Integração de genes direcionados mediada por TALEN: usando nucleases específicas de sequência projetadas para a inserção precisa do gene da proteína fluorescente em hiPSCs

Comece com células-tronco pluripotentes induzidas por humanos ou suspensão de hiPSC em meio. Adicione um par de nuclease efetora semelhante a um ativador de transcrição ou plasmídeos codificadores de TALEN. Suplemento com um plasmídeo doador contendo um gene de proteína fluorescente, acoplado a um gene de resistência a antibióticos, com braços de homologia adjacentes para alinhamento específico aos loci alvo.

Eletroporar a mistura para gerar poros transitórios nas membranas celulares, permitindo a internalização do plasmídeo. Uma vez dentro das células, os plasmídeos codificadores de TALEN são processados, produzindo TALENs - proteínas quiméricas compostas por um domínio de ligação ao DNA TALE específico do local fundido a um domínio de clivagem de endonuclease de restrição FokI não específico.

Cada monômero TALEN por meio de seu domínio de ligação ao DNA - compreendendo módulos de repetição de aminoácidos em tandem - reconhece e se liga a loci alvo, um módulo por nucleotídeo, em cada fita de DNA em orientações opostas, separadas por uma sequência espaçadora. Os domínios FokI então dimerizam e clivam o DNA dentro da sequência espaçadora, criando quebras de fita dupla com saliências.

Na presença de plasmídeo doador contendo braços de homologia complementares às regiões que flanqueiam o local clivado, o reparo dirigido por homologia ocorre utilizando a sequência homóloga como modelo para a síntese de reparo de DNA para preencher as quebras de fita dupla. Após a ligação dos cortes, a proteína fluorescente intermediária e os genes de resistência a antibióticos são integrados ao genoma do hospedeiro.

Trate os hiPSCs, semeados em uma camada de células alimentadoras para apoiar o crescimento, com meios contendo antibióticos. O gene de resistência a antibióticos sem promotor - impulsionado por um promotor endógeno a montante - facilita a seleção de células editadas por TALEN.