Reação em cadeia da polimerase quantitativa para enumerar bacteriófagos

Para enumerar bacteriófagos por meio de reação em cadeia da polimerase quantitativa, qPCR, obtenha um coquetel de reação qPCR contendo Taq DNA polimerase, primers, trifosfatos de desoxinucleotídeos - dNTPs - e moléculas de corante repórter fluorescente em um tampão otimizado. Transfira para os poços de uma placa qPCR.

Adicione bacteriófagos tratados termicamente. O tratamento térmico libera DNA de bacteriófagos de partículas de bacteriófagos. Sele a placa, evitando a evaporação da mistura. Carregue a placa no sistema qPCR, definindo as condições de ciclo apropriadas.

O aquecimento a altas temperaturas desnatura o DNA de fita dupla em fitas simples. Também ativa a Taq DNA polimerase. O recozimento faz com que os primers específicos da sequência se liguem às fitas complementares de DNA do bacteriófago. A extensão permite que a Taq DNA polimerase ativada adicione dNTPs à extremidade 3' do primer, estendendo a fita de DNA em crescimento na direção 5' a 3'.

As moléculas de corante se intercalam no DNA de fita dupla recém-sintetizado, causando aumento da intensidade de fluorescência. Cada ciclo de PCR dobra a quantidade de DNA alvo, aumentando a intensidade da fluorescência.

Determine o valor do ciclo limiar, Ct, no qual a fluorescência medida excede o nível de fundo.

O valor de Ct está inversamente relacionado à quantidade inicial de DNA, com cada genoma de bacteriófago equivalente a uma partícula de bacteriófago, facilitando a quantificação do bacteriófago a partir da curva padrão do DNA do bacteriófago.

Pós-amplificação, realizar análise da curva de fusão, aumentando gradativamente a temperatura da reação. A uma temperatura de fusão específica, metade do DNA se separa em fitas simples, liberando moléculas de corante e causando diminuição repentina da fluorescência.

Uma temperatura de fusão distinta, exclusiva para o produto qPCR, valida a especificidade do produto.