Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

Nós demonstramos o uso da arma para introduzir gene corantes fluorescentes, como DII, em neurônios em fatias de cérebro de roedores e primatas não-humanos de diferentes idades. Neste caso particular, nós usamos camundongos adultos (3-6 meses de idade) e adultos macacos cynomologus (9-15 anos). Esta técnica, descrita originalmente pelo laboratório do Dr. Lichtman (Gan

Meu nome é Gail Siebel e sou pós-doutoranda no laboratório da Dra. Veronica Alvarez no Instituto Nacional de Abuso de Álcool e Alcoolismo. Este trabalho foi realizado em colaboração com a Dra. Kathleen Grant e Andrew Wow no Oregon Primate Center e o Dr. James Dene na Wake Forest University, que forneceram o tecido de primata não humano usado neste estudo. O objetivo da revisão deste procedimento é introduzir corantes fluorescentes nos neurônios e rotular seções cerebrais de diferentes espécies, como roedores e primatas de qualquer idade.

Com o objetivo de estudar a morfologia dos dendritos e espinhos dendríticos, isso é feito primeiro revestindo Ts e contas com um corante lipofílico, como o olho D. A segunda etapa do procedimento é forrar o tubo com contas revestidas com olho D e cortá-lo em pequenos pedaços que servem como balas para o sistema de pistola genética Helios. A terceira etapa do procedimento é atirar contas revestidas de olho D em fatias de cérebro usando a arma genética.

A etapa final do procedimento é opcional, pois a estilística pode ser combinada com a imunocoloração para localizar simultaneamente outros marcadores. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a marcação fluorescente esparsa de neurônios adequados para imagens de alta resolução, como microscopia confocal ou de dois fótons, e o estudo da ramificação dendrítica e da morfologia da coluna dendrítica. A principal vantagem dessa técnica sobre nossos métodos existentes é que a estilística pode ser aplicada a seções cerebrais de animais de todas as espécies, idades e genótipos.

Pode ser usado em combinação com imunocoloração e produz rotulagem fluorescente esparsa que é adequada para microscopia de alta resolução Antes de fazer balas. Cubra as contas de tungstênio com corante lipofílico em uma capela de exaustão química a 450 mililitros de cloreto de metileno a 13,5 miligramas de corante lipofílico para uma concentração final de 30 miligramas por mililitro. Pegue um tubo pré-Eloqua contendo 300 miligramas de grânulos de tungstênio e adicione 300 microlitros de tubo de cloreto de metileno vigorosamente para ressuspender os grânulos e fazer uma solução homogênea.

Apenas 100 miligramas de contas de tungstênio são usados por conjunto de balas pipetando para cima e para baixo para manter as contas ressuspensas, adicione 100 mililitros das contas e o olho da matriz dissolvida em uma lâmina de vidro e misture-os completamente. Com uma ponta de pipeta, deixe secar completamente ao ar até que as contas fiquem cinza claro. Coloque um pedaço limpo de papel branco encerado sob a lâmina usando uma lâmina de corrida limpa Para cada cor de bala, raspe as contas do vidro, deslize e corte-as em um pó fino.

Raspe as esferas revestidas em papel de soro de leite e canalize-as para um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione três mililitros de água e sonice no banho-maria por 10 a 30 minutos em temperatura ambiente para romper completamente os aglomerados. Corte 0,7 metros de tubo azul-petróleo com um ângulo em uma extremidade e conecte a outra extremidade a uma seringa de 12 mililitros usando um adaptador de tubo, coloque a extremidade livre em um tubo contendo 10 mililitros de uma solução de polivinil perona ou PVP de 10 miligramas por mililitro e puxe a solução completamente através do tubo e na seringa.

Vortex a solução de grânulos enquanto bombeia com a seringa para fazer uma mistura homogênea trabalhando rapidamente para evitar a precipitação dos grânulos, puxe a solução completamente para dentro da tubulação. Evite introduzir bolhas de ar, o que impedirá que as contas se prendam ao tubo naquele local enquanto mantém o tubo esticado em ambas as extremidades. Incline-o de um lado para o outro para uniformemente.

Distribua as contas. Alimente o tubo na estação de preparação e deixe os grânulos assentarem por 30 a 60 segundos. Use a seringa lentamente, mas suavemente.

