Edição de genes mediada por transposon PiggyBac em iPSCs humanas: um procedimento para integrar gene de interesse em iPSCs humanas usando o sistema de transposon PiggyBac

Enxágue a cultura de iPSC humana com PBS livre de cálcio e magnésio, antes de tratar as células com reagente de dissociação celular por 5 a 10 minutos a 37 graus Celsius. Quando as células começarem a se desprender do recipiente de cultura, use uma pipeta P1000 para dissociar manualmente as células 3 a 4 vezes.

Transfira as células para um tubo de 15 mililitros e aumente o volume final para 10 mililitros com PBS fresco sem cálcio e magnésio, para contagem. Colete 1 x 10⁶ células por centrifugação e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão R do kit de eletroporação.

Adicione 4,5 microgramas de DNA de plasmídeo vetorial transponível e 0,5 microgramas do DNA do plasmídeo de transposase PiggyBac para transfecção. Transfecção com o sistema de eletroporação celular de acordo com as instruções do fabricante, com os parâmetros indicados. Então. semear as células em meio iPSC humano suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolares Y-27632 em um prato revestido com matriz de 6 milímetros.