cinco a dez minutos por lavagem. Remova a PBS com pipeta e use um pincel para centralizar a fatia no poço. Coloque um pedaço de filtro de 3,0 micrômetros entre as duas telas metálicas de difusão na extremidade do revestimento do cano da pistola de genes.

Segure a pistola de genes de forma que a extremidade do revestimento do cano fique a 1,5 centímetro de distância da amostra. Dispare as microesferas na fatia com pressão de gás hélio entre 120 e 180 PSI. Lave rapidamente as fatias três vezes com um XPBS para remover o corante em excesso.

Certifique-se de manter a superfície do corte voltada para cima durante todas as etapas de manipulação de líquidos. Armazene os cortes em PBS por três a seis horas para permitir que o DAI se espalhe ao longo das dendrites, cobrindo com papel alumínio. Como o DAI é sensível à luz, os cortes podem ser montados nesta etapa ou submetidos a coloração adicional com anticorpos, conforme detalhado na próxima seção, para prosseguir com a coloração em 300 a 500 microlitros de solução de permeabilização contendo 0,01% TRITON X-100 em um XPBS por corte, incubando à temperatura ambiente por exatos 15 minutos.

Remova a solução de permeabilização dos poços e bloquee as fatias em uma solução contendo 10% de soro de cabra e 0,01% de Triton X-100 em PBS 1X, incubando à temperatura ambiente por 30 minutos. Adicione de 300 a 500 microlitros de anticorpo primário diluído na solução de bloqueio a cada poço e incube à temperatura ambiente por uma a duas horas ou durante a noite, dependendo do anticorpo. Lave as fatias três vezes com PBS 1X, por cinco a 15 minutos cada lavagem, e remova a solução do poço.

Adicione de 300 a 500 microlitros de anticorpo secundário diluído em solução bloqueadora a cada poço. Lave quatro vezes com um XPBS por cinco a 15 minutos cada lavagem, como antes. Monte as fatias em uma lâmina de vidro com meio de montagem fluorescente e cubra com uma lamínula de 18 por 18 milímetros. Deixe secar por seis a 12 horas à temperatura ambiente antes de selar as bordas com esmalte incolor e armazene no escuro ou coberto a quatro graus Celsius.

Imagens exemplares de seções cerebrais marcadas são mostradas aqui. Duas características importantes a serem observadas são um padrão de marcação esparsa em baixa magnificação e a capacidade de identificar componentes celulares individuais. A preparação incorreta das microbalas ou a fixação excessiva do tecido podem levar a uma marcação inadequada, como mostrado aqui.

São fornecidas dicas de solução de problemas no texto a seguir. Há uma imagem confocal de um neurônio espinhoso médio do TAL do cérebro de camundongo e seu padrão complexo de ramificação dendrítica. O seccionamento óptico obtido ao se utilizar microscopia confocal permite o isolamento de células individualmente marcadas na seção tecidual.

Imagens de alta ampliação mostram segmentos de dendritos de um cérebro de roedor e de um cérebro de primata não humano. Observe a alta intensidade da marcação fluorescente obtida com esta técnica, resultando em espinhos dendríticos bem definidos ao combinar ICS com marcação imunológica. Esta imagem mostra um exemplo de colocalização da marcação D eye em vermelho com imunomarcação para expressão de GFP em verde.

Esta imagem corresponde a um corte de sal de um camundongo transgênico que expressa a proteína fluorescente GFP sob o promotor do receptor de dopamina D1. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar projéteis e usar a pistola Jing para marcar esparsamente neurônios com corantes fluorescentes. Esta técnica permite a visualização clara da morfologia neuronal e o estudo da ramificação dendrítica e dos espinhos dendríticos.