Retire a água deixando as contas para trás. Desconecte imediatamente a seringa e comece a girar o tubo. Ajuste o fluxo de nitrogênio na estação de preparação para quatro a cinco LPM secos por 10 a 20 minutos até que as gotículas de água não sejam mais visíveis.

Remova o tubo da estação de preparação, corte as balas em comprimentos de 13 milímetros com o cortador de tubos observado e, em balas boas, haverá uma leve névoa cinza cobrindo uniformemente o interior. Coloque as balas em frascos de cintilação embrulhados em papel alumínio contendo um agente de secagem, como sulfato de cálcio anidro. Guarde-o em temperatura ambiente até que esteja pronto para fotografar.

A marcação Diic pode ser usada para corar neurônios em tecidos cerebrais de diversas espécies e idades e preservada usando vários métodos. Coloque fatias de cérebro que foram fixadas antes ou depois de cortar nos poços de um 24. Placa de poço.

Lave as fatias em um XPB S3 vezes por cinco a 10 minutos por lavagem. Pipete o PBS com um pincel para centralizar a fatia no poço. Coloque um pedaço de filtro de 3,0 micrômetros entre as duas telas de difusão de metal no final do revestimento do cano da arma genética.

Segure a pistola genética de forma que a extremidade do revestimento do cano fique a 1,5 centímetros de distância da amostra. Atire as contas na fatia com pressão de gás hélio de 120 a 180 PSI. Enxágue as fatias rapidamente três vezes com um XPBS para remover o corante extra.

Certifique-se de manter a superfície de injeção da fatia voltada para cima durante todas as etapas de manuseio de líquidos. Armazene as fatias em PBS por três a seis horas para permitir que o DAI se espalhe ao longo da cobertura de dendritos com papel alumínio. Como o dai é sensível à luz, as fatias podem ser montadas nesta fase ou submetidas a novas colorações com anticorpos, conforme detalhado na próxima seção, para prosseguir com a coloração a 300 a 500 microlitros de solução de permeação contendo 0,01% TRITTON X 100 em um XPBS para cada fatia, incubar em temperatura ambiente por exatamente 15 minutos.

Remova a solução de permeação dos poços, bloqueie as fatias em solução contendo 10% de soro de cabra e 0,01% de tritan X 100 em um XPBS, incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Adicione 300 a 500 microlitros de anticorpo primário diluído em solução de bloqueio a cada um. Bem, incube em temperatura ambiente por uma a duas horas ou durante a noite, dependendo das fatias de lavagem de anticorpos três vezes com um XPBS por cinco a 15 minutos cada lavagem, remova a solução do poço.

Adicione 300 a 500 microlitros de anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio a cada um. Lave bem quatro vezes com um XPBS por cinco a 15 minutos cada lavagem como antes, monte as fatias em uma lâmina de vidro com meio de montagem fluorescente e cubra com um 18 por 18 milímetros. A lamínula deixa secar por seis a 12 horas em temperatura ambiente antes de selar as bordas com esmalte transparente armazenado no escuro ou coberto a quatro graus Celsius.

Imagens exemplares de seções cerebrais marcadas são mostradas aqui. Duas características importantes a serem observadas são um padrão de marcação esparso em baixa ampliação e a capacidade de identificar componentes celulares individuais. A preparação incorreta das balas ou a fixação excessiva do tecido podem levar a uma rotulagem incorreta, conforme mostrado aqui.

Dicas de solução de problemas são fornecidas no texto aqui. Há uma imagem confocal de um neurônio médio spingonal TAL do cérebro de camundongo e seu padrão complexo de ramificação dendrítica. O corte óptico obtido ao usar a microscopia confocal permite o isolamento de células marcadas únicas na seção do tecido.

Imagens de alta ampliação mostram segmentos de dendritos de um cérebro de roedor e de um cérebro de primata não humano. Observe a alta intensidade da coloração fluorescente alcançada com esta técnica, resultando em espinhas dendríticas bem definidas ao combinar ICS com imunocoloração. Esta imagem mostra um exemplo de colocalização da marcação do olho D em vermelho com imunocoloração para expressão de GFP em verde.

Esta imagem corresponde a uma fatia de sal de um camundongo transgênico expressando a proteína fluorescente GFP sob o promotor do receptor de dopamina D one. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar balas e usar a arma Jing para neurônios escassamente responsáveis com corantes fluorescentes. Esta técnica permite a visualização clara da morfologia neuronal e o estudo da ramificação dite e espinhos.